-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biofunktionalisierung einer
Substratoberfläche, bei dem die Substratoberfläche
einer Hochfrequenz-Niederdruckplasma-Behandlung mit Ammoniak und
wenigstens einem volatilen Diamin als Arbeitsgasen unterworfen wird.
-
Die
Erfindung betrifft weiter ein entsprechendes Substrat sowie ein
Substrat mit einer durch Aminierung biofunktionalisierten Substratoberfläche,
auf der eine erste Schicht aus Aminen und/oder Amiden aufgebracht
ist.
-
Gattungsgemäße
Verfahren und Substrate sind bekannt aus der
US 5,112,736 . Diese Druckschrift offenbart
die Modifizierung der Oberfläche einer nicht-aromatischen,
mikroporösen Polymermembran zum Zwecke der verbesserten
Anhaftung von DNA-Fragmenten. Allerdings ist die gezielte Beeinflussung
der Adhäsivität von Oberflächen gegenüber biologischem
Material im Allgemeinen wie z. B. Zellen, Antikörpern etc.
durch Aminierung mittels Plasmabeschichtung auch für andere
Anwendungsfälle bekannt.
-
Das
Prinzip der Hochfrequenz-Niederdruckplasma-Beschichtung basiert
auf einer starken Anregung, insbesondere Ionisierung von Molekülen
eines Arbeitsgases in der Nachbarschaft zu der zu modifizierenden
Substratoberfläche. Aufgrund der hoch angeregten Zustände
der Arbeitsgasmoleküle können diese oder ihre
Spaltprodukte mit Oberflächenstrukturen oder -molekülen
der Substratoberfläche Wechselwirken, insbesondere binden,
vorzugsweise kovalent binden. Zur Behandlung wird zunächst
eine das Substrat enthaltende Vakuumkammer weitgehend, d. h. vorzugsweise
bis in den Hochvakuum- oder Ultrahochvakuumbereich evakuiert. Der
Evakuierungsgrad hängt jeweils von dem konkreten Anwendungsfall
ab und kann vom Fachmann in Ansehung der im Einzelfall vorliegenden
Erfordernisse gewählt werden. Nach der Evakuierung wird
ein dem Einzelfall angemessenes Arbeitsgas in einem sehr geringen, wohldefinierten
Strom durch die Kammer geleitet. Gleichzeitig wird ein hochfrequentes
elektrisches Feld hoher Feldstärke angelegt. Typische Frequenzbereiche
hierfür sind der Funkfrequenzbereich, der Mikrowellenbereich
und der Gigahertzwellenbereich. Die molekulare Anregung des Arbeitsgases
erfolgt durch Ionisierung der Gasmoleküle im elektrischen Feld.
-
Die
vorgenannte
US 5,112,736 schlägt
die Verwendung von Ammoniak oder niedermolekularer aliphatischer
oder zyklischer Amine, wie beispielsweise Methylamin, Allylamin,
Ethylendiamin, Diaminzyklohexan jeweils einzeln oder in Mischungen
als Arbeitsgas vor. Unterschiedliche Anwendungsfälle oder
Wirkungen der unterschiedlichen Gase oder Gasgemische offenbart
die genannte Druckschrift nicht. Vielmehr wird ein einheitlicher,
chemischer Wirkungsmechanismus offenbart, der die Gaswahl beliebig
und die Gase und Gasmischungen frei austauschbar erscheinen lässt.
Nach dem in der genannten Druckschrift vermuteten Mechanismus bindet eine
aus dem Arbeitsgas abgespaltene Aminogruppe (NH
2)
mit einem ungesättigten Kohlenstoffatom der Substratoberfläche.
An diesen Aminogruppen soll lt. der genannten Druckschrift bei der
Anwendung des oberflächenmodifizierten Substrates eine
Anhaftung von DNA-Fragmenten erfolgen.
-
Es
ist, wie bereits erwähnt, bekannt, dass auch andere biologische
Strukturen nach Aminierung von Substratoberflächen besser
an diesen anhaften. Dies gilt nicht nur für die in der
vorgenannten Druckschrift ausdrücklich erwähnten
mikroporösen Membranen, sondern auch für glatte
Oberflächen aus polymerem Material, wie beispielsweise
Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polytetrafluorethylen, etc. Analoges
gilt auch für Oberflächen aus Glas oder Keramik.
In allen bekannten Fällen werden Ammoniak, volatile Diamine
und Mischungen daraus als untereinander äquivalente und
beliebig austauschbare Arbeitsgase angesehen.
-
Das
Prinzip der Plasmabeschichtung verlangt zwar nach einer vergleichsweise
aufwendigen apparativen Grundausstattung; es ist jedoch in den meisten
Fällen den ebenfalls bekannten nasschemischen Aminierungsverfahren,
insbesondere auch aus Gründen der Umweltfreundlichkeit
vorzuziehen.
-
Alle
bekannten Verfahren lassen den Wunsch nach einer noch besseren Anhaftung
biologischen Materials an der Substratoberfläche offen.
-
Es
ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Substrat und
ein Verfahren zu dessen Herstellung zur Verfügung zu stellen,
bei dem die Anhaftung biologischen Materials an der Substratoberfläche
verbessert wird.
-
Diese
Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von
Anspruch 1 dadurch gelöst, dass die Plasmabehandlung in
zwei separaten Stufen erfolgt, wobei in einer ersten Stufe eine
Aminierung der Substratoberfläche durch eine Hochfrequenz-Niederdruckplasma-Behandlung
mit Ammoniak als Arbeitsgas erfolgt und in einer zweiten Stufe eine
Hochfrequenz-Niederdruckplasma-Behandlung der aminierten Substratoberfläche
mit einem ein volatiles Diamin enthaltenden Arbeitsgas erfolgt.
-
Die
Aufgabe wird weiter durch ein Substrat mit den Merkmalen von Anspruch
10, d. h. von einem erfindungsgemäß hergestellten
Substrat gelöst.
-
Die
Aufgabe wird schließlich in Verbindung mit den Merkmalen
des Oberbegriffs von Anspruch 11 dadurch gelöst, dass über
der ersten Schicht und kovalent mit dieser gebunden eine zweite
Schicht aus Spaltprodukten eines volatilen Diamins angeordnet ist.
-
Vorteilhafte
Ausführungsformen und Weiterbildungen der vorliegenden
Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen dargestellt.
-
Der
Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die Plasma-Aminierung
mit Ammoniak als Arbeitsgas keineswegs, wie im Stand der Technik
angenommen, äquivalent zu einer Plasma-Aminierung mit einem
volatilen Diamin als Arbeitsgas ist. Aufbauend auf dieser Erkenntnis
schlägt die Erfindung vor, Substratoberflächen
in einem zweistufigen Verfahren zu beschichten. Die erste Beschichtungsstufe
erfolgt dabei durch Plasma-Aminierung mit Ammoniak als Arbeitsgas.
Erst nach Abschluss dieser ersten Beschichtungsstufe oder mit höchstens
geringfügiger zeitlicher Überlappung wird eine
zweite Plasmabeschichtungsstufe durchgeführt, wobei das
in der zweiten Stufe verwendete Arbeitsgas ein volatiles Diamin
enthält. Es handelt sich dabei vorzugsweise um ein niedermolekulares
Diamin, wie beispielsweise Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin
oder eine Mischung daraus. Grundsätzlich ist zwar auch die
Verwendung höhermolekularer Diamine möglich; dies
kann jedoch in der Praxis zu Schwierigkeiten führen, da
derartige Stoffe nur schwer verdampfbar sind und sich häufig
ein wachsartiger Niederschlag auf den Oberflächen der Vakuumkammer
bildet, die dann mit hohem Aufwand gereinigt werden müssen.
-
Der
Vorteil der erfindungsgemäßen, zweistufigen Beschichtung
gegenüber der bekannten Plasma-Aminierung ist eine deutliche
Verbesserung der Adhäsivität der behandelten Substratoberflächen
für biologisches Material. Diese Verbesserung wirkt sich insbesondere
im Fall des Anwachsens von Zellen an den behandelten Substratoberflächen
aus, da hier, im Gegensatz zu der aus dem Stand der Technik bekannten
Anhaftung von DNA-Fragmenten an den Substratoberflächen,
eine hochwirksame, großflächige Adhäsivität
der Substratoberflächen erforderlich ist.
-
Ein
Erklärungsversuch für diese überraschende
Wirkung liegt in einem neuen Verständnis der molekularen
Prozesse an der Substratoberfläche. Bislang ging man davon
aus, dass, wie oben bereits erläutert, die Aminierung im
Wesentlichen durch die Kopplung von im Plasma abgespaltenen Aminogruppen
mit ungesättigten Kohlenstoffatomen der Substratoberfläche
erfolgt. Diese Annahme scheint für die Plasma-Aminierung
mit Ammoniak als Arbeitsgas auch zutreffend zu sein und wird in
der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens
genutzt. Bei der Plasma-Aminierung mit volatilen Diaminen scheint
jedoch ein anderer Reaktionsmechanismus zu wirken. Es wird angenommen,
dass im Plasma keine reinen Aminogruppen abgespalten werden, sondern
dass die Diamine vielmehr zwischen zweien ihrer C-Atome aufgespalten
werden. Im Fall der Verwendung von Ethylendiamin beispielsweise
würde dies zur Bildung von Methylamin im Plasma führen. Dieses
muss nicht weiter aufgespalten werden. Vielmehr scheint bei der
zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens
das Kohlenstoffatom eines Methylamins mit den Stickstoffmolekülen
aus der vorangehenden Plasma-Aminierung mit Ammoniak zu binden,
sodass die Aminogruppen der Methylamine anhaftendem biologischem
Material als Kopplungsstellen präsentiert werden. Dies
führt also zu einer deutlichen Erhöhung der Anzahl
der potenziellen Bindungsstellen und scheint zudem aufgrund der
dichteren Packung zu einer geordneteren Ausrichtung der präsentierten
Aminogruppen zu führen. Beide Effekte bewirken eine deutliche
Verbesserung der Anhaftung biologischen Materials bzw. eine Verbesserung
der Adhäsivität der Substratoberfläche.
-
Um
das Potenzial der vorliegenden Erfindung möglichst umfassend
auszunutzen, wird bevorzugt, dass das Arbeitsgas der zweiten Verfahrenstufe aus
verdampftem Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin oder einer
Mischung daraus besteht. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass
das Arbeitsgas im Wesentlichen aus reinen Diaminen bzw. einer reinen
Diaminmischung besteht. Die Zugabe beispielsweise von Ammoniak sollte
in der zweiten Verfahrensstufe vorzugsweise unterbleiben. Auch die Beimischung
inerten Trägergases, wie beispielsweise Argon hat sich
als eher ungünstig erwiesen.
-
Bei
einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
hat sich jedoch gezeigt, dass die erfindungsgemäße
Adhäsivitätsverbesserung auch erreicht werden
kann, wenn das Arbeitsgas der zweiten Verfahrensstufe aus einer
Mischung von Ethylendiamin und Ethylenglykol besteht. Hierzu werden
bevorzugt beide Stoffe in flüssigem Zustand gemischt und
gemeinsam verdampft. Das bevorzugte Mischungsverhältnis
von Ethylendiamin zu Ethylenglykol in flüssigem Zustand
liegt im Bereich von 1:1 bis 1:4.
-
Bei
einer Weiterbildung der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass
das Arbeitsgas der zweiten Verfahrensstufe mit Peptiden als Dotierungsmittel
dotiert ist. Unter Dotierung wird im Rahmen dieser Beschreibung
eine gezielte, geringfügige Verunreinigung des Arbeitsgases
mit ausgewählten Substanzen verstanden. Im Fall der Peptide
liegt die bevorzugte Konzentration des Dotierungsmittels im Bereich
von einigen Nanogramm/Milliliter bis zu einigen Mikrogramm/Milliliter,
jeweils bezogen auf die Mischung des Dotierungsmittels mit einer
bei Verdampfung das Arbeitsgas freisetzenden Flüssigkeit.
In der Praxis wird tatsächlich bevorzugt eine dotierte
Flüssigkeit hergestellt und im Rahmen der Plasmabeschichtung
verdampft.
-
Beispiele
für Dotierungspeptide sind Arginin-Glycin-Aspartat (RGD),
Arginin-Glycin-Aspartat-Serin (RGDS), Arginin-Glutamat-Aspartat-Valin (RDEV),
Tyrosin-Isoleucin-Glycin-Serin-Aspartat (YIGSR), Isoleucin-Lysin-Valin-Alanin-Valin
(IKVAV) und andere. Die Wechselwirkung solcher Peptide, insbesondere
mit Komponenten von Zelloberflächen, sind dem Fachmann
bekannt. Eine geeignet gewählte Dotierung kann, je nach
Anwendungsfall, die Adhäsivität der behandelten
Substratoberfläche gezielt und selektiv beeinflussen, z.
B. verstärken oder abschwächen.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können
alternativ oder zusätzlich sogenannte Wachstumsfaktoren
als Dotierungsmittel des Arbeitsgases der zweiten Verfahrensstufe
eingesetzt werden. Als Wachstumsfaktoren werden allgemein Proteine
bezeichnet, die als Signale von einer Zelle auf eine zweite übertragen
werden und damit Informationen weiterleiten. Diese Proteine können,
eingebettet in die Beschichtung einer erfindungsgemäß behandelten
Substratoberfläche ebenfalls zur gezielten und selektiven
Beeinflussung der Adhäsivität beitragen. Als Beispiele genannt
seien EGF (epithelial growth factor), NGF (nerve growth factor),
HGF (hepatocyte growth factor), usw. Die Dotierungskonzentration
der Wachstumsfaktoren liegt bevorzugt im Bereich von einigen Pikogramm/Milliliter
bis Nanogramm/Milliliter, bezogen auf die flüssige Mischung.
-
Neben
dem erfindungsgemäßen Verfahren bezieht sich die
vorliegende Erfindung auch auf Substrate mit einer erfindungsgemäß biofunktionalisierten
Substratoberfläche.
-
Auf
molekularer Ebene zeichnet sich eine solche Substratoberfläche
dadurch aus, dass auf ihr eine erste Schicht aus Aminen und/oder
Amiden, insbesondere aus im Wesentlichen reinen Aminogruppen aufgebracht
ist und dass über der ersten Schicht und kovalent mit dieser
gebunden eine zweite Schicht aus Spaltprodukten eines volatilen
Diamins angeordnet ist, insbesondere eine Schicht aus Methylaminen,
die mit ihren Kohlenstoffatomen an die Stickstoffatome der ersten
Aminierungsschicht binden. Bevorzugte Einsatzbereiche derart biofunktionalisierter
Substratoberflächen sind beispielsweise Trogböden
von sogenannten Multiwell- oder Mikrotiterplatten, Schalenböden
von Zellkulturgefäßen und Oberflächen
von Trägern mobiler Affinitätsbindungs-Assays.
Ein weiterer Anwendungsbereich betrifft die Implantationsmedizin.
Bei erfindungsgemäßer Beschichtung der Oberflächen
medizinischer Implantate kann eine deutliche Verbesserung des Anwachsens
von Zellen erreicht werden, wobei durch gezielte Mustergebung bei
der Plasmabeschichtung eine Strukturierung der Anwachsungsfläche
erreicht werden kann.
-
Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden,
speziellen Beschreibung sowie den Zeichnungen.
-
Es
zeigt
-
1 eine
schematische Darstellung der beiden Stufen des erfindungsgemäßen
Beschichtungsverfahrens.
-
Die
einzige Figur, 1, zeigt in einer stark schematisierten
Darstellung die beiden Stufen des erfindungsgemäßen
Beschichtungsverfahrens. In einer nicht näher dargestellten
Vakuumkammer, die bis auf einen sehr niedrigen Restdruck, der vorzugsweise
im Bereich des Hochvakuums oder Ultrahochvakuums liegt, evakuiert
ist, ist ein nicht näher spezifiziertes Substrat 10 angeordnet.
Typischerweise ist eine Vielzahl von gleich beschaffenen Substraten
auf Böden der Vakuumkammer angeordnet. Als mögliche
Substrate 10 kommen beispielsweise Mikrotiterplatten, sonstige
Zellkulturgefäße, Träger für
mobile Affinitätsbindungs-Assays, wie beispielsweise Kunststoffträger
für Immuno-Assays, oder medizinische Implantate in Frage.
Auch ist es möglich, jeweils nur Teile solcher Gegenstände
als Substrate dem erfindungsgemäßen Verfahren
zu unterwerfen. Als ein Beispiel sei eine Glas- oder Kunststoffplatte
oder -folie genannt, die in einem nachfolgenden Verfahrensschritt
z. B. als eine Bodenplatte mit einem Formkörper zur Bildung
eines Kultur- oder Probengefäßes verbunden wird.
Auch ist es möglich, das Substrat bereichsweise zu maskieren,
um eine strukturierte Beschichtung zu erreichen, oder ein erfindungsgemäß beschichtetes
Substrat nachträglich zu mustern oder zu strukturieren.
-
Oberhalb
und unterhalb des Substrates 10 sind Elektroden 12a und 12b angeordnet,
die mit einer Hochfrequenz-Spannungsquelle 14 verbunden sind.
Die Hochfrequenz-Spannungsquelle arbeitet vorzugsweise im Funkfrequenz-,
Mikrowellen- oder Gigahertzwellenbereich. Typische Spannungswerte liegen
bei mehreren 100 bis einigen 1000 Volt. Bei hinreichend geringem
Abstand der Elektroden 12a und 12b zueinander
entwickelt sich ein hohes elektrisches Feld über dem Substrat 10.
-
In
einem ersten Verfahrenschritt, der in Teilfigur a) von 1 illustriert
ist, wird über ein steuerbares Ventil 16 Ammoniak
mit sehr geringem Fluss durch die Vakuumkammer und insbesondere
durch den Bereich des elektrischen Feldes über dem Substrat 10 geleitet.
Aufgrund des hohen elektrischen Feldes werden die Ammoniak-Moleküle
ionisiert, sodass ihre Stickstoffatome kovalente Bindungen mit ungesättigten
Kohlenstoffatomen der Substratoberfläche eingehen können.
Auf diese Weise kommt es zu einer ersten Aminierung 18 auf
der Oberfläche des Substrates 10. Diese Aminierung
besteht überwiegend aus Aminen, kann jedoch auch Amide
umfassen, falls eine hinreichende Menge Sauerstoff in der Vakuumkammer
verblieben ist, mit dem Ammoniak eingeleitet wird oder aus der Substratoberfläche
gelöst wird. Die Aminierungsschicht 18 präsentiert
Stoffen, die sich der Substratoberfläche nähern,
Aminogruppen in relativ geringer Dichte und vergleichsweise ungeordneter
Ausrichtung.
-
In
einer zweiten Verfahrensstufe, die in Teilfigur b) von 1 illustriert,
wird nach der Aminierung 18 statt des Ammoniak-Gases ein
volatiles Diamin über ein steuerbares Ventil 20 durch
die Vakuumkammer und insbesondere durch das elektrische Feld oberhalb
des Substrates 10 geleitet. Bei der dargestellten Ausführungsform
ist Ethylendiamin, EDA, als Arbeitsgas dargestellt. Durch das hohe
elektrische Feld werden die EDA-Moleküle, wie anhand einer
schematischen Strukturformel in 1b dargestellt,
jeweils in zwei ionisierte Methylamin-Moleküle gespalten.
Diese Spaltprodukte binden jeweils kovalent mit den Stickstoffmolekülen,
die von der ersten Aminierungsschicht 18 auf der Oberfläche
des Substrates 10 präsentiert werden. Auf diese
Weise entsteht eine zweite Aminierungsschicht 22. Auch
die Schicht 22 präsentiert einem biologischen
Material, das bei Gebrauch des erfindungsgemäß präparierten Substrates
an der Substratoberfläche anhaften soll, Aminogruppen.
Diese sind jedoch deutlich dichter und geordneter ausgerichtet,
als Aminogruppen der ersten Aminierungsschicht 18. Dies
führt zu einer deutlichen Verbesserung der Adhäsivität
der präparierten Substratoberfläche.
-
In 1 nicht
dargestellt sind Weiterbildungen der Erfindung, bei denen das Arbeitsgas
der zweiten Arbeitsstufe, d. h. das volatile Diamin, mit bestimmten
Dotierungsmitteln, wie beispielsweise Peptiden oder Wachstumshormonen,
dotiert ist. Im Dotierungsfall werden Moleküle des Dotierungsmittels
in die zweite Aminierungsschicht 22 oder durch direkten
Kontakt mit der Oberfläche des Substrates 10 in die
erste Aminierungsschicht 18 eingebaut. Je nach der speziellen
biochemischen Wirkung der Dotierungsmittel kann die Adhäsivität
des resultierenden Substrates 10 hierdurch spezifisch modifiziert
werden.
-
Natürlich
stellen die in der speziellen Beschreibung diskutierten und in der
Zeichnung gezeigten Ausführungsformen nur illustrative
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung dar. Im
Lichte der hier offenbarten Lehre ist dem Fachmann ein breites Spektrum
an Variationsmöglichkeit anhand gegeben. Insbesondere kann
die Beschaffenheit des Arbeitsgases der zweiten Verfahrensstufe,
d. h. insbesondere die Wahl des verwendeten Diamins oder der verwendeten
Diamine, an den Einzelfall angepasst werden. Auch bei der Wahl eventueller
Dotierungsmittel kann der Fachmann seine Wahl in Ansehung der konkreten
Zielsetzung treffen. Selbstverständlich ist die Wahl spezieller
Verfahrensparameter, wie z. B. die Frequenz und Feldstärke
des zur Plasmabildung verwendeten elektrischen Feldes, der Restdruck
in der Vakuumkammer, die Flussmenge und Flussgeschwindigkeit des
Arbeitsgases und die Temperatur in der Vakuumkammer ebenfalls der
Zielsetzung im Einzelfall anzupassen und kann vom Fachmann aufgrund
seiner Erfahrungen und einfacher Versuche leicht getroffen werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 5112736 [0003, 0005]