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Gegenstand
der Erfindung ist ein Blood-pool Kontrastmittel und ein Röntgenkontrastmittel
für die Röntgendiagnostik auf der Basis von oberflächenbeschichteten
Nanopartikeln aus Bariumsulfat.
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Für
die klinische angiographische CT-Diagnostik sind derzeit keine makromolekularen
CT-Kontrastmittel vorhanden.
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Angiographien
werden daher in der klinischen Routine durch niedermolekulare, jodhaltige Kontrastmittel
in einer arteriellen Phase durchgeführt (Fleischmann,
D., Use of high concentration contrast media: principles and rationale-vascular
district. European Journal of Radiology, 2003. 45: S. 88–93). Hierbei
steht nur ein sehr enges Zeitfenster für die Untersuchung
zur Verfügung und der Kontrast zwischen kleinen Gefäßen
und dem Interstitium wird durch Kontrastmittelextravasation verschmiert.
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Handelsübliches
Bariumsulfat wird derzeit nur zur Darmdiagnostik eingesetzt (Rex,
D. K., et al., Relative sensitivity of colonoscopy and barium enema
for detection of colorectal cancer in clinical practice. Gastroenterology,
1997. 112(1): S. 17–23). Die i. v. Applikation
ist nicht möglich und letal für das Individuum.
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In
der präklinischen Forschung und Kleintierbildgebung werden
zur Gefäßdarstellung häufig nicht bioverträgliche
Kontrastmittel im Letalversuch eingesetzt, beispielsweise freies
Bariumsulfat (Maehara, N., Experimental microcomputed tomography
study of the 3D microangioarchitecture of tumors. Eur Radiol, 2003.
13(7): S. 1559–65). Alternativ stehen kommerziell
Blood-pool Kontrastmittel zur Verfügung, die auf komplexen
Strukturen basieren (z. B. in Liposomen eingeschlossene Jodverbindungen
(Badea, C. T., et al., 4-D micro-CT of the mouse heart.
Mol Imaging, 2005. 4(2): S. 110–6)).
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Nanopartikel,
deren röntgenabsorbierender Anteil auf Bismutsulfid (Rabin,
O., et al., An X-ray computed tomography imaging agent based an long-circulating
bismuth sulphide nanoparticles. Nat Mater, 2006. 5(2): S. 118–22)
und Gold (Hainfeld, J. F., et al., Gold nanoparticles: a
new X-ray contrast agent. British Journal of Radiology, 2006. 79(939):
S. 248) basiert, wurden als Röntgenkontrastmittel
in präklinischen Studien beschrieben. Nanopartikel auf Basis
von Bismutsulfid können herstellungsbedingt eine gewisse
Mindestgröße nicht unterschreiten. Sie sind somit
in ihrem Einsatzbereich limitiert.
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Freies
Bariumsulfat als Kontrastmittel für Röntgenstrahlen
befindet sich seit langer Zeit in der klinischen Routineanwendung
(
JP 50037255 B4 ). Bariumsulfatnanopartikel
wurden auch als röntgenstrahlenabsorbierende Harzverbindung
in einem Patent erwähnt (
CN 1438276 A ). Bariumsulfatnanopartikel in
Zusammenhang mit medizinischer Röntgenbildgebung sind jedoch
nicht bekannt.
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Es
gibt jedoch keine klinischen Blood-pool CT-Kontrastmittel. Die Zirkulationszeit
von derzeit verwendeten niedermolekularen Jodkontrastmitteln beträgt
lediglich wenige Sekunden.
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Experimentelle
jodhaltige Blood-pool Kontrastmittel sind im Kontrastverhalten nicht
zufriedenstellend, da deren maximaler Jodgehalt aus Viskositätsgründen
limitiert ist.
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Bisherige
CT-Kontrastmittel markieren nur unspezifisch. Es gibt keine makromolekularen CT-Kontrastmittel,
die unterschiedliche Gefäßdurchlässigkeiten
(beispielsweise in Tumoren) differenzieren können. Weiterhin
durchlaufen die bekannten CT-Kontrastmittel einen einheitlichen
Metabolisierungsweg, womit die selektive Darstellung von Leber, Lymphknoten
oder retikuloendothelialem System nicht möglich ist.
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Bariumsulfat
ist bekanntermaßen schwer löslich in wässrigen
Medien. Es wird vielfach bei extravasalen Anwendungen verwendet
und ist aufgrund der niedrigen Löslichkeit bei Anwendung
im Magen-Darm-Kanal nicht toxisch.
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Aufgrund
der schlechten Löslichkeit in wässrigen Medien
gilt freies Bariumsulfat bei extravaskulären Anwendungen
(Magen-Darm-Passage) als nicht toxisch. Kommt es jedoch zu geringsten
Intravasationen oder zu einem Eintritt in das Peritoneum, so kann
die freie Bariumsulfatsuspension lebensbedrohliche Krankheitsbilder
(Lungenembolie, Herzinfarkt, granulomatöse Entzündung)
auslösen.
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Allergische
Reaktionen werden bei jodhaltigen Kontrastmitteln relativ häufig
beobachtet.
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Jodhaltige
Kontrastmittel können mit dem Jodhaushalt der Schilddrüse
interagieren. Lebensbedrohliche Komplikationen sind bekannt.
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Die
beschriebenen Bismutsulfidnanopartikel sind herstellungsbedingt
in ihrer minimalen Größe stärker limitiert
als Bariumsulfat-Nanopartikel. Eine höhere Größenvariabilität
erhöht die Flexibilität der Kontrastmittelplattform
und kann zur der Beantwortung unterschiedlicher, diagnostischer
Fragestellungen beitragen.
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Bei
Metabolisierung sind Nanopartikel, die auf Gold und Bismutsulfid
basieren, sehr toxisch.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Blood-pool Kontrastmittels, insbesondere in der Bereitstellung
einer flexiblen Kontrastmittelplattform, die durch variable Größen
oder Oberflächenveränderungen unterschiedliche
Metabolisierungswege beschreiben kann (Darstellung von Leber, Lymphknoten
und des retikuloendothelialen Systems) oder unterschiedliche Gewebespezifität
erhält.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines stärker
röntgenabsorbierenden Kontrastmittels, sowie die Entwicklung
einer Darreichungsform von Bariumsulfat-Nanopartikeln für
Gefäß- und Magen-Darm-Untersuchungen, die weniger toxische
Eigenschaften als Bariumsulfat aufweist welches sich nicht in einer
definierten Größenverteilung im Nano-Maßstab
befindet und die Entwicklung einer Kontrastmittelplattform, die
weniger oder keine Nephrotoxizität aufweist und nicht in
den Schilddrüsenhormonhaushalt eingreift.
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Die
vorgenannten Aufgaben werden in einer ersten Ausführungsform
gelöst durch oberflächenbeschichtete Nanopartikel
auf der Basis von Bariumsulfat.
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Durch
eine Beschichtung, beispielsweise mit Pyridin, Silikat, Silanen,
(Carbo-)Dextran, Citrat oder PEG werden die Partikel im Nanozustand
stabilisiert und die Biokompatibilität erhöht.
Darauf aufbauend kann die Oberfläche weiter funktionalisiert
werden, um die Pharmakokinetik zu modifizieren. Durch Bindung spezifischer
Liganden können molekulare Zielstrukturen mit CT erfasst
werden.
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Eine
weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren
zur Herstellung von oberflächenbeschichteten Nanopartikeln
aus Bariumsulfat, dadurch gekennzeichnet, dass man Bariumsalz in
einer nichtwässrigen Umgebung mit einem reaktionsfähigen
Sulfat in Anwesenheit eines oberflächenbeschichtungsbildenden
Mittels in Kontakt bringt und das ausgefällte Bariumsulfat
in nichtwässriger Umgebung aufarbeitet.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reaktion in
Ethylenglykol, Diethylenglykol oder damit verwandten Lösungsmitteln
oder Lösungsmittelgemischen durchgeführt. Die
Aufarbeitung kann beispielsweise in Methanol oder anderen Alkoholen, Ethern
oder Estern durchgeführt werden.
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Die
Verwendung als Röntgenkontrastmittel mittels Projektionsradiographie
und Computertomographie wurden intensiv erprobt. Dabei wurde festgestellt,
dass die erfindungsgemäßen Bariumsulfat-Nanopartikel
insbesondere mit einer Partikelgröße von 1 bis
100 nm als Röntgenkontrastmittel geeignet sind und über
die gleich guten Röntgenabsorptionseigenschaften wie normales
Bariumsulfat verfügen. Weiterhin lassen erste in-vivo Experimente
auf eine gute Biokompatibilität schließen. An
einer weiteren Verbesserung der Pharmakokinetik und Biokompatibilität
durch Größen- und Oberflächenveränderungen wird
momentan gearbeitet.
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Die
Anwendung in anderen Bildgebenden Verfahren, die auf Röntgenstrahlung
basieren (Röntgen, Angiographie) ist mit Hilfe der Erfindung
möglich. Besonders für die gefäßinternventionellen
Methoden könnte ein Embolisat entwickelt werden, dass auf
Bariumsulfat-Nanopartikel basiert und dadurch selbst einen Röntgenkontrast
erzeugt.
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Durch
den Einsatz eines Kontrastmittels, das über eine hohe Röntgenabsorption
verfügt, wird ein hoher Kontrast in der CT erreicht, was
die diagnostische Sensitivität erhöht.
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Durch
Verarbeitung des Bariumsulfates in gecoateten Nanopartikeln kann
das Verhalten so beeinflusst werden, dass das Kontrastmittel keine
schädigende Wirkung mehr entfaltet, obwohl die vorteilhaften
Kontrast-Eigenschaften vorhanden bleiben.
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Im
Vergleich zu anderen, etablierten, intravasal injizierbaren Kontrastmitteln
(beispielsweise jodhaltigen Kontrastmitteln), ergeben sich aus den
Nanopartikeleigenschaften des Bariumsulfates veränderte
Metabolisierungswege, die für die Beantwortung neuer diagnostischer
Fragestellungen verwendet werden können (beispielsweise
Lymphknotendiagnostik).
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Die
Vektorisierung der Nanopartikel kann mit einer Vielzahl von Liganden
erfolgen, so dass die Spezifizität des Kontrastmittels
erhöht werden kann. Dies gilt prinzipiell auch für
andere Kontrastmittel.
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Die
Vorteile der vorliegenden Erfindung bestehen insbesondere in:
- • Erhöhtem Kontrast pro Teilchen
im Vergleich zu jodhaltigem Kontrastmittel.
- • Verbesserter in-vivo Computertomografiedarstellung
von Gefäßen, Tumoren und Entzündungsherden/Fibrosezonen.
- • Exakterer Bestimmung von Extravasationsraten, Perfusion
und Gewebeblutvolumen in Normal- und Tumorgeweben, auch in Abhängigkeit
der unterschiedlichen Partikelgröße.
- • Durch unterschiedliche Partikelgrößen
unterschiedliche Metabolisierungswege und somit unterschiedliche
diagnostische Möglichkeiten (Blond-pool-, Leber-, Lymphknotendarstellung).
- • Aufgrund der Partikeleigenschaften werden schwere
toxische Reaktionen bei Gewebekontakt (granulomatöse Entzündung)
oder bei Aufnahme in die Blutbahn (Lungenembolie, Schlaganfall und Herzinfarkt),
die ansonsten für freies Bariumsulfat beschrieben sind,
verhindert. Durch Oberflächenanpassung (Coating) können
die biologischen Eigenschaften weiter optimiert werden.
- • Eine Oberflächenfunktionalisierung ermöglicht die
Bindung an Biomoleküle, wodurch spezifische Proben erstellt
werden können.
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Ausführungsbeispiele
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Herstellung:
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Lösung 1:
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50
g Ammoniumsulfat und 40 g konzentrierte Schwefelsäure wurden
gerührt und auf 160°C geheizt. Nachdem die Mischung
farblos und klar war, wurde 370 g Ethylenglycol zugegeben und die
Temperatur auf 83°C gestellt.
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Lösung 2:
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850
g Ethylenglycol und 200 g Bariumchlorid wurden auf 83°C
bei einer Rührgeschwindigkeit von ca. 130 rpm geheizt und
30 g Pyridin zugegeben..
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Zusammengabe Lösung 1 und 2:
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Nachdem
beide Lösungen auf gleiche Temperatur geheizt waren, wurde
die Rührgeschwindigkeit auf 380 rpm gestellt und Lösung
1 in Lösung 2 gegeben. Anschließend wurde 50 min
rühren gelassen. Nach diesen 50 min wurde die Umlaufkühlung auf
10°C gestellt und 1000 g Methanol zugegeben. Man ließ 10
min rühren und gab weitere 1600 g Methanol zu.
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Die
Methanolmenge wurde so zugegeben, dass 200 g zum Spülen
verwendet werden konnten. Man ließ das Material kurz und
heftig rühren und über Nacht bei RT absetzen.
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Es
entstanden 2 Phasen: die Obere war klar und gelb, die untere Phase
weißer Feststoff. Die obere Phase wurde abgetrennt. Die
unter Phase wurde in Zentrifugengefäße eingefüllt
und bei 4350 u/min abzentrifugiert. Nachdem die obere gelbklare
Phase abgetrennt und verworfen wurde, wurde das Zentrifugengefäß auf
800 g mit der gelbklaren Lösung 1 aufgefüllt.
Das Material wurde erneut zentrifugiert und die obere Phase verworfen.
Dann wurde das Bariumsulfat mit dem Spatel aufgelockert und 50 g
Methanol zugegeben. Das Material wurde mit dem Stabmixer aufgerührt
bis keine Klumpen mehr enthalten waren.
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Dann
wurde das Zentrifugengefäß mit 730 g Methanol
aufgefüllt. Das Material wurde 30 min gerüttelt
und ca. 60 min zentrifugiert. Der Vorgang wurde wiederholt. Die
obere Phase sollte anschließend farblos sein. Das Material
wurde getrocknet.
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Ausführungsbeispiel 1:
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Bestimmung
der Röntgenabsorption in Abhängigkeit der Konzentration
und im Vergleich zu normalem Bariumsulfat
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Methodik:
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Eine
Konzentrationsserie von freiem Bariumsulfat und Bariumsulfatnanopartikeln
wurden mittels eines Standard-CT Scanners untersucht. Der in der diagnostischen
Radiologie des DKFZ vorhandene CT-Scanner (Toshiba Aquilion 16,
Toshiba Medical System Corporation, Toshigi, Japan) wurde mit folgenden
Parametern im Spiralmodus betrieben: 16 × 1 mm Kollimation,
Pitch 1,5, small scan field of view, 120 kV, 150 mA, 0,5 s Rotationszeit.
Zum Vergleich und Referenzierung wurden ein Wasser- und Luftphantom
mitgeführt.
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Resultat & Schlussfolgerung:
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Die
Absorption der Bariumsulfatnanopartikel unterschied sich nicht von
der Absorption von freiem Bariumsulfat (1).
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Konzentrations-Absorptionsverlauf
von Bariumsulfatnanopartikeln und freiem Bariumsulfat.
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Es
bestand kein Unterschied in den Röntgenabsorptionseigenschaften
der beiden Aufbereitungen. CT-Werte stellten standardisierte Absorptionswerte
da, wobei Wasser 0 und Luft –1000 entsprachen. Zum Vergleich
wurde Absorption von jodhaltigem Standardkontrastmittel aufgetragen,
dessen Schwächung deutlich schlechter bezüglich
der molaren Konzentration war als Bariumsulfat.
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Die
Absorptionen der beiden Bariumsulfatzubereitungen waren bezüglich
der molaren Konzentration höher als die Absorption von
momentan routinemäßig verwendeten, jodhaltigen
Kontrastmitteln. Etwas mehr als die Hälfte der Konzentration
reichte für die gleiche Röntgenabsorption aus.
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Beispiel 2:
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In-vivo CT-Angiografie mit Bariumsulfatnanopartikeln
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In
jeweils eine Nacktmaus und -ratte wurde nanopartikuläres
Bariumsulfat über die Schwanzvene injiziert. Kurz danach
wurden CT-Scans durchgeführt.
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Methodik:
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Nacktmaus:
Durch Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung
wurde eine 0,5 molare Bariumsulfatsuspension gemäß dem
Herstellungsbeispiel hergestellt. Eine Nacktmaus wurde über
die Schwanzvene katheterisiert und es wurden 200 μl der
Suspension injiziert. Vor und bei Injektion wurde der Scan mit folgenden
Parametern an einem Toshiba Aquilion 16 Scanner durchgeführt:
16 × 1 mm Kollimation, Pitch 1,5, small scan field of view,
120 kV, 150 mA, 0,5 s Rotationszeit. Nach 10 Sekunden wurde ein
Wiederholungsscan mit den gleichen Parameter durchgeführt.
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Nacktratte:
Nanopartikuläres Bariumsulfat gemäß dem
Herstellungsbeispiel wurden in 0,9% wässrige NaCl supspensiert,
so dass eine 0,5 molare Konzentration erreicht wurde. Die Schwanzvene
wurde katheterisiert und es wurden 500 μl der Suspension
injiziert. Ein CT-Scan mit folgenden Parametern wurde durchgeführt:
16 × 1 mm Kollimation, Pitch 1,5, small scan field of view,
120 kV, 150 mA, 0,5 s Rotationszeit. Um die längerfristige
Dynamik des Kontrastmittels zu beurteilen, wurde eine Verlaufsuntersuchung
nach 48 h mittels des Toshiba-CT's unter Verwendung des gleichen
Scanprotokolls durchgeführt.
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Resultat:
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Nacktmaus:
Ein deutliches Enhancement in der Vena cava von 163 HU (SD 12,1)
auf 1006 HU (SD 211,2) nach erfindungsgemäßer
Injektion war zweifelsfrei zu erkennen (2).
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CT-Angiografie
mittels des erfindungsgemäßen Bariumsulfats in
einer Maus.
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Der
Scan wurde kurz nach Injektion der Suspension von nanopartikulärem
Bariumsulfat gemäß dem Herstellungsbeispiel durchgeführt.
Die Vena cava (schwarzer Pfeil) und der Truncus pulmonaris (weisser
Pfeil) wurde durch das erfindungsgemäße Bariumsulfat
deutlich kontrastiert.
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Nacktratte:
In der CT-Untersuchung war eine schwache Anreicherung in der Vena
cava und Aorta zu erkennen. Die Untersuchung nach 48 h im CT ergab
eine Anreicherung in der Leber und in der Darmwand (3).
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CT-Scan
einer Ratte nach 48 h nach Injektion von Bariumsulfatnanopartikeln.
Das retikuloendotheliale System (Leber, Milz, Darmwand) zeigt eine starke
Röntgenabsorption, was für eine Aufnahme der Nanopartikel
in das retikuloendotheliale System spricht.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - JP 50037255
B4 [0007]
- - CN 1438276 A [0007]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Fleischmann,
D., Use of high concentration contrast media: principles and rationale-vascular
district. European Journal of Radiology, 2003. 45: S. 88–93 [0003]
- - Rex, D. K., et al., Relative sensitivity of colonoscopy and
barium enema for detection of colorectal cancer in clinical practice.
Gastroenterology, 1997. 112(1): S. 17–23 [0004]
- - Maehara, N., Experimental microcomputed tomography study of
the 3D microangioarchitecture of tumors. Eur Radiol, 2003. 13(7):
S. 1559–65 [0005]
- - Badea, C. T., et al., 4-D micro-CT of the mouse heart. Mol
Imaging, 2005. 4(2): S. 110–6 [0005]
- - Rabin, O., et al., An X-ray computed tomography imaging agent
based an long-circulating bismuth sulphide nanoparticles. Nat Mater,
2006. 5(2): S. 118–22 [0006]
- - Hainfeld, J. F., et al., Gold nanoparticles: a new X-ray contrast
agent. British Journal of Radiology, 2006. 79(939): S. 248 [0006]