-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung und/oder
Charakterisierung zellulärer
Aktivitätsmuster,
die diesbezügliche
Verwendung von zumindest Toll-like-Rezeptor-Liganden (TLR-Liganden)
sowie einen Kit.
-
Die
frühzeitige
Erkennung von Erkrankungen und insbesondere die Vorhersage über den
weiteren Krankheitsverlauf ist von grundsätzlicher Bedeutung in der Medizin.
Dies gilt vor allem bei entzündlich
(inflammatorisch) verlaufenden Erkrankungen. Erschwerend kommt bei
entzündlich
verlaufenden Erkrankungen hinzu, dass sie in vielen Fällen von
einer körperübergreifenden
Immunreaktion begleitet sein können,
wodurch rasche und insbesondere schwerwiegende Krankheitsverläufe resultie ren.
Dies trifft insbesondere auf septische Erkrankungen zu, welche zudem
von einer überdurchschnittlich
hohen Mortalitätsrate
begleitet sind.
-
Bei
einer Sepsis reagiert das Immunsystem auf das Eindringen von entzündlichen
Erregern mit einer körperweiten
Immunreaktion. Als Folge der körperübergreifenden
Immunreaktion kommt es zu einer Aufweitung der Blutgefäße, wodurch
die Organversorgung und -funktion beeinträchtigt wird. Die Aufweitung
der Blutgefäße bewirkt
einerseits eine Nährstoff-
und Sauerstoffunterversorgung des Gehirns, was zum septischen Schock
führen
kann. Andererseits werden durch die aufgeweiteten Blutgefäße vermehrt
Erreger in Gewebe und insbesondere Organe ausgeschleust. Dadurch
sind bei einer Sepsis lebensfähige
entzündliche
Erreger nicht nur im Blut, sondern prinzipiell in allen Körperregionen
unabhängig
vom primären
Infektionsherd nachweisbar. Organ- und Gewebsschäden können sowohl durch bakterielle
Toxine als auch durch aktivierte Zellen des Immunsystems verursacht
werden. In vielen Fällen
manifestieren sich progressive septische Erkrankungen in einem Multi-Organ-Versagen. Allein
in Deutschland werden jährlich
250.000 bis 300.000 neue Sepsisfälle
registriert.
-
Zwar
kann die septische Blutgefäßerweiterung
durch Verabreichung von Catecholaminen therapeutisch behandelt werden,
welche eine Verengung der Blutgefäße bewirken. Doch geht eine
Zunahme der Schwere der septischen Erkrankung häufig mit einer Catecholaminresistenz
einher.
-
Zur
Diagnose von Erkrankungen können
in einem ersten Schritt Blutuntersuchungen durchgeführt werden.
Im Rahmen von Blutuntersuchungen werden gewöhnlich Blutbilder erstellt,
welche schnell und kostengünstig
angefertigt werden können.
Diese geben im Wesentlichen die numerische Aufschlüsselung
der im Blut enthaltenen Bestandteile, insbesondere der Blutzellen,
wieder. Auf diese Weise können daher
krank heitsbedingte Verschiebungen zwischen den einzelnen Blutbestandteilen
erfasst werden. Zusätzlich
können
auch morphologische Zellveränderungen
festgestellt werden. Nachteilig ist jedoch, dass diese Form der
Diagnose keine dynamische Untersuchung, d. h. keine Untersuchung
des immunologischen Verhaltens der Blutzellen gegenüber Erregertypen,
gestattet. Dies ist jedoch gerade bei entzündlich verlaufenden Erkrankungen,
insbesondere im Zusammenhang einer Überaktivierung des Immunsystems,
von besonderer Bedeutung. Diese Erkrankungsformen führen im
Fall eines septischen Schocks zu einer Art Erschöpfungszustand der Zellen des
Immunsystems, welcher als Anergie bezeichnet wird. Das Auftreten
einer Anergie ist mit dem weiteren Schicksal des betroffenen Patienten
korreliert.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt sich somit die Aufgabe, ein in vitro
Verfahren bereitzustellen, welches die Erfassung der immunologischen
Leistungsfähigkeit
von Blutzellen gegenüber
bestimmten Erregerstimulantien erlaubt.
-
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren zur Erkennung und/oder Charakterisierung zellulärer Aktivitätsmuster
(pattern recognition), insbesondere zur Diagnose und/oder Therapieverfolgung
von Erkrankungen, wobei Blutzellen in einem Kulturmedium zumindest
mit Toll-like-Rezeptor-Liganden (TLR-Liganden)
stimuliert werden und die stimulierten Blutzellen und/oder das Kulturmedium
untersucht werden.
-
Unter
Aktivitätsmuster
im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen Zustandsänderungen
von Zellen sowie von Zellkulturen verstanden werden, die im Zusammenhang
einer Stimulation mit Erregerstimulantien auftreten. Bei den Zustandsänderungen kann
es sich um biologische und/oder chemische, insbesondere biochemische,
Zustandsänderungen handeln.
Die Aktivitätsmuster
können
eine Zustandänderung
oder mehrere Zustandsänderungen
umfassen.
-
Das
immunologische Verhalten von Blutzellen gegenüber Erregern oder Erregerepitopen
ist teilweise mit sehr dynamischen Zustandsänderungen assoziiert. Durch
die Erfindung wird ein extrakorporales bzw. ex vivo Verfahren bereitgestellt,
das eine Erkennung und/oder Charakterisierung dieser zellulären Zustandsänderungen
erlaubt. Überraschenderweise
konnte nun gezeigt werden, dass die infolge einer Stimulierung mit
sogenannten Toll-like-Rezeptor-Liganden (TLR-Liganden) von Blutzellen
erzeugten Aktivitätsmuster
sehr gut mit der allgemeinen immunologischen Leistungsfähigkeit
der Blutzellen korrelieren. Dies kann in besonders vorteilhafter
Weise für
diagnostische Zwecke und/oder für
Therapieverfolgungsmaßnahmen
ausgenutzt werden. Dies gilt insbesondere für Erkrankungen, welche aus
dem systemischen inflammatorischen Response Syndrom (SIRS) erwachsen.
-
So
können
durch das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere einzelne Krankheitsstadien anhand der von den stimulierten
Blutzellen erzeugten Aktivitätsmuster
charakterisiert werden. Zudem können
patientenspezifische Unterschiede bezüglich der immunologischen Leistungsfähigkeit
der Blutzellen erfasst werden, wodurch grundsätzlich eine Subtypisierung
von Erkrankungen und insbesondere eine Einteilung in Patientenuntergruppen
möglich
ist. Hieraus können
sich wiederum wichtige Konsequenzen für die präventiven und therapeutischen
Maßnahmen
ergeben. So kann dem erfindungsgemäßen Verfahren eine individualtypische
Therapie nachgeschaltet sein. Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
in besonders vorteilhafter Weise zur Überwachung von manifesten und
behandelten Erkrankungen in deren Verlauf. So kann das erfindungsgemäße Verfahren
in Kombination mit einer definierten Therapiemaßnahme zum Einsatz kommen.
Dadurch ist es insbesondere möglich,
den Einfluss einer therapeutischen Maßnahme extrakorporal auf die
zelluläre
Ausscheidung von intrazellularen Stoffen zu eruieren, wenn die Zellen
durch erregertypische Stimulantien aktiviert werden. Beispielsweise lässt sich
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
untersuchen, welche Medikamente ein krankheitsassoziiertes Aktivitätsmuster
als Antwort auf definierte TLR-Liganden in ein physiologisch normales Muster überführen können. Mit
Hilfe der Erfindung ist es ebenso möglich, das immunologische Verhalten von
Blutzellen gegebenenfalls auch über
einen längeren
Zeitraum zu untersuchen. Hierzu können einem Spender oder Patienten
in beliebigen Abständen
Blutzellen entnommen werden und diese auf ihr immunologisches Verhalten
gegenüber
zumindest den Toll-like-Rezeptor-Liganden (TLR-Liganden) untersucht
werden. Auf diese Weise ist eine Erfassung der dynamischen Schwankungen
in den Aktivitätsmustern
der Blutzellen möglich.
-
Grundsätzlich können bei
der Untersuchung der stimulierten Blutzellen und/oder des Kulturmediums
alle zellulären
Zustandsänderungen
herangezogen werden. Bevorzugt werden chemische, biochemische und/oder
biologische Zustandsänderungen der
stimulierten Blutzellen und/oder des Kulturmediums gemessen. Bei
den zu untersuchenden chemischen Zustandsänderungen kann es sich insbesondere
auch um chemisch-physikalische Zustandsänderungen handeln. Als zu untersuchende
Zustandsänderungen
kommen insbesondere der Calcium-Influx in die Blutzellen, pH-Wert-Änderungen,
Membranpotentiale und/oder der cAMP/cGAMP-Spiegel (zyklisches Adenosin-Monophosphat/zyklisches
Guanidin-Adenosin-Monophosphat-Spiegel) in Betracht.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden bei der Untersuchung des Kulturmediums von
den stimulierten Blutzellen in das Kulturmedium ausgeschiedene (sezernierte)
Stoffe untersucht. Die Untersuchung der ausgeschiedenen Stoffe kann
während
des Stimulationsvorganges oder nach dem Stimulationsvorgang, insbesondere in
bestimmten Zeitabständen,
erfolgen.
-
Vorzugsweise
werden die Konzentrationen der von den stimulierten Blutzellen ausgeschiedenen Stoffe
bestimmt. Für
die Konzentrationsbestimmung kommen grundsätzlich alle dem Fachmann bekannten
molekularbiologischen Methoden in Betracht. Die Methoden können auf
transkriptioneller Ebene, translationaler und/oder post-translationaler
Ebene ansetzen. Neben den ausgeschiedenen Stoffen können auch
Aktivierungsmarker der Zellen auf transkriptioneller, translationaler
und/oder post-translationaler Ebene untersucht werden, vorzugsweise
unter Bestimmung von deren Konzentrationen. Bevorzugt werden zur
Konzentrationsbestimmung die zellulär ausgeschiedenen Stoffe einem
Immunoassay oder einem elektrophoretische Verfahren unterworfen.
Die in Frage kommenden Immunoassays beruhen gewöhnlich auf der Erkennung eines
Zielmoleküls durch
spezifische Antikörper.
Ein geeigneter Immunoassay ist zum Beispiel das ELISA-Verfahren
(Enzymelinked immunosorbant assay). Ein geeignetes elektrophoretisches
Verfahren zur Konzentrationsbestimmung ist beispielsweise die Gelelektrophorese, insbesondere
die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-Page). Weiterhin
kommen Array-Technologien, insbesondere multiplexe Bead-Arrays oder
planare Arrays, in Frage.
-
Bei
den von den stimulierten Blutzellen ausgeschiedenen Stoffen kann
es sich insbesondere um Botenstoffe, beispielsweise um sogenannte
Mediatoren, handeln. Bei den ausgeschiedenen Stoffen kann es sich
insbesondere um Proteine und/oder Peptide handeln. Die Proteine
können
beispielsweise Rezeptoren und/oder Proteine mit enzymatischer Aktivität sein.
Vorzugsweise sind die ausgeschiedenen Stoffe glykosylierte Proteine
und/oder Peptide. Bevorzugt handelt es sich bei den von den stimulierten
Blutzellen ausgeschiedenen Stoffen um niedermolekulare Botenstoffe,
insbesondere um radikalische Sauerstoffverbindungen, lipidartige
Botenstoffe, Zytokine, Chemokine und/oder um lösliche Adhäsionsmoleküle. Weiterhin kann es sich
bei den ausgeschiedenen Stoffen um membranumschlossene Vesikel,
insbesondere um Exosomen und/oder Nucleosomen, handeln.
-
Vorzugsweise
werden die stimulierten Blutzellen zur Untersuchung aus dem Kulturmedium
zurückgewonnen.
Die Blutzellen können
beispielsweise durch dem Fachmann geläufige Zentrifugationstechniken,
insbesondere durch Gradienten-Zentrifugation, zurückgewonnen
werden. Weiterhin können
zur Rückgewinnung
der Blutzellen auch magnetische oder flowcytometrische Sortiertechniken
durchgeführt
werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden bei der Untersuchung der stimulierten Blutzellen von den
Blutzellen gebildete Genprodukte untersucht. Vorzugsweise wird von
den Blutzellen gebildete RNA (ribonucleic acid), insbesondere mRNA
(messenger-RNA), untersucht. Hierzu wird die zellulär gebildete
RNA zweckmäßiger Weise
aus den Blutzellen isoliert und insbesondere gereinigt. Die Isolierung
der RNA aus den Blutzellen kann beispielsweise durch Extraktion
erfolgen. Zur weiteren Untersuchung wird die gebildete RNA vorzugsweise
einer Amplifikation, insbesondere einer Polymerase-Kettenreaktion
mit reverser Transkriptase (RT-PCR), unterworfen. Der eigentliche
Nachweis der RNA wird gewöhnlich
mit Hilfe einer Northern-Blot-Technik vorgenommen.
-
Als
weitere Genprodukte kommen bevorzugt von den stimulierten Blutzellen
gebildete Proteine und/oder Peptide in Betracht. Vorzugsweise wird
bei der Untersuchung der Blutzellen die Expression von Proteinen
und/oder Peptiden untersucht. So können zur Untersuchung der Proteine
und/oder Peptide Expressionsmuster bzw. -Profile erstellt werden.
Weiterhin können
insbesondere massenspektroskopische Untersuchungen herangezogen
werden. Der Einsatz von Arraytechnologien ist ebenso möglich.
-
Weiterhin
können
apoptotische Signalwege und Vorgänge
in den stimulierten Blutzellen untersucht werden. Vorzugsweise wird
die Expression von Signaltransducern und/oder Rezeptoren auf und/oder
in den Blutzellen untersucht. Besonders bevorzugt wird die Dichte
der Signaltransducer und/oder der Rezeptoren auf und/oder in den
Blutzellen bestimmt. Weiterhin kann die Induktion enzymatischer
Aktivitäten
untersucht werden. Beispielsweise können die enzymatischen Aktivitäten von
Phospholipasen, Cyclooxygenasen, Proteinkinasen, PARP (polyADP-Ribose-Polymerase)
und/oder von Caspasen untersucht werden. Als Untersuchungsmethoden für zelluläre Signaltransducer
und/oder Rezeptoren kommen insbesondere Analysen von Oberflächenmarkern
und/oder von phosphorylierten Signaltransduktionsmolekülen, insbesondere
von phosphorylierten Proteinen, in Betracht. Geeignete Analysen
beruhen beispielsweise auf histologischen Färbungstechniken oder flowzytometrischen
Methoden. Die in den vorangegangenen Abschnitten beschriebenen Verfahren
sind dem Fachmann hinreichend bekannt, so dass auf eine ausführlichere
Darstellung an dieser Stelle verzichtet werden kann.
-
In
einer weitergehenden Ausführungsform werden
zur Untersuchung der stimulierten Blutzellen modifizierte Zellkernbestandteile
der Blutzellen untersucht. Als modifizierte Zellkernbestandteile
kommen insbesondere DNA, Histone sowie gebildete microRNA in Betracht.
Bei den DNA-Modifikationen handelt
es sich vorzugsweise um Methylierungen und/oder Acetylierungen.
-
Wie
bereits mehrfach erwähnt,
werden die Blutzellen gemäß der vorliegenden
Erfindung zumindest mit sogenannten TLR-Liganden stimuliert. Bei den
bisher bekannten Toll-like-Rezeptoren (TLR) handelt es sich um Transmembranmoleküle, welche eine
Leucin-reiche Extrazellulardomäne
und eine Interleukin-1 ähnliche
Intrazellulardomäne
aufweisen.
-
Vorzugsweise
werden zur Stimulierung der Blutzellen Liganden von humanen Toll-like-Rezeptoren
(hTLR-Liganden) verwendet. Bevorzugt wird zumindest ein Ligand von
humanen Toll-like-Rezeptoren (hTLR-Ligand) aus der Gruppe, umfassend hTLR1,
hTLR2, hTLR3, hTLR4, hTLR5, hTLR6, hTLR7, hTLR8, hTLR9, hTLR10 und
hTLR11, zur Stimulierung der Blutzellen verwendet. Weiterhin können zur
Stimulierung der Blutzellen Liganden von TLR-Heterodimeren, vorzugsweise
Liganden des TLR-Heterodimers
hTLR1–hTLR2
und/oder Liganden des TLR-Heterodimers hTLR2–hTLR6, verwendet werden.
-
Bei
den TLR-Liganden kann es sich um natürlich vorkommende Liganden
handeln. Bevorzugt werden zur Stimulierung der Blutzellen TLR-Liganden mikrobiellen
Ursprungs verwendet. Die TLR-Liganden können insbesondere aus Bakterien,
Viren und/oder Pilzen stammen, vorzugsweise aus Bakterien. Weiterhin
kann es sich bei den TLR-Liganden um Abbauprodukte des tierischen
Organismus, insbesondere des menschlichen Organismus, handeln. Als
geeignete Abbauprodukte kommen insbesondere Fibrin und/oder Fibrinogen
in Frage.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
werden zur Stimulierung der Blutzellen in bakteriellen Zellwänden und/oder
bakteriellen Zellmembranen vorkommende Verbindungen als TLR-Liganden
verwendet. Als geeignete Verbindungen kommen vorzugsweise solche
Verbindungen in Betracht, welche in Zellwänden und/oder Zellmembranen
von gramnegativen Bakterien vorkommen. Als gramnegative Bakterien
kommen insbesondere Enterobakterien, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis
und/oder Bacteroides in Betracht. Als Enterobakterien kommen beispielsweise
Escherichia coli, Klebsiella, Proteus und/oder Enterobacter in Frage.
Als TLR-Liganden können
weiterhin Verbindungen aus Zellwänden
und/oder Zellmembranen von grampositiven Bakterien, insbesondere
von Staphylokokken und/oder Streptokok ken, beispielsweise von Staphylococcus
aureus und/oder Streptococcus pneumoniae, verwendet werden.
-
Besonders
bevorzugt wird zur Stimulierung der Blutzellen zumindest ein TLR-Ligand
aus der Gruppe, umfassend Lipopolysaccharide (LPS), Lipoproteine,
Lipopeptide, Lipoteichonsäuren,
Glykane, Muramylpeptide, Mannane, DNA und RNA, verwendet. Bei den
Glykanen handelt es sich vorzugsweise um Proteoglykane. Als RNA
kommen insbesondere doppelsträngige
RNA (dsRNA) und/oder einzelsträngige
RNA (ssRNA) in Betracht. Als Lipopeptide werden insbesondere Lipopeptide
mit zwei oder drei kovalent gebundenen Fettsäuren verwendet. Weiter bevorzugt
in Frage kommende TLR-Liganden sind Proteine, insbesondere bakterielle
Proteine. Beispielsweise kann es sich bei den Proteinen um Flagellin
und/oder Hitzeschockproteine handeln. Erfindungsgemäß können auch
Phosphodiesterverbindungen von DNA-Basen verwendet werden. Beispielsweise
kann es sich bei den Phosphodiesterverbindungen um CpG (Phosphodiester
aus Cytosin und Guanin) handeln.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden zur Stimulierung der Blutzellen synthetische TLR-Liganden,
insbesondere Imiquimod und/oder Loxoribin, verwendet.
-
Erfindungsgemäß ist es
weiterhin bevorzugt, dass zur Stimulierung der Blutzellen neben
den TLR-Liganden weitere die Blutzellen stimulierende Substanzen,
insbesondere co-stimulierende Zell-Rezeptor-Liganden, verwendet
werden. Bei den in Frage kommenden Liganden handelt es sich bevorzugt um
Liganden für
Zell-Rezeptoren, welche durch Pathogen-assoziierte molekulare Muster
(PAMPS: pathogen associated molecular patterns) aktiviert werden,
unabhängig
von ihrer Bindungsspezifität.
Als co-stimulierende Zell-Rezeptor-Liganden kommen insbesondere
Integrin-Rezeptor-Liganden in Betracht. Bei den Integrin-Rezeptoren
handelt es sich um Adhäsions-Rezeptoren,
welche in Form von Gly koproteinen in der Zellmembran vorliegen und
insbesondere bei Zell-Zell-Kontakten
sowie beim Signaltransport von dem Extrazellularraum in den Intrazellularraum
(Zytoplasma) eine wichtige Rolle spielen. Vorzugsweise handelt es
sich bei den co-stimulierenden Zell-Rezeptor-Liganden um Liganden für intrazellulare
und insbesondere funktionell den Toll-like-Rezeptoren (TLRs) gleichzusetzende
Rezeptoren, insbesondere um Liganden für Rezeptoren aus der NOD (nucleotide-binding
oligomerization domain)-Familie (auch CARD (N-terminal caspase recruitment
domain)-Familie genannt). Besonders bevorzugt handelt es sich bei
den co-stimulierenden Zell-Rezeptor-Liganden um Liganden für den NOD-1-Rezeptor
und/oder NOD-2-Rezeptor.
-
Es
ist weiterhin bevorzugt, dass zur Stimulierung der Blutzellen Exosomen
und/oder Nucleosomen verwendet werden.
-
Zur
Stimulierung der Blutzellen können TLR-Liganden
von verschiedenen Erregern verwendet werden. Die auf diese Weise
erzeugten Aktivitätsmuster
wiederspiegeln mit besonderem Vorteil die aktuelle Leistungsfähigkeit
der Blutzellen gegenüber verschiedenen
TLR-Liganden. Die resultierenden Aktivitätsmuster können zur Diagnose und/oder
Therapieverfolgung von Erkrankungen verwendet werden, welche auf
dem gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Auftreten mehrerer
Erregertypen beruhen.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
können zur
Stimulierung der Blutzellen TLR-Liganden mit Bindungsspezifitäten für unterschiedliche
Toll-like-Rezeptoren
verwendet werden.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird mit mehreren Kulturmedien, insbesondere in Form
eines Parallelansatzes, gearbeitet. Vorzugsweise werden die Blutzellen
zur Stimulierung in 1 bis 100, insbesondere in 1 bis 50, vorzugsweise
in 1 bis 11, Kulturmedien überführt. Die Überführung der
Blutzellen in die Kulturmedien erfolgt gewöhnlich vor ihrer Stimulierung.
Die Kulturmedien werden vorzugsweise jeweils mit verschiedenen TLR-Liganden
versehen. Auf diese Weise können abhängig vom
jeweiligen TLR-Ligand unterschiedliche Aktivitätsmuster erfasst und insbesondere
charakterisiert werden. Erfindungsgemäß ist es insbesondere vorgesehen,
dass jedes Kulturmedium mit einem TLR-Ligand versehen wird. Erfindungsgemäß ist es
ebenso möglich,
die Kulturmedien jeweils mit mehreren TLR-Liganden zu versehen.
Dadurch können
zelluläre
Aktivitätsmuster
erfasst und insbesondere charakterisiert werden, wie sie in einem
Organismus bei Anwesenheit mehrerer Erregertypen auftreten oder
durch die Infektion mit mehreren Erregertypen entstehen (polymikrobielle
Sepsis).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden Immunzellen, insbesondere Immunzellen des peripheren Blutes,
vorzugsweise Leukozyten, als Blutzellen verwendet. Vorzugsweise
handelt es sich bei den Blutzellen um sogenannte Vollblutzellen.
Als geeignete Blutzellen können
insbesondere Leukozyten verwendet werden, welche Lymphozyten, dendritische
Zellen und/oder Makrophagen enthalten. Vorzugsweise wird die Untersuchung
der stimulierten Blutzellen mit Leukozyten durchgeführt. Bei
den Leukozyten handelt es sich insbesondere um Granulozyten, Lymphozyten,
dendritische Zellen, Monozyten sowie um Vorstufen solcher zellulärer Differenzierungsstadien.
Die Blutzellen können
insbesondere als PBMC (peripheral blond mononuclear cells) vorliegen,
welche bevorzugt mittels einer Dichtegradientenzentrifugation gewonnen
werden. Die auf diese Weise gewonnenen Leukozyten umfassen in der
Regel T-Lymphozyten,
B-Lymphozyten, NK-Zellen (natürliche
Killerzellen), Monozyten, dendritische Zellen, Eosinophile, Plasmazellen
sowie Vorstufen davon. Die Untersuchung von Lymphozyten ist besonders bevorzugt.
-
Die
Blutzellen können
vor ihrer Stimulierung bereits in einem aktivierten Zustand vorliegen.
So können
die Blutzellen durch Stimulantien, insbe sondere durch Erregerstimulantien,
voraktiviert sein. Bei den Stimulantien kann es sich insbesondere
um TLR-Liganden handeln. Beispielsweise können die Blutzellen eines kranken
Spenders verwendet werden.
-
Die
Blutzellen können
weiterhin vor dem Stimulationsvorgang aus Blut angereichert werden.
Vorzugsweise wird zur Stimulierung der Blutzellen eine Probe des
Vollblutes in das Kulturmedium überführt, wobei
die darin enthaltenen Vollblutzellen zumindest mit den TLR-Liganden
stimuliert werden. Unter Vollblut wird gewöhnlich Blut mit sämtlichen
Blutbestandteilen verstanden, einschließlich der Blutzellen und des
Blutplasmas sowie der darin enthaltenen biologisch aktiven Faktoren,
beispielsweise der Gerinnungsfaktoren und der Complementproteine.
Als Vollblut wird vorzugsweise Blut humanen Ursprungs verwendet.
Bei dem Vollblut kann es sich insbesondere um Frischblut, vorzugsweise
um frisches Patientenblut, handeln. Auf diese Weise können die
physiologischen Verhältnisse
in einem Spenderblut am besten simuliert werden. Dies erlaubt in
besonders vorteilhafter Weise eine Untersuchung der aktuellen immunologischen
Leistungsfähigkeit
der im Spenderblut enthaltenen Blutzellen. Insbesondere kann es vorgesehen
sein, dass einem Spender über
einen gegebenenfalls längeren
Zeitraum in bestimmten Abständen
Blutzellen entnommen werden, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
bezüglich ihrer
Aktivitätsmuster
untersucht werden. Dadurch kann die aktuelle immunologische Leistungsfähigkeit der
Blutzellen über
einen gegebenenfalls längeren Zeitraum
beobachtet werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
wird die Stimulierung der Blutzellen während eines Zeitraumes von
0 bis 48 h, insbesondere von 4 bis 48 h, vorzugsweise von ca. 24
Stunden, durchgeführt.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Stimulierung der Blutzellen während eines Zeitraumes von
1 bis 30 min, insbesondere von 1 bis 10 min, durchgeführt. Dies
ist insbesondere zur Untersuchung früher Signaltransduktionen von
Vorteil. Das erfindungsgemäße Verfahren
lässt sich
insbesondere als „Ultra-Schnelltest" durchführen. Auf
diese Weise können
relativ unspezifische Indikatoren zellulärer Aktivität erfasst und untersucht werden.
Beispielsweise können
der Calcium-Influx in die Blutzellen, Veränderungen des intra- und extrazellulären pH-Werts, die Phosphorylierung
von Proteinen und/oder die Bildung von cAMP/cGAMP untersucht werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
wird die Stimulierung der Blutzellen während eines Zeitraumes von
1 bis 4 h durchgeführt
(Schnelltest). Dadurch kann bevorzugt die Ausscheidung von Stoffen, insbesondere
von Botenstoffen, untersucht werden. Beispielsweise kann die Freisetzung
von Interleukin 1 (IL-1), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα), Interleukin-8 (IL-8), Granzyme
B und/oder Perforin gemessen werden. Bei den ausgeschiedenen Stoffen
handelt es sich insbesondere um in den Blutzellen bereits vorgebildete
Stoffe. Diese werden in den Zellen gewöhnlich in sogenannten Speichergranula
gelagert. Weiterhin ist während
der in diesem Abschnitt genannten Stimulationszeit auch eine Untersuchung der
Synthese von niedermolekularen Stoffen, insbesondere von Botenstoffen,
sowie beispielsweise eine Untersuchung der Umverteilung von Oberflächenmarkern
möglich.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird die Stimulierung der Blutzellen während eines Zeitraumes von
6 bis 24 h durchgeführt.
Auf diese Weise kann die Bildung von spezifischen Indikatoren zellulärer Aktivität erfasst
und untersucht werden. Bei den spezifischen zellulären Aktivitätsindikatoren handelt
es sich insbesondere um Zytokine, Chemokine, Oberflächenrezeptoren,
Enzyme und/oder andere Proteine bzw. Peptide sowie um Exosomen und/oder
Nucleosomen. Bei den Oberflächenrezeptoren
kann es sich beispielsweise um Adhäsionsmoleküle handeln.
-
Die
Stimulierung der Blutzellen kann erfindungsgemäß in hohlzylindrischen Behältnissen,
insbesondere nach Art von Blutröhrchen
oder Spritzenzylindern, durchgeführt
werden. Derartige Behältnisse
sind besonders dann zur Stimulierung der Blutzellen geeignet, wenn
während
des Stimulationsvorganges ein Überstand
und ein im Wesentlichen aus den Blutzellen bestehendes Sediment
gebildet wird. Der Spritzenzylinder kann insbesondere eine abbrechbare
Kolbenstange sowie eine den gesamten Querschnitt des Spritzenzylinders
freigebende Verschlusskappe aufweisen. Solche Spritzenzylinder können nach
dem Abbrechen der Kolbenstange wie Reagenzgläser oder Zentrifugengläser gehandhabt, insbesondere
aufbewahrt, werden. Nach der Stimulierungszeit, insbesondere nach
einer Stimulierungszeit von mehr als 6 h, kann nach dem Absetzen
der Blutzellen ein dem Spritzenzylinder zugeordneter Ventilkolben
bei abgenommener Kappe von oben eingeführt werden und in den Überstand
hineingedrückt
werden. Der Überstand
fließt
dann durch den Ventilkolben hindurch. Nach Beendigung des Eindrückvorganges
und Herausziehen eines Eindrückstabes
schließt
der Ventilkolben von selbst, so dass danach eine Vermischung zwischen
den Blutzellen und dem Überstand
nicht mehr möglich
ist. Dies ist besonders vorteilhaft für den Fall, dass die Aktivitätsuntersuchung
der Blutzellen an einem anderen Ort als ihre Stimulierung vorgenommen
wird. In vielen Fällen
ist es zudem bevorzugt, eine zu untersuchende Probe im Falle einer
längeren
Aufbewahrung einzufrieren. Hierdurch platzen die in der Probe enthaltenen
Blutzellen auf und geben somit ihre intrazellularen Stoffe frei.
Durch den eingeführten
Ventilkolben wird verhindert, dass die so freigesetzten Stoffe zu
einer Verfälschung
der Messergebnisse führen.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von zumindest
Toll-like-Rezeptor-Liganden (TLR-Liganden) zur Herstellung eines
Mittels zur Diagnose (Diagnosemittel) und/oder Therapieverfolgung
von Erkrankungen. Bei den Erkrankungen handelt es sich vorzugsweise
um entzündliche,
insbesondere um chronisch-entzündliche,
Erkrankungen.
-
Erfindungsgemäß ist es
insbesondere vorgesehen, dass die Erkrankungen mit einem systemischen
inflammatorischen Response Syndrom (SIRS), insbesondere unterschiedlicher
Genese, assoziiert sind. Hierzu zählen alle körpereigenen entzündlichen
Abwehrreaktionen eines Gesamtorganismus. Die Ursachen für SIRS können vielfältig sein. So
kann das SIRS allgemein durch schwere Erkrankungen, Verletzungen,
Unfälle,
Strahlung, Infarkt und andere Pathomechanismen, wie beispielsweise
Enzymdefekte oder Intoxikationen, entstehen. Bevorzugt handelt es
sich bei den Erkrankungen um septische Erkrankungen, insbesondere
um Sepsis. Von einer Sepsis wird dann gesprochen, wenn SIRS vorliegt
und gleichzeitig eine systemische Infektion nachgewiesen werden
kann.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei den Erkrankungen um das Makrophagen-Aktivierungssyndrom
(MAS), welches mit chronischen Entzündungszuständen einhergeht.
-
Die
erfindungsgemäß verwendeten
TLR-Liganden liegen vorzugsweise in einer lagerstabilen Form, insbesondere
in eingefrorener oder gefriergetrockneter Form, vor.
-
Bevorzugt
handelt es sich bei den TLR-Liganden um zumindest einen Liganden
von humanen Toll-like-Rezeptoren (hTLR-Ligand), insbesondere aus
der Gruppe, umfassend hTLR1, hTLR2, hTLR3, hTLR4, hTLR5, hTLR6,
hTLR7, hTLR8, hTLR9, hTLR10 und hTLR11. Bei den TLR-Liganden kann
es sich weiterhin insbesondere um Liganden von TLR-Heterodimere
handeln, vorzugsweise um Liganden des TLR-Heterodimers hTLR1–hTLR2 und/oder um Liganden
des TLR-Heterodimers
hTLR2–hTLR6.
-
Neben
den TLR-Liganden können
weitere die Blutzellen stimulierende Substanzen, insbesondere co-stimulierende
Zell-Rezeptor-Liganden, verwendet werden. Als geeignete Zell-Rezeptor-Liganden
kommen ins besondere Integrin-Rezeptor-Liganden und/oder NOD (nucleotidebinding
oligomerization domain)-Rezeptor-Liganden in Betracht. Bei den NOD-Rezeptor-Liganden
handelt es sich bevorzugt um Liganden für den NOD-1-Rezeptor und/oder NOD-2-Rezeptor.
Bezüglich
weiterer Einzelheiten wird auf die bisherige Beschreibung verwiesen.
-
Die
TLR-Liganden sind vorzugsweise mikrobiellen Ursprungs. Die TLR-Liganden können insbesondere
aus Bakterien, Viren und/oder Pilzen stammen. Bevorzugt handelt
es sich bei den TLR-Liganden um in bakteriellen Zellwänden und/oder
bakteriellen Zellmembranen vorkommende Verbindungen. Vorzugsweise
handelt es sich bei den TLR-Liganden um mindestens einen Liganden
aus der Gruppe, umfassend Lipopolysaccharide (LPS), Lipoproteine,
Lipopeptide, Lipoteichonsäuren,
Glykane, Muramylpeptide, Mannane, DNA und RNA. Bei den Glykanen handelt
es sich vorzugsweise um Proteoglykane. Als RNA kommen insbesondere
doppelsträngige
RNA (dsRNA) und/oder einzelsträngige
RNA (ssRNA) in Betracht. Als Lipopeptide werden insbesondere Lipopeptide
mit zwei oder drei kovalent gebundenen Fettsäuren verwendet. Weitere bevorzugt
in Frage kommende TLR-Liganden sind Proteine, insbesondere bakterielle
Proteine. Bei den TLR-Liganden handelt es sich insbesondere um Flagellin
und/oder um Hitzeschockproteine. Weiterhin können Phosphodiesterverbindungen
von DNA-Basen verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei
den Phosphodiesterverbindungen um CpG (Phosphodiester aus Cytosin und
Guanin) handeln. Bezüglich
weiterer Einzelheiten und Merkmale zu den in Frage kommenden TLR-Liganden
wird auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft schließlich einen Kit zur Diagnose
und/oder Therapieverfolgung von Erkrankungen, welcher ein Behältnis zur
Stimulierung von Blutzellen umfasst. Diesem Behältnis sind zumindest Toll-like-Rezeptor-Liganden
(TLR-Liganden) zugeordnet. Vorzugsweise enthält das Behältnis zumindest die TLR-Liganden.
In einer ande ren Ausführungsform
umfasst der erfindungsgemäße Kit räumlich voneinander
getrennt das Behältnis
und zumindest die TLR-Liganden. Bei dem Behältnis kann es sich insbesondere
um ein Blutröhrchen
oder einen Spritzenzylinder handeln. Der Kit kann weiterhin ein
Nährmedium
für die
Blutzellen umfassen. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Kit auch
ein Blutentnahmebesteck umfassen. Bezüglich weiterer Einzelheiten
und Merkmale wird auf die bisherige Beschreibung verwiesen.
-
Weitere
Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Figurenbeschreibung. Dabei können
die einzelnen Merkmale jeweils für
sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht
sein. Die Figuren werden durch Bezugnahme ausdrücklich zum Inhalt der Beschreibung
gemacht.
-
Die 1 bis 15 zeigen
das Ergebnis einer Untersuchung der von Leukozyten erzeugten Aktivitätsmuster.
Die Leukozyten stammen von septischen Patienten, deren Sepsis durch
drei unterschiedliche Erreger verursacht wurden: GPOS: gram-positive
Keime, GNEG: gram-negative Keime und CAA: Candida albicans. Die
Untersuchung der Aktivitätsmuster
erfolgte anhand einer Direktanalyse mehrerer Mediatoren in Serumproben
der Patienten (IFNg: Interferon γ,
MCP1: Monocyte chemoattractant Protein-1, IP10: INFγ-inducible
Protein 10, 1110: Interleukin 10 und TNFα: Tumor-Nekrose-Faktor-α. Aus den 1 bis 15 wird
deutlich, dass die Aktivitätsmuster
abhängig
vom jeweiligen Sepsis-Patienten deutliche Unterschiede aufweisen.
Diese Unterschiede können
zur Charakterisierung von Sepsis, insbesondere zur Unterteilung
in Subtypen von Sepsis, herangezogen werden. Auf diese Weise ist
insbesondere eine diagnostische Wiedererkennung von Sepsistypen
anhand der gemessenen Aktivitätsmuster
möglich.
Dies kann in gezielter Weise für
eine Therapieverfolgung ausgenutzt werden.