CN1433481A - 通过基因表达分析评价和预测临术预后 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了为罹患病理性疾病或综合征的患者预测临床预后的方法。我们测定了患者临床样本的细胞内基因表达水平，并与参考水平进行了比较。该水平与参考水平的差异可以预测临床预后，例如疾病进展情况或对治疗干预的反应。

Description

通过基因表达分析评价和预测临床预后
发明领域
本发明涉及通过基因表达水平评价和预测患者临床预后的方法。提供的方法包括定量测定基因表达水平，并将测定水平与参考水平进行比较。该水平与参考水平的差异与临床预后进行相关分析。例如，可以测定患者对治疗干预的反应类型和程度，或者评价患者的生存预后。可以在几乎所有机体备选组织或体液中测定基因表达水平。令人惊异的是，业已发现，血液细胞内基因表达水平的测定可以提示临床预后。
发明背景
以前业已描述了在例如疾病状态下检测综合基因表达的方法。见，例如，美国专利5,874,219；Zakut et al.，Cancer Research，53：5-8(1993)；Mohaupt et al.，Kidney International，46：653-665(1994)；Liang and Pardee(1992)Science 257，967-971；Liang et al(1993)，Nucleic Acids Res.21，3269-3275；Bauer et al(1993)，Nucleic Acids Res.21，4277-4280；Stone andWharton(1994)，Nucleic Acids Res.22，2612-2618，以及Wang andFeuerstein(1995)Biotechniques 18，448-452；WO 93/18176，和DE 43 17414。但是这些方法通常只提供了基因表达的“简单印象”，因为基因表达是定性的，而非定量的。因此，这些方法只是提供了这样一种信息，即在某一特定组织中基因是否在可探测水平表达。而且，当这些方法用于检测罹患病理性综合征患者的样本时，没有一种方法能够提供与患者临床预后相关的信息。因此，很显然，我们需要测定基因表达水平的新的改良方法，并迫切需要将这些水平与临床预后联系起来。
发明概述
临床实践中存在这样一种需求，就是确定或预测患者的临床预后。因此本发明的目标就是为罹患临床疾病或综合征的患者提供评价(例如确定和/或预测)临床预后的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供患者的临床标本；(b)在临床标本中测定一套预选基因的表达水平；以及(c)将该表达水平与一套参考表达水平进行比较，在这套预选基因中，一种或多种基因表达水平与参考水平的差异可以提示患者的临床预后。短语“预选基因”是指业已确定适用于本发明实践的基因。优选的，按照本发明实践，这些备选基因的表达水平与疾病状况或其他不欲状态的性质和程度之间存在相关性。
根据本发明的一个方面，临床样本是血样、组织或脑脊液。临床样本可以是血样，也可以是血液的衍生物，如血浆或血清或成分血。
根据本发明的另一方面，需要测定至少三种预选基因的表达水平。在一个实施方案中，测定了至少一种促炎细胞因子的表达水平。在另一个实施方案中，测定了至少三种预选促炎细胞因子的表达水平。在另一个实施方案中，预选促炎细胞因子基因选自TNF-α，IL-6，IL-1，IL-8，IP-10和MIP-1α。
根据本发明的另一方面，临床疾病或综合征是一种炎症紊乱。在一个实施方案中，炎症紊乱是慢性炎症紊乱。在另一个实施方案中，慢性炎症紊乱选自慢性肝炎，乙型肝炎或丙型肝炎，慢性阻塞性肺病，炎症性粘膜病，自身免疫性疾病，痴呆，心血管疾病和肿瘤。炎症性粘膜病可以选自炎症性肠病，克隆病和结肠炎。痴呆可以是AIDS相关性痴呆或阿尔茨海默病。肿瘤可以选自淋巴瘤，前列腺癌和结肠癌。在另一个实施方案中，临床疾病是接受同种异体移植患者发生的移植排异反应。移植物可以是心脏，肝脏，肾脏或其他器官。
根据本发明另一方面，确定的临床预后是对某种治疗干预的反应情况。治疗干预可以是药物治疗。药物可以是稳定的亚氯酸盐溶液。特别是，稳定的亚氯酸盐溶液可以是WF-10。
根据本发明的另一方面，临床疾病或综合征是HIV感染。在一个实施方案中，临床疾病或综合征是AIDS。
根据本发明的另一方面，提示的临床预后是在某一预定时间，患者存活的可能性。在一个实施方案中，提示的临床预后是6个月后患者的存活可能性。
根据本发明的另一方面，基因表达水平的测定可以采用定量聚合酶链反应。聚合酶链反应可以是逆转录酶/聚合酶链反应。聚合酶链反应可以应用荧光法检测扩增产物来进行。在一个实施方案中，可以应用LightCycler设备或其他适宜技术进行聚合酶链反应。
从后面的详细描述中，可以明确看到本发明的其他目标、特点和优势。但是应该理解，详细描述和特定实施例以及提示的本发明优选实施方案，只是为了更加清楚地阐释本发明，因为对于本领域技术人员来说，根据发明详述，可以在本发明的精神和范畴内，进行多种变化和修饰。
附图简述
图1是巨噬细胞激活周期的示意图，其中，在多种形式的巨噬细胞功能激活和再循环过程中，发生多个步骤，最终达到巨噬细胞激活平衡。
图2显示了患者(#14)应用WF10治疗后，促炎细胞因子基因表达的变化。基因表达水平降低，提示患者预后良好，对治疗反应好。
图3显示了患者(#15)应用WF10治疗后，促炎细胞因子基因表达的变化。基因表达水平在开始时比较低，治疗期间也没有变化，提示治疗并非必需，患者预后良好。
图4总结了实施例2研究的患者的特征。患者入选了一项前瞻性II期临床研究，该研究评价了WF10治疗HCV所致疾病的潜力。这些患者有用于研究的基线血液样本和肝脏活检标本。所有患者的病史和标本获得均符合人类研究委员会通过的标准协议。急性感染患者未评价WF10的治疗效果，但这些患者都转诊给研究医生。患者标本应用同一人类获准标准进行评价。8名慢性HCV感染患者具有基线人口统计学资料和实验室检查数据。患者不是通过任何标准进行筛选，除非这些患者在入选WF10临床试验前抽过血，并在抽血2周内进行过肝脏活检。HCV基因表达水平和肝功能检测的实验室数据也在这2周的窗口期获得。患者的肝脏活检标本由病理学家进行独立评价，并根据标准4点分级体系进行炎症分级评分。只有在基因表达评价结束后，才将所有涉及肝脏活检、实验室检查和基因表达的数据汇总，进行最终分析。该研究中只有患者4以前接受过干扰素和Ribivarin的治疗，但在入选研究前3个月未进行任何治疗。
图5显示了急性和慢性HCV感染患者PBMC的免疫激活基因表达。
图6A显示了患者真实的基线基因表达值和GES，所述患者的资料总结于图5。
图6B显示了患者真实的诱导基因表达值和GES，所述患者的资料总结于图7。
图7显示了急性和慢性HCV感染患者PBMC的诱导基因表达。
图8显示了HCV感染患者未受刺激的PBMC的多基因表达评分。
图9显示了用于MGES值计算的评分体系。
图10显示了HCV感染患者受到刺激的PBMC的多基因表达评分。
发明详述
本发明提供了通过检测一套预选基因表达水平而在患者中确定临床预后的方法。这些基因表达水平需要与参考标准进行比较，与标准水平的差异可以提示临床预后。基因表达水平可以在几乎所有临床标本中进行检测，包括组织和体液，如脑脊液。但令人惊异的是，发明者发现，血液样本中测定的基因表达水平可以提示临床预后。这一点令人惊奇，是因为血液一直被认为是机体的静止器官，而且测定血液中基因表达水平一直被认为价值很小或毫无价值。特别是，可以应用血液细胞进行细胞内基因表达水平检测。当然，应用血液也使临床样本的获得和分析变得更加简单、方便，而且损伤更小。
基因表达水平的检测
本发明方法中应用的基因表达水平可以通过任何现在已知或将来可能发展的方法进行检测，所述方法可以提供关于检测水平的定量信息。优选的方法高度敏感，而且可以提供可重复操作结果。在另一个实施方案中，采用了基于核酸扩增技术的方法。特别是基于聚合酶链反应(PCR)和相关扩增技术的方法，例如可以应用NASBA和其他等温扩增技术。更特别的是，可以考虑应用被称之为“RT-PCR”的方法，该方法先逆转录mRNA，然后扩增获得的cDNA。
实施定量PCR的方法本领域众所周知。见，例如美国专利5,210,015和5,487,972，以及EP512334B1，在此全文引入，作为参考。进行定量PCR和RT-PCR的商用设备可以从以下厂商处购得，如PE AppliedBiosystems，850 Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404；RocheMolecular Systems，Inc.，1145 Atlantic Avenue，Alameda，CA94501；RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN。在一个特定实施方案中，应用了Roche Molecular Biochemicals出品的LightCycler设备。该设备可以按照下述厂家使用说明书进行操作。用于扩增任何已知基因的引物对可以应用本领域众所周知的方法进行设计，例如，可以应用公共数据库如GENBANK的基因序列和引物设计软件如OLIGO进行引物设计。很多基因的引物对可以通过商业渠道进行购买，如在下述厂商处购买——PEApplied Biosystems，Roche Molecular Biochemicals，Roche Diagnostics以及Search-LC(Heidelberg，Germany)。
用于检测基因表达水平的样本
患者中任何可以方便得到的组织样本均可用于基因表达水平的检测。在特定实施方案中，样本可以是血液、脑脊液和来自活检或脱落物的细胞组织，例如来自胸壁的脱落物。在一个实施方案中，样本是可以通过最小损伤方法容易得到的外周血单核细胞。用于基因表达分析的样本制备方法是本领域众所周知的，并可通过购买的试剂盒进行。
确定临床预后
获得的基因表达水平优选与同一样本的参考基因进行比较和标准化。典型的，一般应用“管家”基因如肌动蛋白进行该标准化。其他“管家”基因也是本领域众所周知的，如HPRT，CPB和G6PD。
为了确定临床预后，来自临床样本(备检患者)的基因表达水平要与参考样本进行比较。典型的参考样本来自健康个体，该个体健康，或者没有罹患与备检患者相同的病理学疾病或综合征。优选地，在多数健康个体中测定感兴趣基因的表达水平，然后计算平均值。在一个特定实施方案中，在与备检患者性别、年龄均相同的个体中测定参考水平。在另一个实施方案中，这些参考水平从数据列表中获得，在所述数据列表中，数据汇编自适宜性别和年龄的健康个体。
能够预测(提示)临床预后的基因表达相对水平可以是较高的表达水平，也可以是较低的表达水平。例如，如下所示，在感染HIV的患者中，促炎细胞因子表达水平增加，提示临床预后不良(例如，长期存活的预期降低)，所述促炎细胞因子如TNF-α，IL-6，IL-1，IL-8，IP-10和MIP-1α。在患者应用抗HIV化合物进行治疗时，可以再次检测这些促炎细胞因子的相对水平。如果细胞因子水平下降，提示患者对治疗反应良好。在这种情况下，患者的临床结果可能是，停止抗HIV治疗，或者降低抗HIV化合物的剂量。缺乏反应可能提示该患者对治疗无反应，因此预后不良，或者需要增加抗HIV化合物的剂量，或者必须采取其他治疗干预措施。缺乏反应还可能提示治疗并未阻止或延缓疾病的发展。
尽管本发明特定考虑的是测定促炎细胞因子表达水平用以预测临床预后，但经验丰富的技术人员应该能够认识到，本发明并非如此有限。而且，如上所述，鉴定基因表达变化的方法在本领域众所周知。尽管这些方法在定量方面并不足以用于本发明，但它们可以用来预测在某一疾病状态下哪些基因的表达发生了变化。然后可以应用定量检测方法，如定量RT-PCR来检测基因表达的变化。这些变化可以在患者中进行追踪，并用本领域众所周知的方法将这些变化与临床预后相关连。
因此，对于任何给定疾病，都可以开发出确定临床预后的预测方法。下面的讨论阐述了巨噬细胞激活过程中的基因表达水平，并描述了这些基因表达水平以及在应用特定药物(WF10)治疗后这些基因表达水平的变化如何为罹患慢性炎症性疾病的患者提供临床预后信息，所述慢性炎症性疾病例如慢性肝炎，乙型肝炎和丙型肝炎，慢性阻塞性肺病，炎症性粘膜病，自身免疫性疾病，痴呆，心血管疾病和肿瘤。炎症性粘膜病可以选自，例如，炎症性肠病，克隆病和结肠炎。痴呆可以是，例如AIDS相关性痴呆或阿尔茨海默病。肿瘤可以说，例如淋巴瘤，前列腺癌或结肠癌。下面的实施例2还表明，本发明的方法可以用来预测丙型肝炎患者的临床预后。本发明的方法还可用来探测或预测进行同种异体移植患者发生移植排异反应的临床预后，所述移植物如心脏，肝脏，肾脏或其他器官。因此，炎症细胞因子基因表达的改变，特别是增加，提示同种异体移植物发生排异反应。可以检测并用来探测同种异体移植排异反应的特定基因表达水平包括IP10，TNFα，δ-IFN和其他巨噬细胞炎症基因。
巨噬细胞的激活
WF10是稳定的亚氯酸盐基质，获准以系统给药方式(WF10)或浓度更小的外用给药方式(Oxoferrin)用于临床。见Kuhne，Die erwunschteSauerstoffaktivierung，dokumentiert am Beispiel der Wundheilung：der Wegzur Oxoferin-Therapie.In：Elsmer E.F.，Bors W.，Wilmanns W.(eds.)：Reaktive Sauerstoffspezies in der Medizin.Springer Verlag，Berlin 1986，pp.5-15。在泰国，WF10业已获准以系统给药的方式用于放射后综合征患者的治疗以及肿瘤治疗患者的支持性治疗。这些适应证业已经过深入研究，并进行了总结回顾。见Raffanti et al.，Infection 26：201-206(1998)。Oxoferrin局部应用主要用于加强慢性创口的愈合，例如糖尿病溃疡。Hinzet al.，Lancet 1：825-828(1986)。机体中WF10的主要反应靶细胞是巨噬细胞和树突状细胞群。它们通常会被简单地称为巨噬细胞，因为两种细胞群是从同一种前体细胞衍生而来的。应用最新提出的平衡的巨噬细胞激活理论，可以最好地理解WF10的体外和临床效应。图1是巨噬细胞激活周期的示意图，其中，在多种形式的巨噬细胞功能激活和再循环过程中，发生多个步骤，最终达到巨噬细胞激活平衡。巨噬细胞激活周期中的每一个步骤都被编号(1-5)，并将逐步加以阐述。
1.在巨噬细胞激活过程中发生的第一事件是外源物质的吞噬作用。巨噬细胞将病原微生物如细菌、真菌和病毒进行吞噬。这是巨噬细胞最经典也最重要的功能，也是巨噬细胞获得这个称谓的原因。“巨”是大的意思，“噬”是吃的意思，因此巨噬细胞意味着“大吃者”。在成功吞噬外源物质后，巨噬细胞通过蛋白水解途径处理该物质，并将各种蛋白质水解成更小的肽，这些肽涉及巨噬细胞激活的第二个步骤。
2.抗原提呈：在外源物质裂解成肽之后，巨噬细胞应用主要组织相容性抗原簇1(HLA)和2(DR)将抗原提呈给T淋巴细胞，正常免疫反应启动展开。T细胞激活的发生主要是通过这种抗原提呈细胞功能。然后产生了特异性针对病毒感染细胞、肿瘤细胞或真菌的标准细胞毒T细胞，这些细胞毒T细胞最终导致这些外源物质的成功免疫清除。这在图1中显示为主动免疫反应。主动免疫反应成功激活后，T细胞表达多种激活抗原，如CD38，分泌多种细胞因子，如白细胞介素2(IL-2)。IL-2可以使T细胞增殖，γ干扰素(γ-IFN)可以导致巨噬细胞的进一步激活，并进入步骤3。
3.经典巨噬细胞激活路径：T细胞激活产物γ干扰素可以诱导全部炎症改变和经典巨噬细胞激活。这种激活导致炎症细胞因子如IL1，IL6和肿瘤坏死因子(TNF)的上调。处于该阶段的巨噬细胞炎性更强，可以导致一些继发效应出现，如发热，并且当这种刺激长期存在时，就会发生体重减轻和非特异性免疫应答的进一步激活。
4.TH1向TH2(活性T细胞向抑制T细胞)的转换：在最终导致细胞毒T细胞和产IL2T细胞(TH1细胞)产生的细胞免疫启动过程中，第二族主要T细胞(TH2细胞)也被诱导，该类细胞主要涉及B细胞的激活，并为巨噬细胞激活平衡提供信号。TH2细胞产生的细胞因子包括IL4，IL5，IL6和IL10。这些因子导致B细胞激活，B细胞增殖，高γ球蛋白血症，上调IgE、变态反应，以及嗜酸细胞增多症。IL10过度产生的净结果就是图1所示反应步骤2的关闭。在体外，TH1和TH2细胞的激活过程几乎同步发生(体内也很可能是这样)，但是体外通过T细胞增殖来检测的经典免疫应答反应主要检验了TH1样反应。TH2反应的主要特征是产生IL4，已知该物质可以激活巨噬细胞替代激活路径(AMAP)(步骤5)。
5.AMAP：替代巨噬细胞激活路径(在参考文献4中有总结回顾)具有如下特征：
a.产生血管生成因子
b.抑制T细胞应答
c.与炎症介导因子产生下调有关，而这种炎症介导因子的产生是步骤3所述经典巨噬细胞激活的特征。
随着对AMAC-1(替代巨噬细胞激活趋化因子-1)的克隆和分子研究，最近已经证实，替代巨噬细胞激活途径是一种独立存在的路径(Kodelja et al.，Journal of Immunology 160：1411-1418(1998))。AMAC-1也被成为巨噬细胞炎症蛋白4(MIP-4)。只有在巨噬细胞被诱导进入替代巨噬细胞激活路径时，才可以检测到AMAC-1/MIP-4基因。替代巨噬细胞激活路径的二级副产品是在巨噬细胞中出现的吞噬现象，所述巨噬细胞被诱导进入替代巨噬细胞激活路径。这种副产品提供了完成整个平衡的巨噬细胞激活路径再循环的潜在信号。
该示意图是将平衡的巨噬细胞激活理论作为一个周期提出的，其中，在免疫应答过程中涉及的巨噬细胞要经过步骤1-5。因为它的周期循环特征，正常免疫过程不会过分强调路径中的任何步骤，只是让它们保持平衡。
巨噬细胞激活平衡紊乱涉及的疾病
多种病理过程都可能打乱巨噬细胞的激活平衡，而不平衡的巨噬细胞激活也是很多慢性疾病的原因。这些不平衡的实例如下：
慢性病毒感染：当外源病毒不能被免疫应答成功清除时，图1中的步骤2和3将被持续刺激，这会导致巨噬细胞激活平衡的重新建立。可以预见，这种免疫过度刺激将导致病理学结局，如慢性乙型肝炎和丙型肝炎的肝硬化和肝癌，以及HIV感染性疾病中严重的免疫功能失调。在步骤2和3过分被强调较长一段时间后，可以预期，完成步骤5和1的细胞将发生短缺。TH1细胞群也会发生过度驱动，其表现是高度激活的T细胞。步骤3过度激活的临床表现是长期发热，以及伴随的体重减轻。慢性病毒感染患者，如HIV感染者还会发生显著的TH1向TH2的转移，如图1步骤4所述。平衡的巨噬细胞激活理论推测，该转移是一种T细胞的自然补偿机制，试图通过产生正常情况下可以诱导步骤5发生的细胞因子IL4来调节巨噬细胞激活平衡。这种情况发生在慢性病毒感染患者身上，可能成为慢性炎症状态的副产品。这些包括炎症介质和炎症细胞因子的过量产生，导致继发的免疫病理变化。这些变化在HIV感染性疾病中表现为过度的炎症状况导致继发于巨噬细胞炎症区隔高度激活后的痴呆、肾脏疾病、淋巴瘤和消耗综合征的发生。如上所述，慢性病毒感染性疾病的继发副产品还可能是步骤5和1中细胞的耗竭。这一结果将导致创口愈合速率的下降，以及相关血管形成和吞噬功能的下降。在慢性病毒感染患者中，由于具有吞噬功能的细胞数量减少，使新的感染微生物如细菌和真菌的清除变得不力。
自身免疫性疾病：在炎症相关性免疫反应性淋巴细胞过度刺激方面，自身免疫性疾病与慢性病毒感染性疾病类似。多年来，自身免疫性疾病一直被认为是一种慢性病毒样疾病，但是迄今为止尚未分离出一种能够启动这类疾病的病毒。这些疾病包括系统性红斑狼疮(SLE)，放射后综合征以及多种自身免疫性肾病等。一些自身免疫性疾病的特征是，如图1步骤4所述，出现高γ球蛋白血症，IgE水平升高和嗜酸细胞增多症。这一结果可能是在机体试图重建巨噬细胞激活平衡时，发生补偿性TH1向TH2转移的副产品。
变态反应：最严重的变态反应是哮喘，其中肺中的环境抗原使步骤2过度刺激，导致肺组织局部发生不适宜的巨噬细胞炎症改变和T细胞激活。这些肺组织受到步骤3产生的炎症介质的损伤。正常情况下，肺脏巨噬细胞遵循替代巨噬细胞激活路径(诱导)(如步骤5所示)，因此，这些细胞不容易进入图1所示的步骤2和3。但是在过敏患者中，这些反应(步骤2和3)却可以发生。哮喘患者也存在TH1向TH2的转移，伴随嗜酸细胞增多。平衡的巨噬细胞激活理论认为，该反应是肺脏巨噬细胞试图从步骤2、3转移到步骤4、5所做的补偿。
细菌和真菌感染相关性免疫缺陷：如果图1中的步骤2和3增强，那么一段时间后，具有吞噬功能和再启动免疫应答功能的步骤5和1中的细胞就减少了。这种具有吞噬细菌和真菌能力的细胞数量的减少，使免疫缺陷患者的存活相当成问题。除非侵袭微生物被巨噬细胞或粒细胞吞噬，否则体内针对细菌和真菌的抗生素治疗将毫无效果。除非真菌被吞噬细胞吞噬，否则连最常用的抗真菌药物两性霉素B也根本无法发挥作用。晚期HIV感染患者对侵袭性真菌感染非常易感，主要是因为患者没有有效的吞噬功能。在应用环孢菌素A和强的松治疗移植排异反应的器官移植患者中，也可以诱导类似的疾病过程。这些患者免疫功能受到抑制，如果他们受到细菌或真菌的侵袭感染，他们的巨噬细胞将转移到步骤2和3，同样不能再循环或获得巨噬细胞激活的平衡，而这种平衡是使吞噬作用和再激活免疫应答反应发生的基础。
慢性创口：这类疾病最好的实例见于糖尿病或卧床患者。慢性糖尿病溃疡和褥疮发生后，创口中巨噬细胞发生的改变与图1步骤3一致。Goerdt et al.，Immunity 10：137-142(1999)。如果步骤3不能转移到步骤5，创口就一直不能愈合，因为步骤5产生的血管生成因子能够使血管生长、愈合。同样，如果慢性创口中的巨噬细胞从步骤1转移到步骤3，吞噬细胞就不会出现，从而不能清除创口内的死亡或将死物质，不能加速愈合过程。
肿瘤：多种肿瘤都是慢性炎症的结果。实例包括淋巴瘤和前列腺癌，前者是抗原过度驱动淋巴细胞的结果，后者则是前列腺炎发展的结果。在这两种情况中，步骤2和3提供了慢性生长刺激。
体外研究WF10的免疫功能活性：
体内WF10可以在易于达到的水平完全阻断T细胞应答的抗原激活。McGrath et al.，Transplantation Proceedings，30：4200-4204(1998)。T细胞激活的这种抑制作用只有在T细胞和巨噬细胞与外源抗原同时存在时才发生，并且可以立即发生，甚至在7日T细胞激活法的第6天加入也会发生。这些数据表明，WF10在抑制图1步骤2所示的正常T细胞基本激活过程中特别有效。
WF10可以导致图1步骤3所述炎性巨噬细胞产生的炎症细胞因子的下调。McGrath et al.，Abstract#2046，Keystone Symposia on Molecular andCellular Biology，Park City，UT，March 13-19，1998。目前进行的研究正在检测WF10是否能够上调AMAC-1，并因此从步骤3转移到步骤5，体外完成BMA周期。
体内应用WF10达到BMA：
WF10和Oxoferrin业已广泛应用多年，用来治疗人类慢性疾病。Oxoferrin在上世纪80年代后期获准局部用于慢性创口。迄今为止，Oxoferrin已经成功用于诱导慢性创口的快速愈合，包括糖尿病溃疡和褥疮。目前认为Oxoferrin主要通过达到巨噬细胞激活平衡并伴随血管生成因子和巨噬细胞吞噬作用的上调而发挥作用。1997年，WF10在泰国获准系统给药，用于治疗放射后综合征(PRS)。放射后综合征作为一种晚期并发症发生于接受过X线放射治疗的器官。高达15％接受下腹部放射治疗的宫颈癌或前列腺癌患者会发生PRS，在放射治疗后6个月-10年发生膀胱和直肠出血。组织学分析显示，出血是局部小动脉发生自身免疫过程(动脉内膜炎)导致的。这导致放射野范围内组织的死亡，并导致出血，例如，出血进入膀胱或直肠。患者有时对类固醇治疗出现暂时性反应。但是，泰国进行的研究显示，在继发于放射后综合征的出血性膀胱炎女性患者中，对系统应用的WF10的完全反应率几乎为100％。与类固醇治疗只能缓解部分症状不同，迄今为止，应用WF10可以治愈放射后综合征患者。
目前有关WF10的临床研究正在美国进行，研究应用WF10治疗HIV感染患者。接受2周期WF10治疗的患者显示了慢性免疫功能改变，与巨噬细胞激活平衡的诱导一致。Herndier et al.，Abstract#22417，12thWorld AIDS Conference，Geneva，June 28-July 3，1998。典型的慢性病毒感染，HIV感染患者在疾病末期显示不适宜的T细胞激活增强，巨噬细胞吞噬率减弱。在旧金山总医院进行的II期研究中，应用WF10不仅与所有不适宜升高的免疫激活标志物的显著下调有关，而且与研究开始时基线吞噬功能水平较低患者的巨噬细胞吞噬功能的上调相关。这些结果与巨噬细胞激活平衡的诱导一致，并将导致进一步的体内研究，检测平衡的巨噬细胞激活理论的其他组分。
总之，影响巨噬细胞激活平衡的疾病非常常见，而且慢性疾病的很多不良反应的发生是因为在上述任一步骤积聚的巨噬细胞介导的毒性副作用。目前，WF10是仅有的一种可能影响巨噬细胞激活平衡并处于临床开发期的新药，并预期可能改变上面部分A-F所述疾病的临床预后。
应用含有稳定的亚氯酸盐溶液的水溶液治疗创口和感染是本领域众所周知的。美国专利号4,507,285和4，725,437以及EP0200157描述了在人类应用稳定的亚氯酸盐溶液刺激创口愈合的反应，以及治疗由寄生虫、真菌、细菌、病毒和/或支原体导致的感染，所述三项专利在此全文引入，作为参考。Kuhne et al.，欧洲专利号200,156描述了在放疗时联合应用稳定的亚氯酸盐溶液，可以帮助放射损伤组织的修复，减少不良反应。该专利在此全文引入，作为参考。
本发明治疗的优选实施方案包括给需要的哺乳动物应用被称之为“四氯十氧阴离子复合物”的水溶液，该复合物通常缩写为“TCDO”。该物质可以通过美国专利号4,507,285(“专利’285”)中实施例1所述的方法进行制备，它是清澈的水溶性液体，易与乙醇混合，熔点为-3℃。Raman频谱显示403,802(氯)和1562cm-1(活性氧)带。经验丰富的技术人员应该认识到，任何化学稳定的亚氯酸盐溶液都可用于本发明的方法，而且本发明的范畴也不限于应用专利’285所述的产品。
通过参考下述实施例，可以更好地理解本发明，但是这些实施例只是为了更好地阐述本发明，而非有意限制本发明。在实施例中，“WF10”指稳定的亚氯酸盐水溶液。实施例1方法
样本制备
应用Leuco Sep试管(#227290，Greiner Labortechnik，Frikenhausen，Germany)在HistopaqueTM1077上密度梯度离心，分离单个核细胞(MNC)，然后将2×106个细胞再悬于含10％ FCS的RPMI1640中。应用有丝分裂原抗-CD2混合物(终浓度分别为1ug/ml的AICD2M1、AICD2M2，以及300ng/ml的11F1)、抗-CD3(OKT-3，100ng/ml)或10ng/ml PMA和0.5ug/ml离子霉素刺激培养物。将已经刺激或未经刺激的培养物在37℃7％CO2的条件下，加入或不加入终浓度为1∶300的WF10，孵育3小时。收获细胞，再悬于200ul PBS中，然后加入400ulHigh-Pure裂解溶液。获得的裂解产物储存于-70℃。37℃解冻10分钟后，应用总RNA分离试剂盒抽提RNA，然后在旋转柱上洗脱RNA，洗脱体积为50ul。应用AMV-RT和寡dT作为引物逆转录8.2ul RNA(cDNA合成试剂盒)。作为对照，在没有逆转录酶存在的情况下也进行一次反应(无RT对照)。cDNA合成反应结束后，将反应混合物稀释至500ul，然后储存于-20℃，直至进行PCR分析。
LightCyclerPCR
根据生产厂商的使用说明书，应用LightCycler FastStart DNA SybrGreen 1试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)和LightCyclerPrimer Sets(Search-LC，Heidelberg，Germany)，扩增靶序列。通过4种管家基因进行输入标准化，4种管家基因分别为β-肌动蛋白，HPRT，G6PDH和亲环素B。
研究设计总述
18名HIV感染成年患者入选了一项开放标签单中心研究，这些患者的CD4+细胞计数＞50/mm3，并应用获准的抗HIV药物治疗。入选者参与了该初级研究大约12周。患者被分为两组，每组9名患者：其中9名患者CD4+细胞计数＞300/mm3，另9名患者CD4+细胞计数＞50/mm3但＜300/mm3。只有病毒负荷＜20,000拷贝/mL的患者才能入选该研究。9名血浆HIV RNA水平低于可检测限的患者没有入选该研究。
在筛选评价完成后，符合条件的患者在第1、2和4天参加了研究访问。在第8-12天，患者接受了1个周期的WF10治疗，剂量为0.5mL/kg体重，然后应用生理盐水稀释到250-500mL，静脉注射。然后患者在第15、17、19、22、24和26天参加研究访问。
在第29-33天，患者接受了第2周期的WF10治疗，剂量为0.5mL/kg体重，然后应用生理盐水稀释到250-500mL，静脉注射。然后患者在第36、38、40和47(最后一次访问)天参加研究访问。患者有一个48小时窗口，在此患者可以在第47天进行最后访问。
在第1、8、11、15、22、29、31、40和47天进行免疫功能检测，检测的免疫功能指标包括应用荧光素标记的大肠杆菌检测的吞噬指数、植物血凝素刺激的T细胞激活、淋巴细胞免疫表型分类(检测CD3，CD4，CD8，CD14，CD20，CD28，CD38，CD56，CD60)、DR、TNF和单核细胞计数。
在第47天之后，每月一次电话随访所有患者的健康状况，随访1年。结果
临床试验
在完成47天研究的患者中，有7人开始时CD4细胞计数＜300/ul，这些患者对两周期各5天的WF10静脉注射治疗显示了最显著的免疫学参数反应。CD4和CD8细胞计数显著上升，CD8细胞数量的升高可以通过CD8/38阴性亚群数量的增加得到完全反映。在该试验过程中，CD38中数表达水平全面显著，但不伴随HIV病毒负荷的改变。其他免疫学激活指标下降类似，可以观察到CD14/DR，CD20/DR和CD4/38平均细胞相关性荧光水平的显著下降。
WF10试验中PBMC基因表达分析
应用基于Lightcycler技术的方法，在冷冻随后抽提的细胞制剂中评价了炎症相关性PBMC的基因表达。图2显示了在47天试验过程中，相对于CD8/38没有变化的#15患者，CD8/38+细胞亚群下降50％的#14患者的一系列促炎基因的相对水平(相对于内部管家基因，肌动蛋白、G6PD、CPB、HPRT)。患者15的基因表达水平在图3给出。结果显示，在CD8/38水平下降和图2所示巨噬细胞促炎基因表达变化之间存在高度全面显著的相关性。
WF10对体外PBMC和CD14细胞基因表达的影响
体外检测WF10对PBMC的作用以确定该药物对T细胞激活的影响，所述PBMC暴露于抗CD2、抗CD3和PMA/离子霉素。所用WF10的终浓度为1∶300，该剂量在临床试验中易于达到，3小时后收获PBMC，18小时后亲和纯化CD14细胞，用来抽提RNA和进行RT-PCR。WF10对11例正常献血者PBMC的影响用LC指数表示，该指数显示，受到刺激但未(接受WF10)治疗的基线标本存在高达5倍的变化。还观察到诱导淋巴刺激细胞因子IL-2和IL-17的一致下调，以及IL-1β、IL-8、MIP-1α和硫氧还蛋白(TRX)的一致上调。因为上调的似乎是巨噬细胞炎症介质，因此将纯化CD14细胞暴露于1∶300的WF1018小时，然后评价增加的基因表达。7例CD14制剂中有3例显示4种管家基因水平下降大约90％。3例CD14标本在评价的4种凋亡基因中也显示了显著上调，平行的PI摄取研究进一步确定，CD14细胞在这些培养物中确实发生了凋亡。在他们应用WF10治疗前，还测定了用于巨噬细胞研究的PBMC的基因表达水平。结果发现，这些凋亡标本的治疗促炎基因表达水平显著高于那些未发生凋亡的标本。
WF10治疗可以导致体外AMAC-1上调
凋亡细胞是巨噬细胞发生替代(抗炎症)激活和吞噬作用的最具潜力的刺激因素。替代激活伴随着Th2细胞因子IL-4的诱导，并导致炎症基因表达和抗原诱导的T细胞激活的完全阻断。纯化的巨噬细胞暴露于1∶200稀释的WF10，然后在长达21天后评估AMAC-1(特异性替代路径，AMAP)的基因表达。WF10可以显著增加IL-4处理的巨噬细胞诱导的AMAC-1的表达。
这些数据显示，应用WF10导致的巨噬细胞促炎基因表达变化与体内CD8/38水平变化相平行。在一部分预激活的患者标本中，体外WF10可以导致大量免疫活性基因的显著改变，这些变化可以导致CD14细胞的凋亡，与PBMC淋巴刺激基因的下调一致。很显然，WF10可以通过过度激活诱导CD14细胞死亡，补偿诱导巨噬细胞激活替代(抗炎)路径，调节与慢性炎症性疾病如HIV感染性疾病相关的不适宜炎症。
总之，上述研究显示：
1)给HIV+患者(CD4细胞计数＜300/ul)应用WF10，可以显著
a)增加CD4，CD8，CD8/38-细胞数量
b)降低CD20/DR，CD14/DR，CD4/38平均荧光/细胞
c)降低PHA激活
2)PBMC Lightcycler系统RT-PCR显示，与药物相关的巨噬细胞炎症基因(TNF-α等)表达下调。
3)WF10对正常PBMC(3小时)和CD14(18小时)细胞影响的体外研究显示：
a)激活的PBMC：下调淋巴刺激细胞因子IL-2和IL-17。上调巨噬细胞炎症基因以及抗凋亡(抗氧化)基因硫氧还蛋白(TRX)。
b)培养的CD14细胞：在含有预处理的炎症基因水平上升的标本中，上调凋亡基因(BAX，BCL-X1，CD95，CD95L)，并伴随凋亡细胞(CD14)的死亡。
4)在分离的CD14细胞中，WF10可以导致替代巨噬细胞激活基因AMAC-1的后期上调。
5)该现象尚不能用现存的任何理论进行解释，但发明者相信，在含有炎症基因表达水平上升的标本中，WF10诱导的巨噬细胞死亡可以在巨噬细胞中补偿诱导AMAP，作为对炎性巨噬细胞急性凋亡的反应。因此，WF10可以通过急性上调炎症基因表达下调炎症，通过凋亡导致细胞死亡，下调淋巴刺激基因并诱导巨噬细胞补偿性分化，进入AMAP，抗炎途径。
这些观察显示，WF10可以在体内导致病理性炎症(HIV感染相关性疾病病程)的逆转，一段时间后预期可以出现长期临床利益。免疫状态的改变可以通过定量基因表达技术进行检测。该检测可以用来长期检验治疗患者，迅速鉴定需要进一步WF10治疗的病理状态的回复。实施例2简述
从图4描述的9名患者和20名正常献血者中分离外周血单个核细胞。如上所述，检测基线以及PMA/离子霉素刺激细胞的基因表达水平。应用2个管家基因(β-肌球蛋白，CPB)作为细胞基因表达的全面对照，在此基础上进行定量评估。然后将“检测”的基因表达水平标准化至标准“管家基因”对照水平。在该研究中选择评价了13种与巨噬细胞和T细胞激活相关的基因，因为它们在初级免疫应答和慢性炎症中具有作用。基因包括IL-1，IL-2，IL-4，IL-8，IL-10，IP10，MCSF，TNFα，γ-IFN，MIP-1α，MIP-2α，MRP-14和TGF-β。通过评价20名正常献血者基因表达水平，建立了管家基因和炎症基因的正常值。
在罹患急性HCV感染的患者中检测了基线基因表达水平。图5以基因表达评分(GES)的形式显示了定量分析结果，其中每个基因获得的定量值以评分的形式给出，该分值是该基因表达水平与正常基因表达平均水平的比率，基因表达的正常平均水平是从20名正常献血者中测定的。在急性感染患者中基因表达水平最高的是IP-10基因，已知该基因由γ-干扰素特异性诱导。与IP-10水平升高伴随的是预期γ-干扰素水平的升高以及检测的大部分巨噬细胞炎症基因水平的升高(如GM-CSF和TNF-α)。以基线/正常值表达的基因包括IL-2，IL-4，IL-8和IL-10。应该指出，该基因表达图象是从患者血液而非肝脏或淋巴结分离的未经刺激细胞中观察到的。
8名慢性感染患者血液基因表达平均值显示的基因表达图象与急性感染标本相似，一致显示为持续的免疫应答。但是，慢性HCV感染的实际GES值在患者之间相差非常大。图5给出了每个基因的平均值。图6A(基线)和图6B(PMA诱导)显示了实际基因表达值和GES。这种在血液中检测到的持续反应如果也存在于肝脏，就会导致进行性炎症损伤，与在进行性HCV肝病中观察到的一致。
应用肝脏活检分析的早期研究预言，在HCV感染性疾病患者中可以观察到T细胞的过度激活。见Burgio et al.，Hepatology 27：1600-6(1998)；McGuinness et al.，Gut46：260-9(2000)。为了检验这一预言，从急性和慢性HCV感染性疾病患者分离了外周血单个核细胞，并用PMA和离子霉素进行刺激。急性HCV感染患者的基因表达图象并非如预期所示(见图7)。而且，急性感染患者中诱导的IL-2和IL-10基因表达水平显著低于对照值(在正常GES范围之外)，提示存在与HCV感染相关的T细胞激活的抑制。这种T细胞激活的抑制以及γ-干扰素产生的抑制却伴随着巨噬细胞炎症细胞因子和趋化因子基因的持续升高，如正常情况下由γ-干扰素诱导的IP-10。该观察结果提示，图5中观察到的IP-10值和γ-干扰素基因表达水平的升高可能不是T细胞的产物，因为该基因的诱导性受到显著抑制。理论上，血液细胞中除了T细胞，能够产生干扰素基因表达的另一唯一来源就是自然杀伤细胞群，已知该细胞群在病毒感染患者中也具有活性，并启动免疫应答。与在急性HCV感染中观察到的T细胞激活抑制一样，8名慢性HCV感染患者的平均GES值也显示了T细胞激活抑制和慢性巨噬细胞激活的图象。
图6B和7显示的数据与以前报道的HCV肝脏疾病患者试验研究相反，以前报道的试验结果显示，IL-2水平上升，T细胞在蛋白水平过度激活。见Martin et al.，Cytokine 11：267-73(1999)。为了确定观察到的基因表达图象是否与肝脏炎症病理损伤程度相关，对相应的肝脏活检标本进行了阅片，并应用标准评价标准给出了炎症分级评分。图8显示了肝脏炎症评分和应用GES值进行的评分体系之间的相关性，所述GES值来自本研究测定的炎症基因(图9)。在MGES(多基因表达评分)和肝脏炎症程度之间可以发现高度相关性。
肝脏炎症的组织学严重程度与诱导的基因表达分析相关(图10)。在疾病的早I期，观察到诱导基因表达的最强抑制。随着肝脏炎症的进展，抑制程度逐渐逆转，到炎症III期，基因激活程度甚至升高，与以前的报道一致。IL-10表达的诱导甚至在晚期患者中也持续很低(图6B)。
为了测定MGES评估与目前标准检验方法(即血液ALT检测和HCV病毒负荷定量检测)的关系，我们将图4显示的每名患者的ALT值和HCV病毒负荷与肝脏炎症程度进行了相关性分析，与图8和10所示的研究方法类似。结果显示，ALT检验(r2：24)和病毒负荷定量检验(r2：.15)与肝脏活检炎症评分均不相关，与MGES形成鲜明对照(图8和10分别为r2：0.94和0.78)。
这些数据表明，HCV感染性疾病患者的评价有了一个全新的检测系统。血液基因表达图象与肝脏炎症的高度相关性使我们可以对HCV感染患者进行分期。特别是快速RT-PCR方法的应用，为我们提供了评价肝脏原位炎症程度的临床参数，与以前的方法相比，新方法更快捷，危险性更小，也更便宜。材料和方法
急性和慢性HCV感染患者PBMC的免疫激活基因表达
从1名急性感染患者和8名图4所述患者中抽取血液样本。FicollHypaque分离后，将PBMC置于37℃、含10％胎牛血清的RPMI 1640中3小时，然后洗细胞，抽提RNA。对Heidelberg，Germany，UniversityBlood Bank的20名正常血库献血者的血液样本进行相同处理。如上所述合成cDNA，并进行基于LightCycler的PCR反应。每个样本进行RT-PCR时包括4个内部管家基因；这些基因包括β-肌球蛋白，HPRT，CPB和G6PD基因。这4个基因被用来标准化每个样本所含的RNA量，所有基因表达评分(GES)也都根据内部标准化的管家基因拷贝数正常数据进行测定。根据标准化的管家基因拷贝数量，可以计算出图6所示的每个基因的拷贝数。
应用PCR引物(Search-LC，Heidelberg，Germany)评价了13种基因。建立20名正常献血者(13种基因)的基因表达平均值，该值作为13种评价基因的基因表达评分1分。图5显示的数据代表急性(A)和8名慢性(C)HCV感染患者平均血液样本中推导的拷贝数。图5在每个值下面显示了20名正常献血者的GES范围，包括20个值的绝对最低值和最高值。图5中给出的数据代表所有患者基因表达的一次测定结果，其中1个代表急性感染(A)，8个患者结合起来代表慢性感染患者的平均值。慢性感染患者的基因表达值变化很大，结果在图6给出。
急性、慢性HCV感染患者PBMC的诱导基因表达
如上所述，从急性、慢性HCV感染患者和20名正常献血者中抽取血液。分离PBMC，在37℃培养，如前所述，培养基含有PMA和离子霉素，诱导急性T细胞激活。如上所述，孵育3小时后收获细胞，抽提RNA，进行基于LightCycler的PCR反应。根据管家基因表达水平进行基因表达标准化，然后计算图7所示的GES。图7所示的数据代表与根据20名正常献血者标本计算的平均GES相比，急性HCV感染者的GES和8名慢性HCV感染者的平均GES。图7下部也给出了20名正常献血者每个基因的范围，包括最低值和最高值。图7显示的数据可以分为2类：代表T细胞激活的基因和代表巨噬细胞激活的基因。图10比较了急性感染(A)和8名慢性HCV感染患者的平均值。慢性感染患者的数值变化很大，在图6B中给出。
HCV感染性疾病患者未经刺激PBMC的多基因表达评分
图6所示的基因表达值以及推导的GES值根据肝脏炎症评分进行分层，所述肝脏炎症评分是由不参与基因表达评价的病理学家独立给出的。多基因表达评分(MGES)是根据图4所示患者的下述基因的基因表达值测定的(TNFα，IP10，MIP-2α，干扰素-γ和MRP14)。图9给出了每名患者涉及MGES计算的表达基因的GES。然后在肝脏炎症评分的基础上绘制每名患者的MGES计算评分，这些数据在图8给出，其中肝脏炎症评分由独立的病理评价过程给出。20名正常献血者也给出MGES评分，在图中代表正常范围，MGES的范围为0-2，平均值为1。急性HCV感染患者的MGES评分为10。MGES评分与肝脏炎症评分的统计学关系用r2值表示。
HCV感染性疾病患者未经刺激PBMC的多基因表达评分
与用于图8所示数据的MGES计算过程相似，根据图9所示的诱导GES评分也测定了MGES。根据用于评估每种基因的计算GES，然后将其转化为包括所有3种基因的综合MGES评分，得到MGES。给出正常范围，正常范围为-3-0，平均值为1。急性HCV感染计算的MGES为-2.5。MGES评分与肝脏炎症评分的统计学关系用r2值表示。
本发明虽然根据实施例和特别优选实施方案进行详细阐述，但本领域技术人员应该理解，在不背离本发明精神和范畴的前提下，可以对本发明进行多种修饰。上文参考的所有文书均在此引入，作为参考。

Claims (25)

1.为罹患临床疾病或综合征的患者提供评价临床预后的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供患者的临床标本；
(b)在临床标本细胞中测定一套预选基因的细胞内表达水平；以及
(c)将该表达水平与一套参考表达水平进行比较，在这套预选基因中，一种或多种基因表达水平与参考水平的差异可以提示患者的临床预后。
2.权利要求1的方法，其中所述临床标本是血液、组织或脑脊液样本。
3.权利要求2的方法，其中所述临床标本是血样。
4.权利要求1的方法，其中至少测定3种基因的表达水平。
5.权利要求1的方法，其中至少测定1种促炎细胞因子的表达水平。
6.权利要求4的方法，其中至少测定3种促炎细胞因子的表达水平。
7.权利要求6的方法，其中所述基因选自TNF-α，IL-6，IL-1，IL-8，IP-10和MIP-1α。
8.权利要求1-7的任一方法，其中所述临床疾病或综合征是炎症紊乱。
9.权利要求8的方法，其中所述炎症紊乱是慢性炎症紊乱。
10.权利要求9的方法，其中所述慢性炎症紊乱选自慢性肝炎，乙型肝炎和丙型肝炎，慢性阻塞性肺病，炎症性粘膜病，自身免疫性疾病，痴呆，心血管疾病和肿瘤。
11.权利要求10的方法，其中所述炎症性粘膜病选自炎症性肠病，克隆病和结肠炎。
12.权利要求10的方法，其中所述痴呆是AIDS相关性痴呆或阿尔茨海默病。
13.权利要求10的方法，其中所述肿瘤选自淋巴瘤，前列腺癌和结肠癌。
14.权利要求1-13的任一方法，其中所述临床预后是对治疗干预的反应。
15.权利要求14的方法，其中所述治疗干预是应用药物治疗。
16.权利要求15的方法，其中所述药物是稳定的亚氯酸盐溶液。
17.权利要求16的方法，其中所述稳定的亚氯酸盐溶液是WF-10。
18.权利要求1、15、16或17的方法，其中所述临床疾病或综合征是HIV感染。
19.权利要求18的方法，其中所述临床疾病或综合征是AIDS。
20.权利要求1-13、18或19的任一方法，其中所述预期临床预后是在某一预定时间患者存活的可能性。
21.权利要求15的方法，其中所述预期临床预后是6个月后患者存活的可能性。
22.前述权利要求的任一方法，其中基因表达水平是通过定量聚合酶链反应测定的。
23.权利要求22的方法，其中聚合酶链反应是逆转录酶/聚合酶链反应。
24.权利要求23的方法，其中所述聚合酶链反应通过应用荧光法检测扩增产物来进行。
25.权利要求1的方法，其中所述临床疾病是同种异体移植排异反应。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102423318A (zh) * 2004-02-03 2012-04-25 加利福尼亚大学董事会 亚氯酸盐治疗神经变性疾病

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2393136A1 (en) * 1999-11-30 2001-06-07 Oxo Chemie Ag Evaluating and predicting clinical outcomes by gene expression analysis
CN100398663C (zh) * 2001-07-23 2008-07-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于预测癌症复发的评定体系
DE10143712A1 (de) * 2001-08-30 2003-04-10 Europroteome Ag Verfahren, Computersystem und Computerprogrammprodukt zur Datenauswertung
CA2842429A1 (en) * 2001-10-19 2003-05-01 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
EP1319720A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-18 Roche Diagnostics GmbH Method for detection of inflammatory processes
EP1319717A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-18 Roche Diagnostics GmbH Method for detection of inflammatory processes
EP1534739A4 (en) * 2002-01-18 2006-05-31 Bristol Myers Squibb Co IDENTIFICATION OF POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES FOR PREDICTING THE ACTIVITY OF COMPOUNDS THAT INTERACT WITH TYROSINE KINASE PROTEINS AND / OR TYROSINE KINASE PROTEIN PATHWAYS
US20090149335A1 (en) * 2002-02-22 2009-06-11 Biolife Solutions Inc. Method and use of microarray technology and proteogenomic analysis to predict efficacy of human and xenographic cell, tissue and organ transplant
US20030232396A1 (en) * 2002-02-22 2003-12-18 Biolife Solutions, Inc. Method and use of protein microarray technology and proteomic analysis to determine efficacy of human and xenographic cell, tissue and organ transplant
EP3115470B1 (en) 2002-03-13 2018-07-18 Genomic Health, Inc. Gene expression profiling in biopsied tumor tissues
EP1361433A3 (en) * 2002-04-09 2005-02-23 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Method for estimating therapeutic efficacy of tumor necrosis factor (TNF)
EP1354963A1 (en) * 2002-04-15 2003-10-22 Health Research, Inc. Method for determining the prognosis of ovarian cancer
ITFI20030058A1 (it) * 2003-03-06 2004-09-07 Univ Firenze Formulazioni farmaceutiche contenenti tiazolidinedioni
US7191068B2 (en) * 2003-03-25 2007-03-13 Proteogenix, Inc. Proteomic analysis of biological fluids
US8068990B2 (en) * 2003-03-25 2011-11-29 Hologic, Inc. Diagnosis of intra-uterine infection by proteomic analysis of cervical-vaginal fluids
US7483554B2 (en) * 2003-11-17 2009-01-27 Aureon Laboratories, Inc. Pathological tissue mapping
US7467119B2 (en) * 2003-07-21 2008-12-16 Aureon Laboratories, Inc. Systems and methods for treating, diagnosing and predicting the occurrence of a medical condition
US7505948B2 (en) * 2003-11-18 2009-03-17 Aureon Laboratories, Inc. Support vector regression for censored data
AU2011205095B2 (en) * 2004-02-03 2014-07-03 The Regents Of The University Of California Chlorite in the treatment of neurodegenerative disease
WO2005086068A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-15 Aureon Laboratories, Inc. Methods and systems for predicting occurrence of an event
US7761240B2 (en) * 2004-08-11 2010-07-20 Aureon Laboratories, Inc. Systems and methods for automated diagnosis and grading of tissue images
JP5629894B2 (ja) * 2004-12-07 2014-11-26 国立大学法人大阪大学 甲状腺乳頭癌を診断するための新規のマーカー
WO2006091776A2 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Biomarkers for predicting prostate cancer progression
US20070099239A1 (en) * 2005-06-24 2007-05-03 Raymond Tabibiazar Methods and compositions for diagnosis and monitoring of atherosclerotic cardiovascular disease
US8170889B2 (en) * 2005-09-22 2012-05-01 Ubc Late Stage, Inc. Methods and systems for evaluating interaction of medical products and dependence on demographic variables
AU2006331497B2 (en) 2005-12-22 2013-07-04 Neuraltus Pharmaceuticals, Inc. Chlorite formulations, and methods of preparation and use thereof
AU2007244868B2 (en) 2006-04-24 2013-11-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for detecting autoimmune disorders
DE102006062398A1 (de) * 2006-12-20 2008-06-26 Edi (Experimentelle & Diagnostische Immunologie) Gmbh Verfahren zur Erkennung und/oder Charakterisierung zellulärer Aktivitätsmuster, Verwendung von Toll-like-Rezeptor-Liganden (TLR-Liganden) und ein Kit
EP2517713A3 (en) * 2007-06-01 2013-01-30 Nuvo Research AG A method of treating allergic asthma, allergic rhinitis and atopic dermatitis
US20100029491A1 (en) * 2008-07-11 2010-02-04 Maike Schmidt Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment
AU2011280997A1 (en) * 2010-07-23 2013-02-28 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting autoimmune or immune-related diseases or conditions
WO2012170710A1 (en) * 2011-06-08 2012-12-13 Altheadx Incorporated Disease classification modules
WO2013109949A1 (en) * 2012-01-19 2013-07-25 Ibt Usa Inc. Therapeutic uses of tetrachlorodecaoxygen (tcdo)
WO2017029648A1 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Oxo Chemie (Thailand) Co., Ltd Use of chlorite to treat red blood cell diseases and indications mediated thereby

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5877222A (en) * 1996-07-19 1999-03-02 The Regents Of The University Of California Method for treating aids-associated dementia
US6548631B1 (en) 1997-09-16 2003-04-15 BIOMéRIEUX, INC. Macrophage derived chemokine (MDC) as an anti-viral agent for the treatment and prevention of lentivirus infection
US5965421A (en) 1997-11-26 1999-10-12 Human Genome Sciences, Inc. Human IRAK-2
CA2393136A1 (en) * 1999-11-30 2001-06-07 Oxo Chemie Ag Evaluating and predicting clinical outcomes by gene expression analysis

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102423318A (zh) * 2004-02-03 2012-04-25 加利福尼亚大学董事会 亚氯酸盐治疗神经变性疾病
CN102423318B (zh) * 2004-02-03 2015-09-09 加利福尼亚大学董事会 亚氯酸盐治疗神经变性疾病

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