JP2003515349A - 遺伝子発現の解析による臨床結果の評価および予測 - Google Patents

遺伝子発現の解析による臨床結果の評価および予測

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マクグラス、マイケル
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Abstract

(57)【要約】 病理学的な状態または症状に罹患した患者における臨床結果を決定する方法を提供する。患者によって提供される臨床サンプルから、細胞内遺伝子発現のレベルを測定し、そしてそのレベルを参照レベルと比較する。参照レベルからの偏差は、臨床結果（例えば、疾患の進行または治療的介入に対する応答）の予測となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、遺伝子発現のレベルを測定することによって、患者における臨床結
果(clinical outcome)を評価および予測する方法に関する。当該方法は、遺伝子
発現レベルを定量するために提供され、そして測定されたレベルは参照レベルと
比較される。参照レベルからの偏差は臨床結果と相関関係にあり得る。例えば、
治療的介入（therapeutic intervention）に対する患者の応答の型および程度が
決定され得るか、または患者の生存に関する予後が推定され得る。遺伝子発現レ
ベルは、本質的に任意に選択された体組織または体液において測定され得る。驚
くべきことに、血液における細胞内遺伝子発現レベルの測定値が臨床結果の指標
となることが見出された。
【０００２】 （発明の背景） 例えば、疾患状態における全遺伝子発現を調べる方法は、以前に記載されてい
る。例えば、米国特許第5,874,219号;Zakutら, Cancer Research, 53: 5-8 (199
3); Mohauptら, Kidney International, 46: 653-665 (1994); LiangおよびPard
ee (1992) Science 257, 967-971; Liangら(1993), Nucleic Acids Res. 21, 32
69-3275; Bauerら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-4280; StoneおよびWha
rton(1994), Nucleic acid Res. 22, 2612-2618ならびにWangおよびFeuerstein
(1995) Biotechniqes 18, 448-452; WO93/18176およびDE4317414を参照のこと。
しかし、これらの方法は、概して、定量的ではなくむしろ定性的な遺伝子発現の
「スナップショット(snapshot)」を提供する。従って、これらの方法は、遺伝子
が特定の組織において検出可能なレベルで発現されているか否かの指標しか提供
しない。さらに、これらの方法は、病理的な症状に罹患した患者由来のサンプル
に適用された場合でさえ、臨床結果との相関性を患者に全く提供しない。それ故
、遺伝子発現レベルを測定し、そのレベルを臨床結果と相関させるための新規か
つ改善された方法が、大いに所望されることは明らかである。
【０００３】 （発明の要旨） 患者における臨床結果を決定および予測する必要性が存在する。従って、本発
明の目的は、臨床的な状態または症状に罹患した患者について臨床結果を評価（
例えば、決定および／または予測）する方法を提供することであり、当該方法は
、（ａ）患者から得られるか、または患者に由来する臨床用試料を提供する工程
、（ｂ）臨床用試料において、予め選択された１セットの遺伝子の発現レベルを
測定する工程；および（ｃ）該発現レベルを１セットの参照発現レベルと比較す
る工程であって、予め選択された１以上のセットの遺伝子の発現レベルの偏差が
、その患者に関する臨床結果の指標となる工程を包含する。句「予め選択された
遺伝子」とは、本発明の実施に適切であることが決定された遺伝子をいう。好ま
しくは、本発明の実施によれば、遺伝子発現のレベルと、疾患状態または他の望
ましくない状態の性質および程度との間に相関性が存在するような遺伝子が選択
される。
【０００４】 本発明の１局面によれば、臨床用試料は、血液、組織または脳脊髄液のサンプ
ルである。臨床用試料は、血液のサンプルおよびそれに由来するもの（血漿また
は血清のサンプルまたはフラクションなど）であってもよい。
【０００５】 本発明の別の局面によれば、少なくとも３つの予め選択された遺伝子の発現レ
ベルが測定される。１実施態様において、少なくとも１つのプロ炎症性サイトカ
インの発現レベルが測定される。別の実施態様において、少なくとも３つの予め
選択されたプロ炎症性サイトカインの発現レベルが測定される。さらに別の実施
態様において、予め選択されたプロ炎症性サイトカイン遺伝子は、ＴＮＦ−α、
ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＰ−１０およびＭＩＰ−１αからなる群から
選択される。
【０００６】 本発明の別の局面によれば、臨床的な状態または症状は、炎症性障害である。
１実施態様において、炎症性障害は、慢性炎症性障害である。別の実施態様にお
いて、慢性炎症性障害は、慢性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性閉塞性肺疾患、
炎症性粘膜疾患、自己免疫疾患、痴呆、心臓血管疾患および癌からなる群から選
択される。炎症性粘膜疾患は、炎症性腸疾患、クローン病および大腸炎からなる
群から選択され得る。痴呆はＡＩＤＳ関連痴呆またはアルツハイマー病であって
もよい。癌はリンパ腫、前立腺癌および結腸癌からなる群から選択され得る。別
の実施態様において、臨床的な状態は、同種移植片による患者の移植拒絶である
。同種移植片は、心臓、肝臓、腎臓または他の器官であってもよい。
【０００７】 本発明のさらに別の局面によれば、決定される臨床結果は、治療的介入に対す
る応答である。治療的介入は、薬物による治療であってもよい。薬物は、安定化
された亜塩素酸塩溶液であってもよい。特に、安定化された亜塩素酸塩溶液はＷ
Ｆ−１０であってもよい。
【０００８】 本発明のさらに別の局面によれば、臨床的な状態または症状は、ＨＩＶ感染で
ある。１実施態様において、臨床的な状態または症状はＡＩＤＳである。
【０００９】 本発明のなおさらなる局面によれば、示される臨床結果は、予め決定された日
付における患者の生存率である。１実施態様において、示される臨床結果は、６
ヶ月後の患者の生存率である。
【００１０】 本発明のさらなる局面によれば、定量的なポリメラーゼ連鎖反応によって遺伝
子発現のレベルが測定される。ポリメラーゼ連鎖反応は逆転写酵素／ポリメラー
ゼ連鎖反応であってもよい。増幅産物の蛍光検出を用いてポリメラーゼ連鎖反応
は実行され得る。１実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は、LightCycler
（登録商標）装置を用いて、または他の適切な技術を用いて実行され得る。
【００１１】 本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるだ
ろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修飾がこ
の詳細な説明から当業者に明らかとなるので、この詳細な説明および特定の実施
例が、本発明の好ましい実施態様を示す一方で、単に例示のために与えられるこ
とを理解すべきである。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、予め選択された遺伝子セットの発現レベルを測定することにより、
患者における臨床結果を決定する方法を提供する。該遺伝子発現レベルは参照標
準と比較され、そしてこれらの標準からの偏差は臨床結果の指標となる。該遺伝
子発現レベルは、組織または体液（例えば、脳脊髄液）を含む本質的に任意の臨
床用試料において測定され得る。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは
、測定される血液サンプルにおける遺伝子発現レベルが臨床結果の指標となるこ
とを発見した。このことは驚くべきことである。なぜなら、血液は静止状態にあ
る体器官であると典型的に考えられてきたからであり、そして血液中の遺伝子発
現レベルの測定は、ほとんど価値がないまたは価値がない試行であると考えられ
てきたからである。とりわけ、血液細胞における細胞内遺伝子発現レベルの測定
が使用され得る。もちろん、血液の使用は、臨床用サンプルの獲得および分析を
、単純かつ簡便にし、そして侵襲性を最低限にする。
【００１３】 （遺伝子発現レベルの測定） 本発明の方法において使用される遺伝子発現レベルは、測定されるレベルに関
する定量的情報を提供し得る、現在公知の任意の方法または将来案出される方法
により測定され得る。該方法は、好ましくは高感度であり、そして再現性のある
結果を与える。１実施態様においては、核酸増幅技術に基づく方法が使用される
。とりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応(「ＰＣＲ」)および関連増幅技術（例えば、
ＮＡＳＢＡおよび他の等温増幅技術）に基づく方法が使用され得る。より詳細に
は、ｍＲＮＡの逆転写、続いて得られたｃＤＮＡの増幅を使用する、いわゆる「
ＲＴ−ＰＣＲ」方法が意図される。
【００１４】 定量的ＰＣＲを実施するための方法は、当該分野において公知である。例えば
、米国特許第5,210,015号および同第5,487,972号および欧州公告公報第512334B1
号参照（これらは言及によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。定量的Ｐ
ＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを実施するための市販の機器は、PE Applied Biosystem
s（850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404）、Roche Molecular Sy
stems, Inc.（1145 Atlantic Avenue, Alameda, CA 94501）、およびRoche Mole
cular Biochemicals（Indianapolis, IN）から入手できる。特定の実施態様にお
いては、LightCycler装置（Roche Molecular Biochemicals製）が使用される。
この機器は、後記のように、製造業者の取扱説明書に従って使用することができ
る。任意の公知遺伝子増幅用のプライマー群は、例えば、公共データベース（例
えばＧＥＮＢＡＮＫ）からの遺伝子配列の使用およびプライマー設計ソフトウェ
ア（例えばＯＬＩＧＯ）の使用による、当該分野において周知の方法を使用して
設計することができる。多くの遺伝子に対するプライマー群はまた、例えば、PE
Applied Biosystems、Roche Molecular Biochemicals、Roche Diagnostics、お
よびSearch-LC (Heidelberg, Germany)から市販されている。
【００１５】 （遺伝子発現レベルの測定用サンプル） 患者からの任意の簡便に利用可能な組織サンプルが遺伝子発現レベルの測定に
使用され得る。特定の実施態様においては、該サンプルは血液、脳脊髄液、およ
び生検試料または剥脱由来（例えば頬壁由来）の細胞組織であり得る。１実施態
様においては、該サンプルは末梢血単核細胞であり、これは最低限的に侵襲性の
方法を介して直ちにかつ容易に利用可能である。遺伝子発現分析用サンプルの調
製方法は、当該分野において周知であり、市販のキットを使用して実施できる。
【００１６】 （臨床結果の決定） 得られる遺伝子発現レベルは、好ましくは同じサンプルにおける参照遺伝子に
対して比較され、そして規格化(normalize)される。典型的には、「ハウスキー
ピング」遺伝子（例えばアクチン）がこの規格化に使用される。他の「ハウスキ
ーピング」遺伝子は当該分野において周知である（例えば、ＨＰＲＴ、ＣＰＢ、
およびＧ６ＰＤ）。
【００１７】 臨床結果の決定のため、臨床用サンプル(「試験患者」に由来)から得られる遺
伝子発現レベルを参照サンプルにおけるレベルと比較する。該参照サンプルは、
疾患を患っていないか、または試験患者と同じ病理学的な状態または症状を患っ
ていない健康個体から得られる。好ましくは、目的遺伝子の発現レベルは相当数
の健康個体から決定され、そして代表値または平均値が得られる。特定の実施態
様においては、該参照レベルは試験患者と同じ性別および年齢の個体から決定さ
れ得る。別の実施態様においては、参照レベルは、まとめられたデータ（これら
のデータは適切な性別および年齢の健康患者から集められる）から得ることがで
きる。
【００１８】 臨床結果の予測(指標のタイプ)となり得る遺伝子発現の相対的レベルは、より
高いまたはより低い発現レベルであり得る。例えば、プロ炎症性サイトカイン（
例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＰ−ｌＯおよびＭＩＰ
−１α）の発現レベルの増加がＨＩＶに感染した患者に対しての乏しい臨床結果
(例えば、長期間の生存への期待値の低減)を反映することを以下に示す。患者が
抗ＨＩＶ化合物によって処置される場合、プロ炎症性サイトカインの相対的レベ
ルは再度測定され得る。サイトカインのレベルが低減する場合、これは患者が処
置に対して良好に応答していることを示す。この場合、該臨床結果は、該患者が
抗ＨＩＶ療法を停止できること、または抗ＨＩＶ化合物の用量を低減できること
であり得る。応答の欠乏は、該患者が療法に対して応答せず、それ故乏しい予後
となることを示すか、あるいは抗ＨＩＶ化合物の用量を増加しなければならない
こと、またはさらなる治療的介入を用いなければならないことを示し得る。応答
の欠如はまた、疾患の悪化を療法により停止または遅らせることができなかった
ことを示し得る。
【００１９】 本発明は、プロ炎症性サイトカイン発現レベルが測定されて臨床結果を予測す
るために使用され得ることを特に意図するが、当業者は本発明がそのように限定
されないことをよく理解するだろう。このように、遺伝子発現における変化を同
定するための方法は、上述したように、当該分野において周知である。たとえこ
れらの方法が本発明における使用に関して充分に定量的ではないとしても、それ
らは疾患状態において発現が変化する遺伝子を予測するために使用され得る。次
いで、定量的測定法（例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）が遺伝子発現における変化
を測定するために使用され得る。それらの変化は、患者において追跡され、当該
分野において周知の方法により臨床結果と相関付けられ得る。
【００２０】 このように、任意の所定の疾患に対して、臨床結果を決定するための予測方法
が開発され得る。以下の考察は、マクロファージ活性化における遺伝子発現レベ
ルを示し、そしてそれらのレベル、および特定の薬物（ＷＦ１０）を用いる処置
に際してのそれらの変化が、慢性炎症性疾患（例えば、慢性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ
型肝炎、慢性閉塞性肺疾患、炎症性粘膜疾患、自己免疫疾患、痴呆、心臓血管疾
患、および癌）を患う患者における臨床結果に関する情報をどのように与えるか
を示す。該炎症性粘膜疾患は、例えば、炎症性腸疾患、クローン病、および大腸
炎から選択され得る。該痴呆は、例えば、ＡＩＤＳ関連痴呆またはアルツハイマ
ー病であり得る。該癌は、例えば、リンパ腫、前立腺癌、または結腸癌であり得
る。後記実施例２はまた、本発明の方法がＣ型肝炎を患う患者における臨床結果
を予測するために使用され得ることを示す。本発明の方法はまた、同種移植片（
例えば、心臓、肝臓、腎臓、または他の器官）を受ける患者における移植拒絶の
臨床結果を検出または予測するために使用され得る。このように、変化した（特
に増加した）炎症性サイトカイン遺伝子発現の測定は、同種移植拒絶の指標とな
る。同種移植拒絶を検出するために測定され得る特定の遺伝子発現レベルには、
ＩＰｌ０、ＴＮＦ−α、δ−ＩＦＮ、および他のマクロファージ炎症遺伝子が含
まれる。
【００２１】 （マクロファージの活性化） ＷＦ１０は、全身性形態（ＷＦ１０）およびより希釈された局所性形態（オキ
ソフェリン(Oxoferrin)）で臨床使用が認可された安定化亜塩素酸マトリックス
である（Kuhne、Die erwunschte Sauerstoffaktivierung, dokumentiert am Bei
spiel der Wundheilung: der Weg zur Oxoferin-Therapie、In: Elsmer E.F.、B
ors W.,Wilmanns W. (編): Reaktive Sauerstoffspezies in der Medizin. Spri
nger Verlag, Berlin 1986,5-15頁参照）。ＷＦ１０は、放射線後症候群(post-r
adiation syndrome)を患う患者への全身投与および癌について処置を受けている
患者における支援治療についてタイで認可されている。これらの適応症は幅広く
研究され、レビューされている。Raffantiら、Infection : 26:201-206 (1998)
参照。オキソフェリンは慢性創傷（例えば糖尿病性潰瘍）の治癒を増強するため
に局所的に使用される（Hinzら、Lancet 1 : 825-828 (1986)）。ＷＦ１０反応
性についての体内の主要標的細胞は、マクロファージおよび樹状細胞集団である
。それらは、両細胞集団が共通の前駆細胞から誘導されるので、単にマクロファ
ージと称される。ＷＦ１０のインビトロおよび臨床効果によって、新たに提唱さ
れた均衡マクロファージ活性化(Balanced Macrophage Activation)理論の内容が
最もよく理解される。図１は、マクロファージ活性化サイクル（ここで均衡マク
ロファージ活性化を達成するように、種々の形態の活性化およびマクロファージ
機能のリサイクリングの間に複数の段階が存在する）の概要を示す。マクロファ
ージ活性化サイクルにおける各段階に番号（１〜５）を付し、順次説明する。
【００２２】 １．マクロファージ活性化プログラムにおいて発生する第１の事項は、外来性物
質のファゴサイトーシスである。マクロファージは病原性生物（例えば細菌、真
菌およびウイルス）を飲み込む。これは最も古くから知られた最も重要なマクロ
ファージの機能の一つであり、そしてどのようにマクロファージがその名称を得
るに至ったのかを示す。大きいを意味する「マクロ」、および食べる人を意味す
る「ファージ」により、用語「大食者」がマクロファージに付与されている。外
来性物質の上首尾のファゴサイトーシスに際して、該マクロファージは、蛋白質
分解経路〔個々の蛋白質の小さなペプチド（次いでマクロファージ活性化の第２
段階に関与する）への切断〕を通じてこの物質を処理する。
【００２３】 ２．抗原提示 外来性の物質がペプチドへ切断された後、マクロファージは主要組織適合性抗
原クラス１（ＨＬＡ）およびクラス２（ＤＲ）を利用するＴリンパ球に対する抗
原を提示し、正常な免疫応答の展開を開始する。Ｔ細胞活性化は、この抗原提示
細胞機能を通じて優勢的に起こる。ウイルス感染細胞、癌または真菌に特異的な
標準的細胞障害性Ｔ細胞が発生することにより、上首尾のそれらの外来性プロセ
スの免疫クリアランスを最終的に導く。これは図１に活性免疫応答として示され
る。活性免疫応答の上首尾の活性化に際して、Ｔ細胞は種々の活性化抗原（例え
ばＣＤ３８）を発現し、因子（例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２））を分
泌する。ＩＬ２はＴ細胞を増殖させ、ガンマ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）
がさらなるマクロファージ活性化および段階３を引き起こすことを可能にする。
【００２４】 ３．古典的なマクロファージ活性化 Ｔ細胞活性化産物（γ-インターフェロン）は完全な炎症性変化および古典的
なマクロファージ活性化を誘導する。この活性化は、炎症性サイトカイン（例え
ばＩＬｌ、ＩＬ６、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））のアップレギュレーション
を引き起こす。この状態におけるマクロファージは極度に炎症性であり、二次効
果（例えば、発熱）をもたらし、そして慢性的に刺激される場合、体重の減少お
よびさらなる免疫学的応答の非特異的活性化をもたらす。
【００２５】 ４．ＴＨ１からＴＨ２（阻害性Ｔに対して活性）へのシフト 細胞障害性Ｔ細胞およびＩＬ２産生Ｔ細胞（ＴＨ１細胞）の産生を最終的に導
く細胞性応答開始の間に、２番目に主要なクラスのＴ細胞であるＴＨ２が誘導さ
れる。ＴＨ２は、均衡マクロファージ活性化シグナルを提供するだけでなく、Ｂ
細胞活性化にも関与する。ＴＨ２細胞によって産生されるサイトカインとしては
、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６およびＩＬ１０が挙げられる。これらの因子は、Ｂ細
胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、高ガンマグロブリン血症、ＩｇＥのアップレギュレ
ーション、アレルギー反応および好酸球増加症を引き起こす。過剰なＩＬ１０産
生は、最終的に、図１に示される応答における段階２の遮断につながる。ＴＨ１
およびＴＨ２細胞の活性化プロセスは、事実上、インビトロで（おそらくインビ
ボでも）同時に起こるが、インビトロでのＴ細胞増殖によって測定されるような
古典的な免疫学的応答性は、主に、ＴＨ１様応答の尺度となる。ＴＨ２応答は、
マクロファージ活性化代替経路（ＡＭＡＰ）を活性化させることで知られている
ＩＬ４の産生という重要な特徴を有する（段階５）。
【００２６】 ５．ＡＭＡＰ マクロファージ活性化代替経路（ｒｅｆ．４にて概説される）は、以下の特徴
を有する。 ａ．脈管形成因子の産生 ｂ．Ｔ細胞応答の阻害 ｃ．段階３で記載した古典的に活性化されるマクロファージに特有の炎症性メデ
ィエーター産生の関連ダウンレギュレーション。
【００２７】 マクロファージ活性化代替経路は、近年、ＡＭＡＣ−１（オルターナティブ(a
lternative)マクロファージ活性化ケモカイン−１）（Kodeljaら、Journal of I
mmunology 160:1411-1418(1998)）のクローニングおよび分子研究により別個の
経路として確立されており、またマクロファージ炎症性タンパク４（ＭＩＰ−４
）として知られる。マクロファージ活性化代替経路を経るべく誘導されるマクロ
ファージにおいてのみ、遺伝子ＡＭＡＣ−１／ＭＩＰ−４が検出されている。マ
クロファージ活性化代替経路の二次的な副次的結果は、マクロファージ活性化代
替経路誘導を経るべく誘導されたマクロファージにおけるファゴサイトーシスの
出現である。この副次的結果は、潜在的に、均衡マクロファージ活性化経路の完
全なリサイクリングをシグナル伝達する。
【００２８】 免疫学的応答においてマクロファージの関与が段階１から５へと至るこのスキ
ームは、均衡マクロファージ活性化理論のサイクルとして提唱される。正常な免
疫学的プロセスは、その循環的性質のため、その経路に特有の段階のいずれをも
過剰に強調せず、通常は、均衡したままである。
【００２９】 （均衡マクロファージ活性化の乱れに関与する疾患） 均衡マクロファージ活性化は、様々な病理学的プロセスによって乱され、均衡
マクロファージ活性化の不均衡は、慢性的疾患の多くの症状発現の原因となる。
これらの不均衡の例は、以下のとおりである。
【００３０】慢性ウィルス感染 図１における段階２および３は、均衡マクロファージ活性化を再確立する首尾
のよい免疫応答によって外来ウィルスが除去され得ないときに絶えず刺激される
。この過剰な免疫学的刺激は、予想どおり、慢性肝炎Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の
感染による肝硬変および肝臓癌、ならびにＨＩＶ疾患による深刻な免疫調節不全
などの病理学的続発症を導く。段階２および３が長時間過剰に刺激された後には
、段階５および１に達する細胞が不足することが予測される。また高度に活性化
されたＴ細胞が出現すると共に、ＴＨ１細胞群が初期に過剰活動する。段階３の
過剰な活性化は、体重の減少を伴う慢性的な発熱として臨床的に現れる。またＨ
ＩＶ感染のような慢性ウィルス感染の患者は、図１の段階４に記載されるような
劇的なＴＨ１からＴＨ２へのシフトを有することが観察されている。均衡マクロ
ファージ活性化理論は、このシフトが、通常段階５を誘導するサイトカインであ
るＩＬ４の産生を通して均衡マクロファージ活性化の調節を図るＴ細胞を事実上
代償することを予測する。慢性ウィルス疾患の患者が被る状態は、そのときの慢
性の炎症状態の副次的結果である。これらには、二次的な免疫病原性変化を引き
起こす炎症性メディエーターおよび炎症性サイトカインの過剰な産生が挙げられ
る。このような変化は、ＨＩＶ疾患で観察される。このＨＩＶ疾患では、過剰な
炎症状態が、マクロファージ炎症区画の過剰活性に二次的である、痴呆、腎疾患
、リンパ腫、および消耗症候群の発症を促進する。慢性ウィルス疾患の二次的な
副次的結果は、上記のように細胞が段階５および１で消耗することである。この
結果は、創傷治癒の速度を減少させ、付随する脈管形成およびファゴサイトーシ
スを減少させる。物質を貪食しうる細胞が少ないと、ウィルス疾患に罹患した個
体では、新たな感染性生物（例えば、細菌や真菌）は、あまり除去されない。
【００３１】自己免疫疾患 自己免疫疾患は、炎症に伴い免疫反応性リンパ球が過剰に刺激されるという点
で慢性ウィルス疾患と類似している。自己免疫疾患は、慢性的なウィルス様疾患
として幾年もの間考えられているが、これらのタイプの疾患のイニシエーターと
しては、現在までにウィルスは単離されていない。これらの疾患としては、全身
性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、放射線後症候群、および様々な自己免疫腎疾患
などが挙げられる。幾つかの自己免疫疾患は、図１の段階４に記載したように、
高ガンマグロブリン血症、上昇したＩｇＥおよび好酸球増加症の存在を特徴とす
る。この結果は、身体が均衡マクロファージ活性化を再確立しようとするときに
、ＴＨ１からＴＨ２への代償的なシフトの副次的結果として起こるかもしれない
。
【００３２】アレルギー反応 最も深刻なアレルギー反応は、環境的な抗原による段階２の肺での過剰刺激が
、肺組織における不適当な局所的マクロファージ炎症性変化ならびにＴ細胞の活
性化を導く喘息である。これらの肺組織は、段階３で産生される炎症メディエー
ターによって害される。通常、肺マクロファージは、誘導されるマクロファージ
活性化代替経路を構成的に有し（段階５に示される通り）、それ故、図１に示す
ような段階２および３に対してはより影響を受けにくい。しかしながらアレルギ
ー患者においては、これらの反応（段階２および３）が起こることが許容される
。喘息患者はまた、好酸球増加症に関係したＴＨ１からＴＨ２へのシフトを有す
る。この反応は、肺マクロファージが段階２および３から４を経て段階５へとシ
フトする場合に、代償性の均衡マクロファージ活性化理論によって予測される。
【００３３】免疫欠損に伴う細菌および真菌感染 もし図１から段階２および３が増進されるならば、段階５および１における貪
食可能かつ免疫応答を再び開始可能な細胞は、時間の経過に従ってより少なくな
る。細菌および真菌を貪食可能な細胞数の減少は、免疫欠損下の患者の生存を非
常に困難にする。細菌や真菌に対する抗生物質療法は、侵入してきた生物がマク
ロファージまたは顆粒球によって貪食されていない限りは、インビボで効率的に
働かない。最も一般に使用される抗真菌薬であるアンホテリシンＢは、真菌が貪
食細胞によって飲み込まれていない限り全く働かない。進行したＨＩＶ疾患の患
者は、非効率なファゴサイトーシスのため、大抵の場合、侵襲的な真菌感染に罹
りやすい。対応する疾患プロセスは、移植片の拒絶反応の治療のためシクロスポ
リンＡおよびプレドニゾンを投与された臓器移植の患者で誘導される。これらの
患者は、免疫抑制され、もし彼らが侵襲的な細菌または真菌感染を発症する場合
には、それらのマクロファージは、段階２および３へとシフトするだろう。そし
て同様に、ファゴサイトーシスおよび免疫学的応答の再開始を可能にする均衡マ
クロファージ活性化をリサクリング及び達成することができない。
【００３４】慢性的創傷 このクラスの疾患の最もよい例は、糖尿病の患者または寝たきりの患者で観察
される。慢性糖尿病性潰瘍および圧迫性潰瘍の発症およびそれらの創傷でのマク
ロファージは、図１の段階３と整合する変化を示す（Goerdtら, immunity 10: 1
37-142 (1999)）。段階３が段階５（ここで、脈管形成因子が血管の成長および
治癒を可能にするために産生される）を通してシフトし得ない場合には、創傷は
治癒しないであろう。同様に、慢性的創傷でのマクロファージが段階１から３へ
シフトした場合には、治癒プロセスを促進するために、創傷における死滅物質お
よび死にかけている物質の除去を可能にするように貪食細胞は存在しないだろう
。
【００３５】癌 様々な癌は、慢性炎症から発生する。例としては、抗原により過剰に駆動され
たリンパ球から発生するリンパ腫、ならびに慢性前立腺炎から進行する前立腺癌
が挙げられる。両方のケースにおいて、段階２および３は、慢性的な増殖性刺激
を提供する。
【００３６】 （免疫機能に対するＷＦ１０活性のインビトロ研究） ＷＦ１０は、インビボで容易に達成できるレベルでＴ細胞応答の抗原活性化を
完全に遮断する（McGrathら、Transplantation Proceedings, 30:4200-4204 (19
98)）。このＴ細胞活性化の阻害は、Ｔ細胞およびマクロファージが外来抗原と
一緒にされたときにのみ起こり、そして７日間のＴ細胞活性化アッセイの６日目
に添加したときでさえ起こった。これらのデータは、ＷＦ１０が図１の段階２に
おいて示されるように、通常のＴ細胞活性化の基本的なプロセスの阻害に極めて
強力であることを示唆する。
【００３７】 ＷＦ１０は、図１の段階３に記載したように、炎症性マクロファージによる炎
症性サイトカイン産生のダウンレギュレーションを引き起こした（McGrathら、A
bstract #2046, Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology, Park
City, UT, １９９８年３月１３〜１９日）。研究は、現在のところ、ＷＦ１０
がＡＭＡＣ−１のアップレギュレーションを引き起こし、それによって段階３か
ら５へと切り換えて、インビボにおいてＢＭＡサイクルを終了させる否かを試験
している最中である。
【００３８】 （インビボでＢＭＡを達成するためのＷＦ１０の使用） ＷＦ１０およびオキソフェリンは、長年の間、ヒトの慢性疾患を治療するのに
幅広く用いられてきた。オキソフェリンは、１９８０年代末期に慢性的創傷にお
ける局所的使用が承認された。現在まで、オキソフェリンは、糖尿病性潰瘍およ
び圧迫性潰瘍を含む慢性的創傷の急速な治癒を誘導するのに成功している。オキ
ソフェリンは、脈管形成因子およびマクロファージのファゴサイトーシスのアッ
プレギュレーションを伴う均衡マクロファージ活性化の達成を通して働くと考え
られている。ＷＦ１０は、放射線後症候群（ＰＲＳ）の治療の目的で、１９９７
年に全身的使用がタイで承認された。放射線後症候群は、Ｘ線療法を受けた器官
で末期の合併症として起こる。頸癌または前立腺癌に低線量の腹部照射をした患
者の１５％までが、放射線照射の６ヶ月から１０年後に、直腸および膀胱からの
出血を伴うＰＲＳを発症する。組織学的解析は、出血が小動脈での局所的自己免
疫プロセス（動脈内膜炎）によって引き起こされることを示す。これは、放射線
照射領域での組織の死を導き、たとえば膀胱または直腸中への出血を引き起こす
。患者は、時々、ステロイドに一時的に応答する。しかしながらタイで行われた
研究では、放射線後症候群に二次的な出血性膀胱炎の女性においては、ＷＦ１０
の全身投与に対しほぼ１００％の割合で完全に応答した。症候のいくらかの軽減
を伴うステロイド治療とは異なり、ＷＦ１０投与は、現在まで、放射線後症候群
の患者の治療に有効である。
【００３９】 ＷＦ１０に関する発展的な臨床的研究が、現在、ＨＩＶ疾患の患者の治療に関
して米国で進行中である。ＷＦ１０の２つのサイクルを受けた患者は、均衡マク
ロファージ活性化の誘導と整合する慢性的な免疫学的変化を示した（Herndierら
、Abstract #22417, 12th World AIDS Conference, Geneva, １９９８年６月２
８日〜７月３日）。慢性ウィルス感染であるＨＩＶ疾患の患者は、典型的に、疾
患末期において、Ｔ細胞活性化の不適切な増強ならびにマクロファージのファゴ
サイトーシスの速度の低下を示す。サンフランシスコ・ジェネラル病院で行われ
たフェーズＩＩの研究では、ＷＦ１０投与は、研究開始時に低い基準レベルのフ
ァゴサイトーシスを有する患者でのマクロファージのファゴサイトーシスのアッ
プレギュレーションとともに、不適切に高められた免疫学的活性化マーカー全て
の劇的なダウンレギュレーションを伴った。これらの結果は、均衡マクロファー
ジ活性化の誘導と整合しており、均衡マクロファージ活性化理論の試験対象構成
成分の更なるインビトロでの研究につながるであろう。
【００４０】 結論として、均衡マクロファージ活性化に影響を及ぼす疾患は一般的なようで
あり、上述した段階のいずれかに蓄積するマクロファージにより媒介される毒性
副作用のために、慢性疾患の多くの副作用が起こるようである。現在のところ、
ＷＦ１０は、臨床開発において、均衡マクロファージ活性化に作用し得、かつ上
述したＡ〜Ｆ節での疾患の臨床結果の変化を期待させ得る唯一の新規薬物である
。
【００４１】 創傷および感染の治療のための安定化亜塩素酸塩溶液を含む水溶液の使用が、
当分野で公知である。米国特許第4,507,285号および同第4,725,437号（それらの
開示は、参照によってそれらの全体が本明細書中に援用される）ならびにEP 0 2
00 157（それらの開示もまた、参照によってそれらの全体が本明細書中に援用され
る）には、ヒトにおける創傷治癒応答の刺激に、ならびに寄生虫、真菌、細菌、
ウィルスおよび／またはマイコプラズマにより引き起こされた感染の治療に、安
定化亜塩素酸塩溶液を使用することが記載されている。Kuhneらのヨーロッパ特
許第200,156号（その開示はそれら全体が参照によって本明細書中に援用される
）には、損傷した放射線照射組織の修復ならびに副作用の低減に役立つ放射線療
法とともに安定化亜塩素酸塩溶液を使用することが記載されている。
【００４２】 この発明の治療方法の好ましい実施態様は、一般に「ＴＣＤＯ」と省略される
「テトラクロロデカオキシゲンアニオン複合体」と称されてきた産物の水溶液を
、その必要がある哺乳動物に投与することを含む。この物質は、米国特許第4,50
7,285号（「２８５特許」）の実施例１に記載される手順を用いて調製され得、
透明な水性の液体であり、アルコールに混和可能であり、−３℃の融点を有する
。ラマンスペクトルは、４０３，８０２（亜塩素酸塩）および１５６２ｃｍ-1（
活性酸素）である。当業者は、化学的に安定化された任意の亜塩素酸塩溶液が本
発明の方法に使用され得ること、ならびに本発明の範囲が「２８５特許」に記載
された産物の使用に限定されないことを理解するであろう。 本発明は、このように一般的に記載されているが、例示のために提供されるも
のであり本発明を制限することを意図するものではない以下の実施例を参照する
ことによってより容易に理解されるであろう。実施例において、「ＷＦ１０」は
安定化亜塩素酸水溶液を意味する。
【００４３】 （実施例１） （方法） （サンプル調製） 単核細胞（ＭＮＣ）を、Leuco Sepチューブ（♯227290, Greiner Labortechni
k, Frikenhausen, Germany）を用いてHistopaqueTM1077密度勾配で単離し、２×
１０6細胞を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。培養物を、マイ
トジェニック抗ＣＤ２混合物（Ａ１ＣＤ２Ｍ１，Ａ１ＣＤ２Ｍ２，最終濃度各々
１μｇ／ｍｌ及び１１Ｆ１ ３００ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３，１０
０ｎｇ／ｍｌ）、又は１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡと０．５μｇ／ｍｌイオノマイシ
ンのいずれかで刺激した。未刺激培養物と刺激培養物を、最終濃度１：３００の
ＷＦ１０の存在下、又は非存在下、３７℃、７％ＣＯ2下で３時間インキュベー
トした。細胞を回収し、２００μｌ ＰＢＳに再懸濁し、４００μｌのHigh-Pur
e溶解液を加えた。得られた溶解物を−７０℃で保存した。３７℃で１０分融解
した後、総ＲＮＡ単離キットを用いＲＮＡを抽出し、スピンカラムから容量５０
μｌでＲＮＡを溶出した。ＡＭＶ−ＲＴと、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）（
ｃＤＮＡ合成キット）を用い、８．２μｌのＲＮＡのアリコートを逆転写した。
対照として逆転写酵素無しの反応を行った（ＲＴ無しの対照）。ｃＤＮＡ合成の
終了後、反応混合液を最終容量５００μｌに希釈し、ＰＣＲ解析まで−２０℃で
保存した。
【００４４】 （LightCycler（登録商標）ＰＣＲ） 製造業者のプロトコルに従い、LightCycler FastStart DNA Sybr Green 1 キ
ット(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)とともにLightCycler（登録商標）
Primer Sets（Search-LC, Heidelberg, Germany）を用いて、標的配列を増幅し
た。４種のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン、ＨＰＲＴ、Ｇ６ＰＤＨ及び
シクロフィリンＢ）の発現の平均によって、入力値を規格化した。
【００４５】 （研究設計の概要） 承認された抗ＨＩＶ薬物療法で治療された、５０細胞／ｍｍ3を超えるＣＤ４
＋カウントを有する１８人のＨＩＶ感染成人が、オープンラベル(open-label)の
単一センター研究に参加する。参加者は、約１２週間にわたり研究の第１相に参
加する。患者は、９人ずつの２群に分けられる。９人の患者は、１ｍｍ3当たり
３００細胞よりも大きいＣＤ４＋カウントを有し、９人の患者は、１ｍｍ3当た
り５０細胞よりも大きく３００細胞未満のＣＤ４＋カウントを有する。ウイルス
の負荷が２０，０００コピー／ｍＬ未満の患者だけが、研究に参加する。参加は
、血漿ＨＩＶ ＲＮＡがアッセイ検出能の限界よりも低い９人の患者に限定され
る。
【００４６】 スクリーニング評価の終了後に、適性な患者が、１日目、２日目、４日目の研
究往診に出席する。８日目〜１２日目に、静脈注射によって投与される２５０−
５００ｍｌ正常生理食塩水中に希釈されたｋｇ／ｂｗ当たり０．５ｍｌのＷＦ１
０の１サイクルを患者は受ける。次いで、患者は、１５、１７、１９、２２、２
４、２６日目の研究往診に出席する。
【００４７】 ２９日目〜３３日目、静脈注射によって投与される２５０−５００ｍｌ正常生
理食塩水中に希釈されたｋｇ／ｂｗ当たり０．５ｍｌのＷＦ１０の２回目のサイ
クルを患者は受ける。次いで、患者は、３６、３８、４０、４７日目（最後の往
診）に研究往診に出席する。患者は、４７日目の最後の往診の場合に帰るべき４
８時間の幅を有する。
【００４８】 １、８、１１、１５、２２、２９、３１、４０、４７日目に測定される免疫機
能は、フルオレセイン標識大腸菌を用いる食作用指標、フィトヘマグルチニンに
よるＴ細胞活性化、リンパ球免疫フェノタイピング（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、
ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６９の検出）、ＤＲ
、ＴＮＦ及び単球の定量の測定値として定義される。 全ての患者の健康状態を、４７日目以降から１年間にわたり１ヶ月毎に電話に
よって追跡する。
【００４９】 （結果） （臨床試験） ４７日間の研究を終えた患者のうち、７人は３００／μｌ未満の最初のＣＤ４
カウントを有したが、それらの患者は、ＷＦ１０（静脈内注射）の２回の５日サ
イクルに対し最も劇的な免疫学的パラメータ反応を示した。ＣＤ４とＣＤ８カウ
ントは有意に増加し、ＣＤ８細胞増加は、ＣＤ８／ＣＤ３８ネガティブサブセッ
トの増加によって完全に反映された。この試験の過程の間、ＨＩＶウイルスの負
荷に関連して変化することなく、ＣＤ３８発現の中央値において劇的な全体があ
った。免疫学的活性化の他の測定は、細胞付随蛍光のＣＤ１４／ＤＲ、ＣＤ２０
／ＤＲ及びＣＤ４／３８平均レベルにおいて観察された有意な低下に伴い同様に
減少した。
【００５０】 （ＷＦ１０試験ＰＢＭＣの遺伝子発現解析） Lightcyclerベース技術を用いて、凍結後に抽出した細胞調製物において、Ｐ
ＭＢＣ関連炎症遺伝子発現を評価した。４７日の試験の間にＣＤ８／３８の変化
を有しなかった患者（♯１５）と比較した、ＣＤ８／３８＋細胞サブセットで５
０％減少を有した患者（♯１４）における一連のプロ炎症性遺伝子（内部ハウス
キーピング遺伝子、アクチン、Ｇ６ＰＤ、ＣＰＢ、ＨＰＲＴに対し）の相対的レ
ベルを、図２に示す。患者１５における遺伝子発現レベルを、図３に示す。ＣＤ
８／３８レベルの減少と、図２に示すようなマクロファージプロ炎症性遺伝子の
発現の変化との間には、全体的に高度に有意な相関性が存在した。
【００５１】 （ＰＢＭＣ及びＣＤ１４細胞遺伝子発現に対するＷＦ１０のインビトロ効果） Ｔ細胞活性化に対する薬物の効果を測定するために、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３及び
ＰＭＡ／イオノマイシンに曝されたＰＢＭＣに対してＷＦ１０をインビトロで試
験した。最終濃度１：３００、即ち、臨床試験の間に容易に達成される用量でＷ
Ｆ１０を用い、ＰＢＭＣを３時間回収し、ＲＮＡ抽出とＲＴ−ＰＣＲのために１
８時間後にＣＤ１４細胞をアフィニティー精製した。１１人の正常血液ドナーの
ＰＢＭＣに対するＷＦ１０の効果は、ベースラインの、未処理（ＷＦ１０）だが
、刺激された試料から５倍変化までを表すＬＣインデックスとして表された。誘
導されたリンパ球刺激性サイトカインＩＬ−２とＩＬ−１７の一貫したダウンレ
ギュレーションが、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、チオレドキシン（Ｔ
ＲＸ）のアップレギュレーションの一貫したパターンと共に観察された。アップ
レギュレーションは、マクロファージの炎症性メディエーターであるように思わ
れるので、精製されたＣＤ１４細胞を１：３００ ＷＦ１０に１８時間にわたり
曝し、増加した遺伝子発現について評価した。７つのＣＤ１４調製物のうち３つ
が、４種のハウスキーピング遺伝子レベルにおいておよそ９０％の減少を有した
。３つのＣＤ１４試料はまた、評価した４つのアポトーシス遺伝子の劇的なアッ
プレギュレーションを有し、並行するＰＩ取り込み研究により、培養の間に起こ
るＣＤ１４細胞アポトーシスが確認された。ＷＦ１０で処理される前にマクロフ
ァージ研究のために使用されたＰＢＭＣの遺伝子発現レベルも測定された。アポ
トーシスを起こした試料は、アポトーシスが起こらなかったものより、前処理炎
症性遺伝子発現の有意に高いレベルを有することが観察された。
【００５２】 （インビトロでのＷＦ１０処置によりＡＭＡＣ−１アップレギュレーションが
生じる） アポトーシス細胞は、代替（alternative）（抗炎症）活性化及びファゴサイ
トーシス下で、マクロファージに対し最も強力な刺激である。代替活性化は、Ｔ
ｈ２サイトカインＩＬ−４による誘導と関連し、炎症性遺伝子発現及び抗原誘導
性Ｔ細胞活性化において完全な遮断を引き起こす。精製マクロファージをＷＦ１
０の１：２００希釈液に曝し、ＡＭＡＣ−１（代替経路（ＡＭＡＰ）に特異的）
遺伝子発現を２１日後まで評価した。ＷＦ１０は、ＩＬ−４によるマクロファー
ジ処理によって誘導されるＡＭＡＣ−１発現を劇的に増大させた。
【００５３】 ＷＦ１０投与が、インビボにおいてＣＤ８／３８レベルの変化に並行するパタ
ーンでマクロファージのプロ炎症性遺伝子発現を変化させることを、上記のデー
タは示唆する。インビトロでは、ＷＦ１０は、種々の免疫学的に活性な遺伝子に
おいて劇的な変化を引き起こし、それにより、予め活性化された患者試料のサブ
セットにおけるＣＤ１４細胞のアポトーシスと、ＰＢＭＣにおけるリンパ球刺激
性遺伝子の一貫したダウンレギュレーションとを生じる。マクロファージ活性化
の代替（抗炎症）経路の代償的な誘導による、過剰活性化により誘導されるＣＤ
１４細胞死によって、ＷＦ１０がＨＩＶ疾患などの慢性炎症性疾患と関連した不
適当な炎症を制御することは明白である。
【００５４】 結論として、上記研究は以下のことを証明する。 １）ＨＩＶ＋患者（＜３００ ＣＤ４細胞／μｌ）へのＷＦ１０投与は、 ａ）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８／３８細胞数の有意な増加、 ｂ）ＣＤ２０／ＤＲ、ＣＤ１４／ＤＲ、ＣＤ４／３８平均蛍光／細胞の有意な
減少、 ｃ）ＰＨＡ活性化の有意な減少、 を伴う。 ２）ＰＢＭＣのLightcyclerシステムＲＴ−ＰＣＲは、マクロファージ炎症性遺
伝子発現（ＴＮＦ−αなど）の、薬物に伴うダウンレギュレーションを示した。
３）正常ＰＢＭＣ（３時間）及びＣＤ１４（１８時間）細胞に対するＷＦ１０効
果のインビトロ研究は以下のことを示した。 ａ）活性化ＰＢＭＣ：リンパ球刺激性サイトカインＩＬ−２及びＩＬ−１７の
ダウンレギュレーション。マクロファージ炎症性遺伝子及び抗アポトーシス（抗
酸化）遺伝子チオレドキシン（ＴＲＸ）のアップレギュレーション。 ｂ）培養ＣＤ１４細胞：関連するアポトーシス細胞（ＣＤ１４）死を伴う、増
大した前処理レベルの炎症性遺伝子を含む試料におけるアポトーシス遺伝子（Ｂ
ＡＸ，ＢＣＬ−Ｘ１，ＣＤ９５，ＣＤ９５Ｌ）のアップレギュレーション。 ４）ＷＦ１０は、単離されたＣＤ１４細胞において、代替マクロファージ活性化
遺伝子ＡＭＡＣ−１の後期アップレギュレーションを引き起こした。 ５）如何なる理論にも縛られないが、増大した炎症性遺伝子発現を含む試料での
マクロファージ細胞死のＷＦ１０誘導により、炎症性マクロファージの急性アポ
トーシスに応答してマクロファージで代償的なＡＭＡＰ誘導が生じると、本発明
者らは考えている。それ故、ＷＦ１０は、炎症性遺伝子発現の急性アップレギュ
レーションにより炎症のダウンレギュレーション、アポトーシスによる細胞死、
リンパ球刺激性遺伝子のダウンレギュレーション、及び抗炎症性経路であるＡＭ
ＡＰへの代償的マクロファージ分化の変化を引き起こす。
【００５５】 ＷＦ１０が、長期の臨床的利益を示すと期待される、インビボでの病理学的炎
症（ＨＩＶ疾患の進行に伴う）の逆転を引き起こしたことを、上記の観察は示す
。免疫学的状態の変化は、定量的遺伝子発現技術の使用により証明された。この
試験は、更なるＷＦ１０療法を必要とする病理学的状態の回復を迅速に識別する
ために、治療患者の長期間のケアにおいて用いられよう。
【００５６】 （実施例２） （概要） 末梢血単核細胞を、図４で記載した９人の患者と、２０人の正常血ドナーから
得た。ベースライン及び上記のＰＭＡ／イオノマイシン刺激細胞についての遺伝
子発現を評価した。定量的評価は、全体的な細胞遺伝子発現の対照として役立た
せるために、２種のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン，ＣＰＢ）の使用に
基づいた。次いで、「試験」遺伝子発現を、標準的な「ハウスキーピング遺伝子
」対照レベルに規格化した。マクロファージとＴ細胞活性化と関連する１３種の
遺伝子を、１次免疫応答と慢性炎症におけるそれらの機能のために、この研究で
の評価のために選択した。遺伝子は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８
、ＩＬ−１０、ＩＰ１０、ＭＣＳＦ、ＴＮＦα、γ−ＩＦＮ、ＭＩＰ−１α、Ｍ
ＩＰ−２α、ＭＲＰ−１４、及びＴＧＦ−βであった。ハウスキーピング遺伝子
と炎症性遺伝子の正常値を、２０人の正常血ドナーからの遺伝子発現パターンを
評価することによって確立した（図５参照）。
【００５７】 ベースライン遺伝子発現を、急性ＨＣＶ感染の患者で評価した。定量的解析を
遺伝子発現スコア（ＧＥＳ）として図５に示す。図５では、各遺伝子について得
られた定量値が、２０人の正常血ドナーで測定された正常発現遺伝子レベルの平
均に対するその比に基づき、スコアとして与えられる。急性感染患者で観察され
た遺伝子発現の最高レベルは、γ−インターフェロンによって特異的に誘導され
ることが知られているＩＰ−１０遺伝子であった。γ−インターフェロンの予期
された上昇と、評価されたマクロファージ炎症性遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ
とＴＮＦ−α）の大部分の上昇が、ＩＰ−１０のこの上昇と関連した。ベースラ
イン／正常値で発現された遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、Ｉ
Ｌ−１０が挙げられる。明らかに、この遺伝子発現パターンは、患者の血液（肝
臓でもリンパ節ではない）から単離された未刺激細胞で観察された。
【００５８】 ８人の慢性感染患者の血液からの遺伝子発現値の平均は、進行している免疫応
答と一致した急性感染試料と同様の遺伝子発現のパターンを示した。しかし、実
際のＧＥＳ値は、慢性ＨＣＶ感染の患者ごとに大きく変わった。各遺伝子の平均
値を図５に示す。実際の遺伝子発現値とＧＥＳを、図６Ａ（ベースライン）と図
６Ｂ（ＰＭＡ誘導）に示す。血液中で検出されるこの進行している応答が、肝臓
内に存在するならば、進行性ＨＣＶ肝臓疾患で観察されたものと一致した進行性
炎症性損傷を生じえよう。
【００５９】 肝生検分析を用いる初期の研究によって、Ｔ細胞過剰活性化がＨＣＶ疾患の患
者で観察されるであろうことが予測された。Burgioら，Hepatology ２7: 1600−
6 (1998)； McGuinnessら，Gut 46: 260−9 (2000)を参照のこと。この予測を試
験するために、急性及び慢性ＨＣＶ疾患患者からの末梢血単核細胞を、ＰＭＡと
イオノマイシンで刺激した。急性ＨＣＶ感染の患者で観察された遺伝子発現パタ
ーン（図７に示す）は予期されないものであった。このように、急性感染患者で
誘導されたＩＬ−２及びＩＬ−１０遺伝子発現は、対照値より劇的に低く（ＧＥ
Ｓの正常範囲外）、このことは、急性ＨＣＶ感染に伴うＴ細胞活性化の実質的な
阻害を示唆した。Ｔ細胞活性化のこの阻害とγ−インターフェロンの産生阻害は
、マクロファージ炎症性サイトカインと、通常はγ−インターフェロンによって
誘導されるＩＰ−１０などのケモカイン遺伝子における永続する上昇と相伴った
。この観察は、γ−インターフェロン遺伝子発現の上昇と一緒に図５で観察され
たＩＰ−１０値が、Ｔ細胞産物ではなかったかもしれないことを示唆する。何故
ならば、この遺伝子の誘導性は劇的に阻害されるからである。Ｔ細胞以外の血液
細胞におけるインターフェロン遺伝子発現の他の唯一の源は、理論的には、ウイ
ルス感染患者で免疫応答を開始させるのに活性であることもまた知られているナ
チュラルキラー細胞集団であろう。急性ＨＣＶ感染で観察されたＴ細胞活性化の
阻害のように、慢性ＨＣＶ感染の８人の患者の平均ＧＥＳは、Ｔ細胞活性化と慢
性マクロファージ活性化の阻害のパターンを示した。
【００６０】 図６Ｂと７に示したデータは、ＩＬ−２レベルの上昇及びタンパク質レベルで
のＴ細胞の過剰活性を示したＨＣＶ肝臓疾患の患者において従来報告された実験
と著しい相違を示す。Martinら, Cytokine 11:267−73(1999)を参照。観察され
た遺伝子発現パターンが肝臓炎症病理の程度と関連するか否かを決定するために
、対応する肝生検試料を読み取り、標準的な評価基準を用いて炎症グレードをス
コア付けした。図８は、肝臓炎症スコアと、現在の研究で測定された炎症性遺伝
子からのＧＥＳ値の利用に基づくスコアリングシステムとの間の相関性を示す（
図９）。高度の相関性が、ＭＧＥＳ（多重遺伝子(multigene)発現スコア）と肝
臓の炎症の程度との間で見出された。
【００６１】 組織学的肝臓炎症の程度が、誘導された遺伝子発現解析と関連することが示さ
れた（図１０）。初期のＩ期の疾患では、遺伝子発現の誘導の最も強い阻害が観
察された。肝臓炎症の進行の間、阻害の程度は徐々に逆転し、ＩＩＩ期の炎症ま
でに、遺伝子活性化の程度は上昇した。これは従来の報告と一致する。ＩＬ−１
０発現の誘導は、後期の患者でさえ永続的に低い（図６Ｂ）。
【００６２】 ＭＧＥＳ評価と、ケア測定の現在の標準（即ち、ＡＬＴ血液測定と、ＨＣＶ定
量的ウイルス負荷測定）との間の関係を試験すると、図４に示す各々の患者につ
いてのＡＬＴ値とＨＣＶウイルス負荷は、図８と図１０に示す研究に類似する肝
臓炎症の程度と相関した。ＡＬＴ測定（ｒ2：２４）もウイルス負荷定量（ｒ2：
１５）も、ＭＧＥＳと著しく相違して（図８と図１０について、それぞれｒ2：
０．９４及び０．７８）、肝臓生検試料の炎症スコアとの間の相関性を示さなか
った。
【００６３】 これらのデータは、ＨＣＶ疾患の患者の評価のための新規な試験システムを示
す。血液ベースの遺伝子発現パターンと肝臓炎症の高程度の相関により、ＨＣＶ
感染の患者の病期分類を可能とする。特に、急速ＲＴ−ＰＣＲ法の使用は、従来
の方法よりも早く、危険性が少なく、より安価であるインサイチュでの肝臓炎症
の程度を評価するための臨床的パラメーターを提供する。
【００６４】 （材料及び方法） （急性及び慢性ＨＣＶ感染の患者に由来するＰＢＭＣにおける免疫活性化遺伝
子発現） 血液試料を、図４に記載される急性感染した１人の患者及び８人の患者から得
た。Ficoll Hypaque分離後、ＰＢＭＣを、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６
４０中に３７℃で３時間置き、次いで洗浄とＲＮＡ抽出を行った。University B
lood Bank (Heidelberg, Germany)での２０人の正常血液バンクドナーから得た
血液において同一方法を行った。ｃＤＮＡを合成し、上記のようにLightCycler
ベースＰＣＲを行った。各試料において、４種の内部ハウスキーピング遺伝子を
ＲＴ−ＰＣＲ解析に含めた。これらは、β−アクチン、ＨＰＲＴ、ＣＰＢ及びＧ
６ＰＤ遺伝子を含んだ。これらの４種の遺伝子を用い、各試料に含まれるＲＮＡ
の量を規格化し、全ての遺伝子発現スコア（ＧＥＳ）を、内部標準化ハウスキー
ピング遺伝子コピー数規格化データに基づくＲＮＡコピー数を用い決定した。ハ
ウスキーピング遺伝子の標準化コピー数に基づいて計算したコピー数を、図６に
示す遺伝子の各々について得た。
【００６５】 ＰＣＲプライマー（Search-LC, Heidelberg，Germany）を用い、１３種の遺伝
子を評価した。２０人の正常血液ドナーについて得た遺伝子発現値の平均を、評
価した１３遺伝子の各々について遺伝子発現スコア１として確立した。図５に示
すデータは、急性ＨＣＶ感染患者血液試料（Ａ）、及び８人の慢性ＨＣＶ感染患
者血液試料（Ｃ）の平均の推定コピー数を表す。２０の絶対的に最小から最大ま
での２０人の正常血液ドナーのＧＥＳ範囲は、図５にグラフで示される各値未満
である。図５にプロットしたデータは、全ての患者の遺伝子発現の単一測定を表
す。１人は急性感染（Ａ）を表し、一緒にした８人の患者は、慢性感染患者から
の平均値を表す。慢性感染患者から得た遺伝子発現値は、広範に変動し、そして
値を図６に示す。
【００６６】 （急性対慢性ＨＣＶ感染患者から得たＰＢＭＣにおける誘導された遺伝子発現
） 急性及び慢性ＨＣＶ感染患者並びに２０人の正常血液ドナーから、上記のよう
に血液を得た。ＰＢＭＣを単離し、上記のようにＰＭＡとイオノマイシンと共に
３７℃で培養し、急性のＴ細胞活性化を誘導した。インキュベーションの３時間
後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、上記のようにLightCyclerベースＰＣＲを
行った。図７に示すＧＥＳを、ハウスキーピング遺伝子発現に基づく遺伝子発現
の標準化に基づき計算した。図７に示すデータは、２０人の正常血液ドナー試料
から計算したＧＥＳの平均と比較した、急性ＨＣＶ感染患者、及び８人の慢性Ｈ
ＣＶ感染患者の平均についてのＧＥＳを表す。２０人の正常血液ドナー患者につ
いて評価した遺伝子の各々について最小値から最大値までの範囲も図７の下に示
す。図７に示したデータは、２つのカテゴリー（マクロファージ活性化を表す遺
伝子と比較される、Ｔ細胞活性化を表す遺伝子）に分けられる。急性感染（Ａ）
を、図１０において、慢性ＨＣＶ感染の８人の患者の平均値と比較する。慢性感
染患者の値は、非常に変動し、そして図６Ｂに示される。
【００６７】 （ＨＣＶ疾患の患者の未刺激ＰＢＭＣにおける多重遺伝子発現スコア） 推定ＧＥＳ値と共に図６に示される遺伝子発現値を、遺伝子発現評価に無関係
の病理学者から独立して得られた肝臓炎症スコアに基づいて階層化した。多重遺
伝子発現スコア（ＭＧＥＳ）を、図４に示す患者に由来する以下の遺伝子からの
遺伝子発現値を利用して決定した（ＴＮＦα、ＩＰ１０、ＭＩＰ−２α、インタ
ーフェロン−γ、ＭＲＰ１４）。ＭＧＥＳ計算に関与する各患者の発現遺伝子の
ＧＥＳを図９に示す。次いで、各患者のＭＧＥＳ計算スコアを、独立した病理学
的評価によって決定した肝臓炎症スコアに基づきプロットした。このデータをプ
ロットし、図８に示す。２０人の正常患者にも、平均１で０〜２のＭＧＥＳを示
す正常範囲として図に表されるＭＧＥＳスコアを与えた。急性ＨＣＶ感染の患者
を、ＭＧＥＳスコア１０で示す。ＭＧＥＳスコアと肝臓炎症スコアとの間の統計
的関係をｒ2値として示す。
【００６８】 （ＨＣＶ疾患患者の未刺激ＰＢＭＣにおける多重遺伝子発現スコア） 図８に示されたデータのために使用されたＭＧＥＳ法と同様に、図９に示すよ
うに、誘導ＧＥＳスコアに基づき、ＭＧＥＳを決定した。ＭＧＥＳ決定は、次に
、ＭＧＥＳスコアの組み合わせ（全ての３種の遺伝子を含む）に変換される各々
の個々の遺伝子について評価した計算されたＧＥＳに基づいた。正常範囲を示す
。−３〜０の範囲を有する平均１が正常範囲と呼ばれる。急性ＨＣＶ感染を、計
算ＭＧＥＳ−２．５で示す。ＭＧＥＳスコアと肝臓炎症スコアとの間の統計的関
係をｒ2値として示す。
【００６９】 本発明を、実施例及び特に好適な実施態様に言及して詳細に説明したが、当業
者は、本発明の思想と範囲を逸脱することなく種々の改変が本発明になされうる
ことを理解しよう。上記で引用した全ての刊行物は引用により本明細書に含まれ
るものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マクロファージ活性化サイクルの概略図を示し、このサイクルにおい
て、均衡マクロファージ活性化を達成するために、マクロファージ機能の様々な
形式の活性化およびリサイクリングの間に多数の段階が存在する。
【図２】 図２は、ＷＦ１０での処置後の患者（＃１４）におけるプロ炎症性サイトカイ
ンの遺伝子発現における変化を示す。レベルの減少は、処置に対する良好な予後
および良好な応答を示す。
【図３】 図３は、ＷＦ１０での処置後の患者（＃１５）におけるプロ炎症性サイトカイ
ンの遺伝子発現における変化を示す。レベルは、最初から低く、処置によって変
化しない。これは、治療が不必要であり、患者が良好な予後を有することを示す
。
【図４】 図４は、実施例２において研究される患者の特徴を要約する。患者は、ＨＣＶ
疾患の治療に関するＷＦ１０の可能性を評価する有望なフェーズＩＩ研究に参加
していた。ベースラインとなる血液試料は、研究用のペア肝生検（paired liver
biopsy）を用いてこれらの患者から入手可能であった。全ての患者の病歴およ
び試料をヒトでの研究に関する倫理委員会によって承認されたプロトコールに従
って得た。急性感染した患者は、ＷＦ１０による処置について評価されていなか
ったが、研究の審査医師の一人に提示された。ヒト被検体の同一の承認診断基準
を用いてこの患者の試料を評価した。慢性ＨＣＶ感染に罹患した８人の患者から
基準の人口統計学的データおよび実験データを得た。ＷＦ１０の臨床試験への参
加の前にこれらの患者から採血し、採血の２週間以内に肝生検を実施したことを
除いて、患者はいずれの診断基準によっても選択されなかった。さらに、ＨＣＶ
遺伝子発現レベルおよび肝機能試験の実験値は、同一の２週間の時間幅内で得ら
れた。別の病理学者によって評価された患者から肝生検試料を得た。この病理学
者は、標準の４点等級付けシステム（4-point grading system）に基づいて炎症
グレードを評点した。遺伝子発現評価の終りにのみ、肝生検試料、実験値および
遺伝子発現の値に関する全てのデータが最終のデータ解析用にプールされた。こ
の研究において、患者４だけが、前もってインターフェロンおよびリビバリンで
処置され、研究に入る前の３ヶ月間は治療を全く受けていなかった。
【図５】 図５は、急性および慢性のＨＣＶ感染に罹患した患者由来のＰＢＭＣにおける
免疫活性化遺伝子発現を示す。
【図６】 図６Ａは、データが図５に要約される患者に関する実際のベースラインとなる
遺伝子発現値およびＧＥＳを示す。 図６Ｂは、データが図７に要約される患者に関する実際の誘導された遺伝子発
現値およびＧＥＳを示す。
【図７】 図７は、急性対慢性のＨＣＶ感染患者から得られたＰＢＭＣにおいて誘導され
た遺伝子発現を示す。
【図８】 図８は、ＨＣＶ疾患に罹患した患者の未刺激ＰＢＭＣにおける多重遺伝子発現
スコアを示す。
【図９】 図９は、ＭＧＥＳ値計算に使用されるスコアリングシステムを示す。
【図１０】 図１０は、ＨＣＶ疾患に罹患した患者の刺激されたＰＢＭＣにおける多重遺伝
子発現スコアを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月３日（２００２．６．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マクグラス、マイケル アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94080、サウス サン フランシスコ、601 ゲイトウェイ ブルヴァード、スウィー ト 450、オクソ ケミー、インコーポレ イティッド (72)発明者 モイヤー、ステファン ドイツ国、69120 ハイデルベルク、イム ノイエンハイマー フェルト 280、ア プタイルング アンゲヴァンテ イムノロ ギー ウント ファクルテート フュア テオレーティシェ メディツィン、デーカ ーエフツェット Ｆターム(参考） 2G045 AA25 CA25 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB07 FB12 4B024 AA13 AA14 BA21 CA04 CA09 EA04 HA14 4B063 QA19 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS34

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、臨床的
    な状態または症状に罹患した患者について臨床結果を評価する方法： （ａ）該患者由来の臨床用試料を提供する工程； （ｂ）該臨床用試料中の細胞における、予め選択された１セットの遺伝子の細
    胞内発現レベルを測定する工程；および （ｃ）該発現レベルを１セットの参照発現レベルと比較する工程であって、予
    め選択された１以上のセットの遺伝子の発現レベルの偏差が、該患者に関する臨
    床結果の指標となる、工程。
  2. 【請求項２】 該臨床用試料が血液、組織または脳脊髄液のサンプルである
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該臨床用試料が血液のサンプルである請求項２に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 少なくとも３つの遺伝子の発現レベルが測定される請求項１
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】 少なくとも１つのプロ炎症性サイトカインの発現レベルが測
    定される請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 少なくとも３つのプロ炎症性サイトカインの発現レベルが測
    定される請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 該遺伝子が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、
    ＩＰ−１０およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される請求項６に記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 該臨床的な状態または症状が炎症性障害である請求項１〜７
    のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 該炎症性障害が慢性炎症性障害である請求項８に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 該慢性炎症性障害が、慢性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢
    性閉塞性肺疾患、炎症性粘膜疾患、自己免疫疾患、痴呆、心臓血管疾患および癌
    からなる群から選択される請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該炎症性粘膜疾患が、炎症性腸疾患、クローン病および大
    腸炎からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該痴呆がＡＩＤＳ関連痴呆またはアルツハイマー病である
    請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該癌がリンパ腫、前立腺癌および結腸癌からなる群から選
    択される請求項１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該臨床結果が治療的介入に対する応答である請求項１〜１
    ３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該治療的介入が薬物による治療である請求項１４に記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 該薬物が、安定化された亜塩素酸塩溶液である請求項１５
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該安定化された亜塩素酸塩溶液がＷＦ−１０である請求項
    １６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該臨床的な状態または症状がＨＩＶ感染である請求項１、
    １５、１６または１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該臨床的な状態または症状がＡＩＤＳである請求項１８に
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】 予測される臨床結果が、予め決定された日付における患者
    の生存率である請求項１〜１３、１８または１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 予測される臨床結果が６ヶ月後の患者の生存率である請求
    項１５に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 定量的なポリメラーゼ連鎖反応によって遺伝子発現のレベ
    ルが測定される請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ポリメラーゼ連鎖反応が逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反
    応である請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 増幅産物の蛍光検出を用いて該ポリメラーゼ連鎖反応が実
    行される請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該臨床的な状態が同種移植拒絶である請求項１に記載の方
    法。
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