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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) zur Suppression des Immunsystems sowie pharmazeutische Zusammensetzungen,
enthaltend mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I),
zur Suppression des Immunsystems.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Verbindungen
der allgemeinen Formel (I) sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend
mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), zur Prophylaxe
und/oder Behandlung von entzündlichen
Zuständen
und/oder entzündlichen
Erkrankungen, von Zuständen
und/oder Erkrankungen, die mit einer überschießenden Reaktion des Immunsystems
assoziiert sind, von Abstoßungsreaktionen
nach einer Transplantation sowie von Autoimmunerkrankungen.
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Reaktionen
des Immunsystems werden durch die Komponenten des angeborenen und
erworbenen Immunsystems vermittelt. Das angeboren unspezifische
Immunsystem umfasst alle Reaktionen auf antigene und körperfremde
Stimuli (Bakterien, Viren, Pilze, etc), die von Makrophagen, Monocyten und
Granulozyten ausgehen, sowie humorale Abwehrmechanismen einschließlich Komplementsystem,
Interferon, Defensine und Akute-Phase-Proteine.
Das erworbene oder adaptive Immunsystem umfasst alle spezifischen
Abwehrreaktionen, die von Lymphozyten, insbesondere von B-Lymphyzyten (B-Zellen)
und T-Lymphozyten (T-Zellen), ausgehen.
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Das
Immunsystem ist sehr komplex und streng reguliert, enthält aber
viele alternative Regulationswege, die eine Störung einzelner Teile des Systems
ausgleichen können.
Unter bestimmten Bedingungen können
die Reaktionen des Immunsystems selbst Ursache von Erkrankungen
oder krankheitsrelevanten Zuständen
sein. Solche Erkrankungen oder Zustände sind z.B. akute und chronische
Entzündungen,
Sepsis, Autoimmunerkrankungen oder Abstoßungsreaktionen nach Organ-,
Zell- oder Gewebetransplantation. Bei diesen und anderen Zuständen, in
denen eine inadäquate
oder unerwünschte
Immunantwort auftritt, ist eine Immunosuppression aus klinischer
Sicht erforderlich.
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Die
Reaktionsmechanismen, die zu inadäquaten oder unerwünschten
Immunreaktionen führen,
sind unterschiedlich und in vielen Fällen noch nicht aufgeklärt. Jedoch
sind in den meisten Fällen sowohl
Zellen des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystem einschließlich ihrer
sezernierten regulatorisch wirksamen Mediatoren, den Zytokinen/Interleukinen
beteiligt.
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Ein
Beispiel sind Entzündungen,
die durch pathogene Keime oder durch mechanische Reize ausgelöst werden
und in vielen Fällen
zur Aktivierung von Monozyten/Makrophagen führen, die dadurch zur Sekretion
von inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 und HMG angeregt
werden. Die kontrollierte Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen
ist Bestandteil eines komplexen biochemischen Prozesses, der letztendlich
auf die Abwehr von Pathogenen gerichtet ist und für die Geweberegeneration
den Boden bildet. Anti-inflammatorische
Zytokine wie TGF-β1
und IL-10 fungieren als Gegenspieler der Entzündungsmediatoren und tragen
zum geregelten Abklingen einer Entzündungsreaktion bei.
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Eine
exzessiv gesteigerte oder ungeregelte Synthese von inflammatorischen
Zytokinen steht in engem Zusammenhang mit Erkrankungen wie Rheumatoider
Arthritis (Connell and Mclnnes, 2006), Spondylitis,
Osteoarthritis, Sepsis, Septischem Schock (Hildebrand et
al. 2005), zerebraler Malaria, chronisch entzündlichen
Lungenerkrankungen, Silikose, Sarkoidose, Reperfusionssyndrom (Husted and
Lentsch, 2006), Crohn'scher
Erkrankung Pazianas et al. 2006), Colitis Ulzerosa
(Ghezzi and Cerami, 2005), Fieber bei Infektionen,
Kachexie infolge Infektion und Krebs sowie Kachexie bei AIDS-Erkrankten
(Delano and Moldawer, 2006).
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Für eine Reihe
von Erkrankungen werden Entzündungen,
bei denen inflammatorische Zytokine in Geweben nachgewiesen werden,
auch als Ausgangspunkt bzw. Ursache angesehen. So findet man entzündliche
Gewebsreaktionen bei der Alzheimer'schen Erkrankung (Wyss-Coray,
2006) bei Depression (Pace et al. 2006),
bei Morbus Parkinson (Wersinger and Sidhu, 2006)
sowie bei den meisten Krebsarten wie Prostastakrebs, Brustkrebs,
Magenkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs und Pankreaskrebs
(Dinarello 2006).
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Dies
erklärt
auch, dass die Ausschaltung von inflammatorischen Zytokinen das
Ziel neuer Behandlungsmethoden bei entzündlichen Erkrankungen ist.
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Im
Patent
US20040005316 wird
die Verwendung von Fragmenten des HMG (High mobility group Protein)
als antiinflammatorische Substanz beschrieben.
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US7091181 erklärt die Verwendung
von löslichem
TNF-alpha Rezeptor zur Behandlung von Entzündungen.
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Bei
vielen entzündlichen
Prozessen sind ebenfalls T-Zellen und B-Zellen der spezifischen
zellulären
Abwehr beteiligt. T-Zellen können
sich nach Kontakt mit einem Antigen zu inflammatorischen T-Zellen
(Th1-Zellen), zur T-Helferzellen (Th2-Zellen) oder zu zytotoxischen
T-Zellen differenzieren. Zytotoxische T-Zellen töten veränderte körpereigenen Zellen (z.B. Krebszellen,
virusinfizierte Zellen) und nicht-immunkompatible fremde Körperzellen
(z.B. Zellen eines Transplantates) ab (Steiner et al. 2006). Im
Zusammenspiel dieser unterschiedlichen Zelltypen werden unterschiedliche
Zytokine mit regulatorischen Funktionen freigesetzt. So führt die
Aktivierung von Th1-Zellen zur Freisetzung von IFN-γ, das wiederum
Makrophagen des unspezifischen angeborenen Immunsystems aktiviert
und zur Steigerung der Expression von MHC-Molekülen auf unterschiedlichen Zellen
führt und
damit an der Kontrolle der Immunantwort beteiligt ist.
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MHC-Klasse
II Moleküle
sind dabei Schlüsselmoleküle der Antigenerkennung
und für
die Präsentation
gegenüber
T-Zellen verantwortlich. Die Regulation der Expression der MHC-Moleküle beeinflusst
direkt die T-Zellaktivierung und damit die Immunantwort. MHC-Molekül-vermittelte Aktivierungen von
Th1-Zellen können
zytotoxische T-Zellen modulieren und indirekt zur Abstoßung von
Transplantaten führen.
Zytokine aus Th1-Zellen sind mit Autoimmunerkrankungen assoziiert.
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Im
Patent
US20055187285 wird
die Verwendung von Statinen zur Hemmung der Expression von MHC-Klasse
II Molekülen
als antiinflammatorische und immunsuppressive Therapie offen gelegt.
Statine hemmen die durch Interferon-γ induzierte Expression von MHC-Molekülen und
unterdrücken
dadurch die MHC-Klasse II vermittelte T-Zellaktivierung.
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Zur
Behandlung solcher Erkrankungen oder Zustände werden Antiphlogistika
und Immunsuppressiva verwendet.
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Eine
antiphlogistisch oder antiinflammatorisch wirkende Substanz ist
eine Substanz, die in der Lage ist, partiell oder total, unmittelbar
oder zeitversetzt eine Entzündung
oder eine ihrer Manifestationen zu vermindern oder zu hemmen. Eine
antiinflammatorisch wirkende Substanz kann entweder auf lösliche Mediatoren
wie Zytokine gerichtet sein, oder die Expression von bestimmten
an einer Entzündungsreaktion
beteiligten zellulären
Oberflächenrezeptoren
wie z.B. MHC-Klasse II Moleküle
modulieren.
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Eine
immunsuppressorisch wirkende Substanz ist eine Substanz, deren Wirkung
auf das Immunsystem zu einer unmittelbaren oder verzögerten Reduzierung
der Aktivität
mindestens eines Schenkels des immunologischen Systems führt. Eine
immunsuppressorisch wirkende Substanz wird dann eingesetzt, wenn
es zu einer überschießenden Immunantwort
kommt z.B. gegen körpereigene
Moleküle
oder Gewebe, oder gegen transplantiertes Gewebe, z.B. Autoimmunerkrankungen,
Typ I Diabetes, Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis.
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Derzeit
verwendete Antiphlogistika sind z.B. Azetylsalizylsäure, Diclophenac,
Indometacin oder Glukokortikoide.
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Aus
der Gruppe der Immunsuppressiva werden Zellteilungshemmer (Azathioprin)
Calcineurin-Inhibitoren (Tacrolimus, Ciclosporin, Pimecrolimus) und
Kortison (Prednisolon) eingesetzt. Bekannte Calcineurin-Inhibitoren
hemmen nach Bindung an Immunophiline wichtige Signalwege in T-Zellen,
was letztendlich zur Hemmung der Synthese proinflammatorischer Th1-Zellen
führt.
Nebenwirkungen sind Bluthochdruck, Zahnfleischschwellungen und Nierenfuktionsstörungen.
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Trotz
gewisser klinischer Erfolge bei Verwendung dieser Therapeutika gibt
es gegenwärtig
keine adäquaten
und effektiven Therapien zur erfolgreichen Bekämpfung von Immunzell- und Zytokin-vermittelten
Erkrankungen wie z.B. Rheuma und Sepsis bzw. zur Verhinderung von
Immunzell-vermittelten Abstoßungsreaktionen
nach Transplantationen.
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Zudem
haben die derzeit verwendeten Medikamente häufig den Nachteil einer zu
hohen Spezifität.
Sie haben eine hohe Toxizität
und bergen die Gefahr der Induktion einer Krebsentwicklung in sich.
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Deshalb
besteht ein Bedarf an Substanzen, die effektiv und nebenwirkungsarm
gleichzeitig unterschiedliche Teilbereiche des immunologischen Netzwerkes
unterdrücken
können.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen zur
Suppression des Immunsystems, insbesondere bei gesteigerter Immunreaktion,
bereitzustellen, die ungiftig, nichttoxisch und nicht mutagen sind
und die gleichzeitig unterschiedliche Teilbereiche des immunologischen
Netzwerkes unterdrücken
können.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe gelöst durch
die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Suppression
des Immunsystems,
wobei R1 ein verzweigter
oder unverzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxyalkyl-,
Alkoxycarbonylalkyl- oder Arylrest ist, R2 -H, ein verzweigter oder
unverzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxyalkyl-, Alkoxycarbonylalkyl-
oder Arylrest ist, R3 -OH und R4 -H oder R3 -H und R4 -OH ist.
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Die
Aufgabe wird ebenfalls gelöst
durch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Suppression des Immunsystems,
enthaltend mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I),
wobei R1 ein verzweigter
oder unverzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxyalkyl-,
Alkoxycarbonylalkyl- oder Arylrest ist, R2 -H, ein verzweigter oder
unverzweigter Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxyalkyl-, Alkoxycarbonylalkyl-
oder Arylrest ist, R3 -OH und R4 -H oder R3 -H und R4 -OH ist.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 25 sowie 27 bis
50 enthalten.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wie
zum Beispiel Ethyllaktat, insbesondere Ethyl-D-Laktat, in der Lage
sind, die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen aus stimulierten
Blutzellen sowohl nach unspezifischer Stimulation (z.B. durch bakterielles
Lipopolysaccharid), nach antigener Stimulation und/oder nach mitogener
Stimulation zu hemmen.
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Durch
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wird die Zytokinfreisetzung
sowohl aus Monozyten/Makrophagen als auch aus T-Helferzellen gehemmt.
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Überraschenderweise
wurde gefunden, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wie
zum Beispiel Ethyllaktat, insbesondere Ethyl-D-Laktat, zudem in
der Lage sind, die Expression von MHC-Molekülen auf spezifischen Immunzellen
zu reduzieren.
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Die
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verfügen somit über immunsuppressorische Eigenschaften.
Vorteilhaft wirken sie auf unterschiedliche Teilbereiche des immunologischen
Netzwerkes. Zudem sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
ungiftig, nichttoxisch und nicht mutagen.
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Eine
Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Hemmung
der Freisetzung von Zytokinen aus Blutzellen, zur Reduktion der
Expression von MHC-Molekülen oder
als Immunsuppressivum war bislang nicht bekannt.
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Besonders
die Wirkung von D-Laktatestern wie Ethyl-D-Laktat ist überraschend,
da D-Laktat als in Säugerzellen
nicht verstoffwechselbar gilt und man gleiches auch für D-Laktatester
annehmen musste.
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Vorzugsweise
enthält
R1 ein bis acht Kohlenstoffe. R2 enthält vorzugsweise ein bis acht
Kohlenstoffe. R1 und/oder R2 ist vorzugsweise ein Methyl-, Ethyl-,
Propyl-, Isopropyl-, Butyl- oder Isobutyl-Rest.
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In
besonders bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung ist die Verbindung der allgemeinen Formel (I) Methyllaktat,
Ethyllaktat, Isopropyllaktat, Butyllaktat, Isobutyllaktat oder Ethyl-2-Hydroxybutyrat.
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Vorzugsweise
wir ein D-Enantionmer, ein L-Enantionmer oder ein äquimolares
oder nicht äquimolares
racemisches Gemisch von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
eingesetzt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung der
allgemeinen Formel (I) Ethyl-D-Laktat.
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Bestandteil
der Erfindung sind ebenfalls die Verwendung von Verbindungen der
allgemeinen Formel (I) sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) enthält, zur
Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die bei denen die
Konzentrationen von inflammatorischen Zytokinen erhöht sind,
und/oder zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen, die
durch die Behandlung die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen
und/oder zellvermittelte immunologischen Reaktionen verhindert werden
soll.
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Die
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sowie die pharmazeutische
Zusammensetzung, die mindestens eine Verbindung der allgemeinen
Formel (I) enthält,
werden z.B. zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen
und/oder Zuständen
bei Säugetieren
und beim Menschen eingesetzt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von entzündlichen Zuständen und/oder
entzündlichen
Erkrankungen verwendet. Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls
eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von entzündlichen Zuständen und/oder entzündlichen
Erkrankungen.
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Entzündliche
Erkrankungen sind z.B. Rheumatoide Arthritis, Spondylitis, Osteoarthritis,
Sepsis, septischer Schock, zerebrale Malaria, eine chronisch entzündliche
Lungenerkrankung, Silikose, Sarkoidose, Reperfusionssyndrom, Crohn'sche Erkrankung, Colitis
ulzerosa, Fieber bei Infektionen oder eine Kachexie infolge Infektion
oder Krebs oder eine Kachexie bei AIDS-Erkrankten. Entzündliche
Zustände
sind z.B. Gewebsveränderungen,
insbesondere entzündliche
Gewebsveränderungen,
die mit Alzheimer, Depression, Parkinson oder Krebserkrankungen
assoziiert sind.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen und/oder Erkrankungen verwendet,
die mit einer überschießenden Reaktion des
Immunsystems assoziiert sind. Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls
eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Zuständen und/oder
Erkrankungen, die mit einer überschießenden Reaktion des
Immunsystems assoziiert sind.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Abstoßungsreaktion nach einer Transplantation
verwendet. Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Abstoßungsreaktion
nach einer Transplantation, z.B. nach einer Organ-, Zell- oder Gewebetransplantation.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet. Bestandteil
der Erfindung ist ebenfalls eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur
Prophylaxe und/oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
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Vorzugsweise
werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in einer therapeutisch
effektiven Dosis eingesetzt. In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung liegt die Verbindung der allgemeinen Formel (I)
vorzugsweise in einer therapeutisch effektiven Dosis vor.
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Die
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung enthält
vorzugsweise mindestes eine weitere therapeutisch aktive Substanz.
Die weitere therapeutisch aktive Substanz ist z.B. ausgewählt aus
der Gruppe der Antiphlogistika, der Antikörper gegen inflammatorische
Zytokine, der löslichen Rezeptoren
inflammatorischer Zytokine oder der Immunsuppressiva. Vorzugsweise
ist die weitere therapeutisch aktive Substanz ein Glukokortikoid,
Azetylsalizylsäure,
Diclophenac, Indometacin, Ciclosporin, Azathioprin oder Prednisolon.
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In
weiteren Ausführungsformen
der Erfindung enthält
die pharmazeutische Zusammensetzung einen oder mehrere pharmazeutische
Hilfs- und/oder Zusatzstoff(e), wobei als Hilfsstoffe vorzugsweise
Füllstoffe,
Geruchsstoffe und/oder Stabilisatoren eingesetzt werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung erfolgt die Applikation topisch oder systemisch. Die
Applikation erfolgt z.B. intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal,
oral, rektal, nasal, percutan, pulmonär oder transdermal, als Aerosol, als
Spüllösung, über Minipumpen,
als Mundspülung, als
Creme, als Paste, als Lotion, als Bad, als Gel, als Pflaster oder
als Salbe.
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Bestandteil
der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
als Nahrungsmittelzusatz sowie eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung, die in Form einer galenischen Zubereitung vorliegt,
welche die kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs erlaubt.
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Anhand
der folgenden Figuren und Beispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne
diese einzuschränken.
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Dabei
zeigen
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1:
Hemmung der TNF-alpha Sekretion durch Ethyl-D-Laktat Hemmung der
Freisetzung von TNF-α aus
menschlichen Blutzellen durch Ethyl-D-Laktat (DEL) nach Stimulation
mit bakteriellem Lipopolysaccharid
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2:
Hemmung der HLA-DR Expression durch Ethyl-D-Laktat Hemmung der Expression
von HLA-DR Molekülen
(= MHC-Klasse II Molekül)
auf Monozyten/Makrophagen durch Ethyl-D-Laktat (DEL) nach Stimulation
von menschlichem Blut mit bakteriellem Lipopolysaccharid (Daten
wurden durch FACS-Analyse erhalten).
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3:
Hemmung der Interferon-γ Bildung durch
Ethyl-D-Laktat Hemmung der Th1-Zellaktivierung (messbar an der Hemmung
der Bildung von Interferon gamma) nach Stimulation von humanen peripheren
polymorphkernigen mononuklearen Zellen (PBMC) mit einem spezifischen
Antigen (Rötel-Virus-Antigen)
und einem unspezifischen Mitogen (Phythemagglutinin, PHA) durch
Ethyl-D-Laktat. Die Messung erfolgte in einem ELISPOT Assay. Die
angegebenen Zahlen repräsentieren
die Anzahl positiver Interferon-gamma sezernierenden Zellklone.
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Ausführungsbeispiel
1
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Hemmung der Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen
durch Ethyl-D-Laktat
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200 μl humanes
heparinisiertes Blut wurden mit RPMI-Medium und Additiven bis zu
einem Volumen von 1 ml in 24-Well Kulturplatten versetzt. Die Blutzellen
wurden mit 10 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) (E. coli Serotyp O111:64)
(Sigma, Heidelberg) stimuliert und 6 Stunden bei 37°C inkubiert.
Negativkontrollen enthielten kein LPS. Entsprechende Kavitäten enthielten
Ethyl-D-Laktat in ansteigenden Konzentrationen zusammen mit 10 ng/ml
LPS. Weitere Kontrollen enthielten nur Ethyl-D-Laktat ohne LPS. Nach
der Inkubation wurden die Proben zentrifugiert (5000 rpm, 5 Minuten)
und die Überstände immunologisch
auf inflammatorische Zytokine getestet. Die Bestimmung der Zytokine
erfolgte unter Verwendung des CBA Human Inflammatory Kit (no. 551811)
von BD Biosciences Pharmingen (Heidelberg, Germany) (1).
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Das
Experiment zeigt, dass nach Stimulation mit LPS humane Monozyten/Makrophagen
mit einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-1, IL-6,
IL-8) antworten. Beispielgebend ist hier nur die Messung der Konzentration
von TNF-α in 1 angegeben.
In Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von Ethyl-D-Laktat
(DEL) nimmt die Freisetzung inflammatorischer Zytokine signifikant
ab, wodurch DEL immunsuppressorisch wirkt.
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Ausführungsbeispiel
2
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Reduktion der HLA-DR Expression auf humanan
Monozyten durch Ethyl-D-Laktat
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200 μl humanes
heparinisiertes Blut wurden mit 200 μl RPMI-Medium in Abwesenheit
oder Anwesenheit von 10 ng/ml Lipopolysaccharide (E. coli Serotyp
O111:84) (Sigma, Heidelberg), mit und ohne Ethyl-D-Laktat 6 Stunden
bei 37°C
im CO2-Inkubator inkubiert. Die inkubierten
Proben werden danach in vorgekühlte
FACS-Röhrchen
gegeben und 3× mit Wachpuffer
(PBS + 1% FKS) gewaschen. Nach der letzten Zentrifugation wurden
je 100 μl
des Zellsediments entnommen und mit je 5 μl APC-markiertem Anti-HLA-DR
Antikörper
(Cat.No. 340549, BD Biosciences) 30 Minuten bei 4°C inkubiert.
Als Isotypkontrolle wurde ein Maus IgG2a-Antikörper (Cat.No. 555576, BD Bioscience)
verwendet.
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Anschließend erfolgt
die Lyse der Erythrozyten durch Zugabe von BD-Lysepuffer. Nach 10
Minuten wurden die Zellen je 3× mit
Waschpuffer gewaschen. Nach der letzten Zentrifugation erfolgte
die Fixierung der Zellen mit 250 μl
2% Paraformaldehyd (Cat.No. 41678-0250, ACROS Organics). Die Proben
wurden durch FACS-Analyse ausgewertet.
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Das
Experiment zeigt, dass nach Stimulation mit LPS die Expression von
antigenpräsentierenden HLA-DR
Molekülen
auf humanen Monozyten/Makrophagen stark zunimmt (2).
In Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von Ethyl-D-Laktat (DEL)
wird die durch LPS induzierte Steigerung der HLA-DR Expression signifikant
reduziert bzw. aufgehoben. Die Verhinderung der Expression von antigenpräsentierenden
Oberflächenmolekülen auf
Zellen wirkt immunsuppressorisch, weil dadurch die Aktivierung von
T-Zellen eingeschränkt
wird.
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Ausführungsbeispiel
3
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Hemmung der Th1 Antwort (Interferon-gamma
Bildung) durch Ethyl-D-Laktat
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Polymorphkernige
mononukleare Zellen (PBMC) wurden aus 18 ml Humanblut mittels Ficoll-Paque Plus (Amersham
Cat. No. 17144003) durch Zentrifugation getrennt (25 Minuten, 1600
rpm, 20°C).
Die Fraktion weißer
Blutzellen wurde in einem steriles 50 ml Falcon-Röhrchen mit
RPMI-Medium gemischt und bei 1700 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und die Zellen wurden in RPMI-10% FKS Medium suspendiert.
ELISPOT-plates (ELISPOT Multiscreen-IP, 45 μm, Millipore) wurden mit Anti-human
IFN-gamma Antikörper 1-D1K (Cat.No. 3420-3-250,
Mabtech) über
Nacht beschichtet. Nach dem Waschen wurden die Kavitäten mit
10% Kälberserum
(FKS) 1 Stunde bei 37°C geblockt.
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Nach
wiederholtem Waschen wurden 2 × 105 Zellen in jede Kavität gegeben und mit 1.5 μl Virusantigen
(rekombinantes Rubella-like Particles, 6.4 mg/ml)(Pustowoit
et al. 1996) oder mit 0.2 μg/ml Phytohemagglutinin (PHA)
(Sigma, CatNo. L9017) bei 37°C
inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Platte gewaschen und mit einem
Biotin-markierten Anti-IFN-gamma monoklonalen Antikörper 7-B6-1 (Cat.No.
3420-6-250, Mabtech) 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wurde
Streptavidin-markierte Alkaline Phosphatase (Cat.No. 3310-10, Mabtech)
zugegeben und 1 Stunde inkubiert. Die Farbentwicklung erfolget durch
Zugabe von 10 μl
Substrate (BCIP/NBT-Blue Liquid Substrate System (Cat.No. B-3804,
Sigma). Nach dem Waschen wurde die Platte getrocknet und die Spots
in einem ELISPOT-Reader (BIOREADER 3000, Bio-SYS GmbH) ausgewertet
(3).
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Das
Experiment zeigt, dass die antigene Stimulation mit Rubella Virusantigen
und die mitogene Stimulation mit PHA zur Sekretion von Interferon-gamma
aus inflammatorischen Th1 Zellen führt (hohe Spot-Anzahl). In
Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von Ethyl D-Laktat
(DEL) nimmt die Zahl der stimulierten und Interferon-gamma (IFN-γ)-sezernierenden T-Zellen
deutlich ab, was auf einen immunosuppressiven Effekt hinweist.
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Verwendete Abkürzungen:
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- DEL
- Ethyl-D-Laktat
- FKS
- Fetales Kälberserum
- HLA
- Human leucocyte antigen
- IL
- Interleukin
- INF
- Interferon
- LPS
- Lipopolysaccharid
- MHC
- Major Histocompatibility
Complex
- PBMC
- humane periphere polymorphkernige
mononukleäre
Zellen
- PHA
- Phythemagglutinin
- RPMI
- Rosswell Park Memorial
Institute
- TNF-α
- Tumor necrosis factor
alpha
-
Erklärung: HLA-Genprodukte
des Menschen entsprechen in der Funktion den MHC-Genprodukten der Maus.
-
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-
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