DE102006049682A1

DE102006049682A1 - Einzelmolekül-Protein-Sequenzierung

Info

Publication number: DE102006049682A1
Application number: DE200610049682
Authority: DE
Inventors: Bengt Noelting
Original assignee: Nolting Bengt Dipl-Phys Dr
Current assignee: Nolting Bengt Dipl-Phys Dr
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2008-04-17

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Geräte zur Sequenzierung großer Proteine. Erfindungsgemäß wird das Proteinmolekül durch ein elektrisches Feld gestreckt und im gestreckten Zustand mittels Vorbeiführung an einem Nanopartikel seine Sequenz ausgelesen mittels Messung der Resonanz-Ramansignale der einzelnen Aminosäuren. Die Messung kann mit vielen Molekülen nacheinander durchgeführt werden, um ein ausreichendes Signal zu akkumulieren. Eine zur Messung verwendete Nanoflußröhre kann mittels einer speziellen Ziehtechnik aus einer makroskopischen Vorlage hergestellt werden, wobei mehrfach gezogen und das gezogene Werkstück mit einer Auflage verbunden wird, die weiteres Ziehen von ohne Auflage unhandbar fragilen Strukturen ermöglicht.

Description

Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Methode zum Proteinsequenzieren, die auch bei großen Proteinen noch gut anwendbar ist.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Proteinsequenzierung wird i.a. chemisch mittels Edmann-Abbau oder massenspektrometrisch mittels Messung der Massen von Proteinfragmenten durchgeführt. Die Fragmentierung erfolgt dabei gewöhnlich hauptsächlich im Massenspektrometer durch gezielte Kollision. Diese Technik kann durch gezielte Fragmentierung mittels bestimmter spezifischer Proteasen ergänzt werden. Der Edmann-Abbau wird aufgrund von chemischen Nebenreaktionen mit zunehmender Proteingröße schnell sehr ungenau und die massenspektrometrischen Methoden stoßen bei großen Proteinen schnell auf erhebliche Probleme durch die sogenannte kombinatorische Explosion der möglichen Sequenzen, die einem bestimmten Fragmentmuster zugeordnet werden können.
Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird die Proteinsequenz praktisch im „Vorbeiflug" an Resonanz-Ramanstreuung ermöglichenden Nanopartikeln (oder auch nur einem Partikel) sequentiell ausgelesen, indem (a) das Proteinmolekül im elektrischen Feld unter denaturierenden (auffaltenden) Bedingungen gestreckt wird, (b) das Proteinmolekül im gestreckten Zustand durch das elektrische Feld durch einen Nanokanal transportiert wird, in dem sich mindestens ein Resonanz-Ramanstreuung ermöglichendes Nanopartikel befindet (zumindest teilweise, d.h. ein Teil des Partikels kann sich außerhalb des Kanals befinden), (c) während das Proteinmolekül am Nanopartikel vorbeiläuft, das Resonanz-Ramanstreuung-Signal gemessen wird zur Feststellung der Proteinsequenz. Zur Vereinfachung der Messung kann das Protein an einem seiner Termini mit einem speziellen Label versehen werden, welches im Nanokanal elektrisch geladen ist und ein spezielles Ramansignal verursacht als Startsignal der Messung.
Die Erfindung ist vor allem für die Sequenzierung großer Proteine vorgesehen, bei denen die herkömmlichen Methoden sehr aufwendig sind.
Ausführungsbeispiel
Beispiel gemäß 1-3.
1: Eine Designvariante der Erfindung (siehe Text). Das Proteinmolekül (10) wird unter denaturierenden (auffaltenden) Bedingungen durch ein elektrisches Feld gestreckt. Das elektrische Feld verursacht auch gleichzeitig den Transport des Proteinmoleküls durch den Resonator (Nanoflußkanal – siehe 2) vorbei an Resonator-Nanopartikeln (12). Zur besseren Positionierung des Proteinmoleküls im elektrischen Feld wurde eines seiner Termini mit einem geladenen Label (11) versehen. Beim Durchlauf durch den Resonator gibt zuerst das Label ein charakteristisches starkes Signal, dann die einzelnen Aminosäuren. Im Interesse einer hohen Sensitivität ist das Probenvolumen extrem klein und können viele Moleküle nacheinander gemessen werden. Unter diesen Bedingungen ist Einzelphotonenzählung leicht zu erreichen und somit eine gute Sensitivität.
2: Eine Designvariante der Erfindung: Der Flußkanal (22) weist eine Querschnittsverringerung (23) auf etwa molekulare Größe auf. An dieser Stelle sind Resonator-Nanopartikel (20, 21) postiert, die beim Durchlaufen des Proteinmoleküls (24) zu einem hohen Resonanz-Raman-Signal führen (das Prinzip ist ähnlich zu dem von Katrin Kneipp entdeckten Effekt).
3: Beispiel für die Herstellung einer Seite des Resonators mittels einer speziellen Ziehtechnik: 30: Der spätere (hier im Querschnitt runde) Nanokanal wird aus ätzbarem Material (32) gebildet, welches von einer zweiten Materialart (31) weitestgehend (bis auf an den Enden) umschlossen ist. Das Werkstück (30) wurde schon mittels herkömmlicher Techniken gezogen, so das sich auf der linken Seite ein kleinerer Querschnitt gebildet hat. Weiteres Zeihen würde zum Abreißen führen. Daher wird zur weiteren Verringerung des Querschnitts das Werkstück (30) mit einer Auflage (34) versehen, wodurch sich das Werkstück (33) ergibt. Dieses kann nun an der Auflage weiter gezogen werden, wodurch eine weitere Querschnittsverringerung des späteren Nanokanals möglich wird. Durch mehrfaches Ziehen und Verbinden mit neuen Auflagen läßt sich so der Querschnitt des Nanokanals auf eine molekulare Größe verringern. Nach Erreichen des gewünschten Querschnitts wird das Material (32) durch Säure aufgelöst und werden geeignete Nanopartikel in den Kanal gebracht und befestigt. Für einen Nanokanal, der sich an beiden Seiten erweitert, wird ein Werkstück analog näher der Mitte zwischen seinen beiden Enden gezogen.

Claims

Geräte und Verfahren zur Proteinsequenzierung, dadurch gekennzeichnet, daß – ein Protein im elektrischen Feld gestreckt wird, – mittels des elektrischen Feldes durch einen Nanokanal transportiert wird, – der Nanokanal Nanopartikel enthält, die Resonanz-Ramanstreuung ermöglichen, – die Sequenz des Resonanz-Raman-Signals verwendet wird, um die Proteinsequenz festzustellen.
Geräte und Verfahren zur Proteinsequenzierung, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß – das Proteinmolekül an einem seiner Termini mit einem speziellen Label versehen wurde, welches beim Transport des Proteinmoleküls elektrisch geladen ist und ein signifikantes Resonanz-Raman-Signal verursachen kann.
Geräte und Verfahren zur Proteinsequenzierung, nach mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß – der Nanokanal mittels einer speziellen Ziehtechnik hergestellt wird, wobei ein zunächst makroskopisches Werkstück mehrfach gezogen und mit einer Auflage verbunden wird, an der im jeweils folgenden Ziehschritt gezogen wird.