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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren
zur Subfraktionierung von gegen ein Polypeptid gerichtete Antikörper aus
einer gegen das Polypeptid hergestellten Antikörpermischpopulation. Des Weiteren
betrifft die vorliegende Erfindung ein Halterungssteckplatzsystem.
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Es
sind in der Vergangenheit Peptidbibliotheken zur Identifikation
von Antikörperbindungsstellen („Epitopen") auf Proteinen beschrieben
worden. Diese Bibliotheken wurden allerdings bisher nur für die sogenannte „Epitopkartierung" eingesetzt. Obwohl es
mit den bisher zur Verfügung
stehenden Vorrichtungen und Verfahren prinzipiell möglich wäre, Subfraktionierungen
von Antikörpern
aus Antikörpermischpopulationen
an multiplen Peptiden anhand dieser Bibliotheken durchzuführen, ist
eine solche Aufreinigung aufgrund des hohen Zeitaufwandes und den
damit verbundenen Kosten bislang verworfen worden.
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Die
Aufreinigung von Seren, die durch Immunisierung gegen ein Zielprotein,
oft ein so genanntes „rekombinantes" Polypeptid (im Nachfolgenden
auch als Zielprotein bezeichnet) hergestellt werden und eine Vielzahl
von unterschiedlichen Antikörpern
gegen dieses Zielprotein enthalten, ist aber, um unerwünschte Wechselwirkungen
mit anderen Proteinen auszuschließen, extrem wünschenswert.
Die Seren, die nach der Immunisierung mit größeren Zielproteinen anfallen,
enthalten nämlich üblicherweise
eine Vielzahl von verschiedenen Antikörpern, die gegen unterschiedliche
Abschnitte des jeweiligen Zielproteins gerichtet sind. Die verschiedenen
Antikörper
in einer solchen Antikörpermischpopulation
reagieren dabei nicht nur mit dem Zielprotein unterschiedlich stark,
denn meistens enthält
eine solche Mischpopulation auch solche Antikörper, die zusätzlich auch noch
an andere Proteine binden. Diese unerwünschten Wechselwirkungen (sogenannte „Kreuzreaktionen") mit anderen Proteinen,
die bis auf kurze Abschnitte der Proteinsequenz häufig keine Ähnlichkeit oder
gar Verwandtschaft zum eigentlichen Zielprotein aufweisen, führen beim
Einsatz dieser Antikörpermischpopulationen
in der Analytik und Diagnostik zu „unspezifischen" Signalen und damit
zu Datensätzen,
die oft nicht zweifelsfrei interpretierbar und somit letztendlich
nicht verwertbar sind.
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Neben
solchen Antikörpern,
die das Ergebnis der Immunantwort auf die applizierten Zielproteine
darstellen, enthalten solche Seren üblicherweise auch andere Antikörperpopulationen,
die schon vor der ersten Immunisierung im Serum des immuni sierten
Trägerorganismus
vorlagen. Des Weiteren kann beobachtet werden, dass bestimmte Methoden
der Zielproteinapplikation in bestimmten Organismen zusätzlich zu
einer Immunantwort gegen zelluläre
Bestandteile des Trägerorganismus
führen
können.
So kann in bestimmten Kleinsäugern
die subkutane Injektion, durch die das Zielproteins im Zuge des
Immunisierungsverfahrens üblicherweise
appliziert wird, auch schon ohne Zugabe des Zielproteins eine Immunantwort
hervorrufen, wobei diese oft gegen Zellbestandteile des Trägerorganismus
gerichtet sind, die von Zellen stammen, die im Zuge der Injektion verletzt
wurden. Des Weiteren werden den Zielproteinen im Rahmen der Immunisierung
häufig
Zusätze (Adjuvantien)
beigemengt, die die Immunantwort des Trägerorganismus stimulieren sollen.
Bei solchen Zusätzen
handelt es sich zum Beispiel um Bakterienbestandteile, gegen die
der Trägerorganismus
dann zusätzliche
Antikörper
herstellen kann.
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Um
zumindest jene Antikörper,
die nicht das eigentliche Zielprotein erkennen, aus der Mischpopulation
zu entfernen, werden die Seren bislang mit Hilfe des an einer Matrix
immobilisierten Zielproteins fraktioniert. Dabei werden alle Antikörper aus
dem Serum angereichert, die an das Zielprotein binden während die
nicht-bindenden
Antikörper
abgetrennt werden. Allerdings ist es mit dieser Methode nicht möglich jene
Antikörper,
die ausschließlich
nur gegen das Zielprotein gerichtet sind, von solchen Antikörpern abzutrennen,
die nicht nur mit dem Zielprotein sondern auch mit anderen Proteinen
kreuzreagieren.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde eine Vorrichtung
zur Subfraktionierung von gegen ein Polypeptid gerichtete Antikörper aus
einer gegen das Polypeptid hergestellten Antikörpermischpopulation zur Verfügung zu
stellen, sowie ein Verfahren zur Subfraktionierung von gegen ein
Polypeptid gerichtete Antikörper
aus einer gegen das Polypeptid hergestellten Antikörpermisch-population
anzugeben, welche es erlauben, Antikörpergemische effektiv und auf
eine Zeit und Kosten sparende Methode in Antikörpersubpopulationen aufzutrennen,
die nur das Zielprotein erkennen.
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Erfindungsgemäß wird die
voranstehende Aufgabe hinsichtlich der Vorrichtung mit den Merkmalen
des Anspruchs 1 gelöst.
Danach ist die Vorrichtung zur Subfraktionierung von gegen ein Polypeptid
gerichtete Antikörper
aus einer gegen das Polypeptid hergestellten Antikörpermischpopulation
gekennzeichnet durch mit einander kombinierbare Trägermatrizen,
wobei an jeweils einer Trägermatrix
ein anhand eines kurzen Abschnitts der Aminosäuresequenz des Polypeptids
synthetisiertes Einzelpeptid immobilisiert ist, so dass durch die
Kombination der Trägermatrizen
die gesamte Aminosäuresequenz des
Polypeptids durch die an den Trägermatrizen
immobilisierten Einzelpeptide darstellbar ist.
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Des
Weiteren ist die obige Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen
des Patentanspruchs 14 gelöst.
Danach ist ein Verfahren zur Subfraktionierung von gegen ein Polypeptid
gerichtete Antikörper aus
einer gegen das Polypeptid hergestellten Antikörpermischpopulation derart
ausgestaltet, dass in einem ersten Schritt anhand der Aminosäuresequenz
des Polypeptids verschiedene Einzelpeptide chemisch synthetisiert
werden, wobei die gesamte Aminosäuresequenz
des Polypeptids abgedeckt wird, in einem zweiten Schritt die Einzelpeptide
jeweils an einer Trägermatrix
immobilisiert werden, in einem dritten Schritt jeweils eine Trägermatrix
in eine Chromatographiesäule
eingefüllt
wird, die als modulare Einheit ausgebildet ist, in einem vierten
Schritt die Chromatographiesäulen
beispielsweise zu einem Säulenturm
zusammengesteckt oder durch ein Schlauchsystem oder auf andere denkbare
Weisen lückenlos
miteinander verbunden werden, wobei die Reihenfolge der mit den
Trägermatrizen
beladenen Säulen
frei gewählt
werden kann, in einem fünften Schritt
der Säulenturm
mit dem Antikörpergemisch beladen
wird, in einem sechsten Schritt nach Durchlaufen des Antikörpergemisches
durch den Säulenturm
die Säulen
voneinander getrennt und in ein Halterungssteckplatzsystem gesteckt
werden und in einem letzten Schritt die Säulen gleichzeitig mit Lösungen zur
Elution der Antikörper
beladen werden und die eluierte Antikörpersubpopulation jeder Säule getrennt
voneinander in unterhalb des Halterungssteckplatzsystems in einer
Steckplatztafel angeordneten Auffangbehältern simultan aufgefangen
und durch konventionelle Verfahren konserviert werden.
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Schließlich ist
die obige Aufgabe hinsichtlich eines Halterungssteckplatzsystems
mit den Merkmalen des Patentanspruchs 16 gelöst. Danach ist ein Halterungssteckplatz-system
mit Steckplätzen
für die modularen
Einheiten nach einem der Ansprüche
4 bis 9 mit zumindest einer unterhalb der modularen Einheiten angeordneten
Steckplatztafel für
die Aufnahme von Auffanggefäßen zum
Auffangen von aus den modularen Einheiten freigesetzten Antikörpern derart
ausgestaltet, dass die Anordnung der Steckplätze für die modularen Einheiten eine
gleichzeitige Beladung aller disassemblierten modularen Einheiten
mit den für
die Freisetzung der Antikörper
verwendeten Lösungsmittel
und das simultane Auffangen der freigesetzten Antikörper erlaubt.
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Folglich
sind eine Vorrichtung und ein Verfahren realisiert, die in Abkehr
zu der üblichen
Reinigung der Antikörper
aus einer Antikörpermischpopulation,
bei der das gesamte an einer Matrix immobilisierte zur Immunisierung
verwendete Polypeptid (Zielprotein) verwendet wird, eine sukzessive
Reinigung an einer Vielzahl von anhand kurzer Abschnitte der Aminosäuresequenz
des Zielproteins synthetisierten kurzen Peptiden ermöglichen.
Diese sind an miteinander kombinierbaren Trägermatrizen immobilisiert,
die in ihrer Gesamtheit, also in der Kombination der Trägermatrizen
und der daran immobilisierten Einzelpeptide, die gesamte Aminosäuresequenz
des Zielproteins abdecken. Dadurch wird ein effektives System zur
Trennung von Antikörpersubpopulationen
aus der Antikörpermischpopulation
bereitgestellt, die nur mit dem Zielprotein reagieren. Mit anderen
Worten ermöglicht
es die Vorrichtung, Antikörper, die
spezifisch nur mit dem Zielprotein interagieren und solche, die
auch mit anderen Proteinen „kreuzreagieren", mit dem angegebenen
Verfahren auf eine einfache und dennoch effektive und auf eine Zeit
und Kosten sparende Weise voneinander zu trennen. Die mit der Vorrichtung
und dem Verfahren aufgetrennten unterschiedlichen Antikörpersubpopulationen
stehen dann für
weitere Arbeiten zur Verfügung.
Sie können z.B.
in einer einen hohen Qualitätsstandard
anfordernden Analytik oder Diagnostik eingesetzt werden. Zudem ist
ein Halterungssteckplatzsystem speziell für die modularen Einheiten realisiert,
das eine zeitsparende Elution der Antikörpersubpopulationen ermöglicht.
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Entsprechend
den konventionellen Vorrichtungen, bei denen das gesamte Zielprotein
an einer Trägermatrix
immobilisiert ist, ist bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorzugsweise
jedes der anhand der Aminosäuresequenz
des Zielproteins synthetisierte Einzelpeptid jeweils an einer Trägermatrix immobilisiert
(Peptidmatrix), wobei jede dieser Peptidmatrizen in jeweils eine
Chromatographiesäule einfüllbar ist
(auch nachfolgend „Peptidmatrix-Minisäule" oder „Affinitätsmodul" oder „Säulenmodul" genannt). Es ist
aber auch denkbar, dass die Peptidmatrizen nacheinander in nur eine
Chromatographiesäule
einfüllbar
sind, die dann nach Beladung mit der Antikörpermischpopulation in die
durch das Befüllen entstandenen
einzelnen Abschnitte trennbar ist. Die Aufreinigung der Antikörper erfolgt
unter zu Hilfenahme der beschriebenen Vorrichtung nicht mehr am
eigentlichen Zielprotein, mit dem zuvor auch schon die eigentliche
Immunisierung erfolgte, sondern sukzessiv an einer Vielzahl von
anhand der Aminosäuresequenz
des Zielproteins synthetisierten Einzelpeptiden, wobei jedes Einzelpeptid
an einer Trägermatrix immobilisiert
ist, und wobei die Aminosäure-Sequenzen
der Einzelpeptide in ihrer Gesamtheit die gesamte Aminosäure-Sequenz
des Zielproteins abdecken.
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In
vorteilhafter Weise sind die Chromatographiesäulen als modulare Einheiten
ausgebildet, die sich miteinander verknüpfen, zusammenstecken, über ein
Schlauch- oder Leitungssystem
oder auf andere Weisen miteinander verbinden lassen. Dadurch lassen
sich die Trägermatrizen
und die daran immobilisierten Einzelpeptide in beliebiger Reihenfolge kombinieren,
um diese dann für
die Beladung mit der Antikörpermischpopulation
(z.B. Serum) zu verwenden. Auf diese Weise lassen sich spezifisch
jene Antikörper
isolieren, die nur an das jeweilige Peptid der einzelnen miteinander
verbundenen modularen Einheit binden.
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In
idealer Weise sind die Chromatographiesäulen als Minisäulen ausgebildet,
so dass sich im normalen Laborbetrieb eine Vielzahl von Chromatographiesäulen assemblieren
lassen.
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Für das Affinitätschromatographieverfahren ist
es von Vorteil, wenn sich die als Minisäulen ausgebildeten modularen
Einheiten (Affinitätsmodule)
zu einem Säulenturm
oder über
Schläuche
oder Leitungen miteinander verknüpft
kombinieren lassen, so dass das Durchlaufen der Antikörpermischpopulation durch
die eine Säulenmatrix
direkt zur Beladung der nächsten
Matrix führt.
Um eine effektive Beladung der in Reihe geschalteten Matrizen zu
gewährleisten, bietet
sich eine Druck- oder
Unterdruckbeladung der Säulen
an, wobei der Druck beispielsweise über ein Pumpensystem erzeugbar
ist.
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Eine
Anordnung der zahlreichen Affinitätsmodule in Reihe erlaubt in
vorteilhafter Weise eine einmalige Beladung des assemblierten Säulenturms oder
der über
Schläuche
miteinander verknüpften
Minisäulen
mit der Antikörpermischpopulation
und anschließend
die sukzessive affinitätschromatographische
Fraktionierung der Antikörpermischpopulation an
den unterschiedlichen Peptidmatrizes, mit denen die Antikörpermischpopulation
beim Durchlaufen des Säulenturms
oder der über
Schläuche
miteinander verknüpften
Minisäulen
nacheinander in Kontakt kommt. Die Vorrichtung bietet somit im Unterschied zu
den konventionellen Vorrichtungen zur Reinigung von Antikörpern aus
Antikörpermischpopulationen, bei
denen das gesamte Zielprotein an einer Matrix (Polypeptidmatrix)
immobilisiert ist, die in nur eine Säule gefüllt ist, ein modulares affinitätschromatographisches
und reihengeschaltetes Peptidsäulensystem
zur Subfraktionierung und Reinigung von Antikörpermischpopulationen (MARPSRAP).
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Bei
dem MARPSRAP können
die räumlichen Abmessungen
der einzelnen Säulenmodule
so gering gehalten werden, dass eine Aneinanderreihung bis zu 30
oder mehr mit Matrix gefüllten
Einzelmodulen auf der Arbeitsfläche
einer normalen Laborbank praktikabel ist. Mit dieser Anordnung ist
die Isolation und weitere Aufarbeitung von Antikörpern, die an 30 oder mehr
verschiedene Peptidmatrices gebunden wurden, im Rahmen lediglich
eines Arbeitstages möglich.
Verbindet man die einzelnen Säulenmodule über ein
unter Druck stehendes Schlauch- oder Leitungssystem miteinander,
lassen sich natürlich
auch mehr als 30 Säulenmodule
miteinander verknüpfen, die
miteinander in Reihe geschaltet sind, die aber räumlich frei anordenbar sind.
So wäre
es beispielsweise vorstellbar, dass die in Reihe geschalteten Minisäulen nebeneinander
und untereinander, verschiedene geometrische Formen bildend, anordenbar
sind. Für
ein kompakte Ausgestaltung würde
sich zum Beispiel die Anordnung der miteinander verbundenen Säulenmodule
zu einem Quader anbieten, wobei dessen Form für die Wasch- und Elutionsschritte
so veränderbar
ist, dass sich die modularen Einheiten in das Halterungssteckplatzsystem
einfügen
lassen, oder dass sich das Halterungssteckplatzsystem an die Anordnung
der modularen Einheiten anpassen lässt.
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Um
die an den unterschiedlichen Peptidmatrizen gebundenen Antikörper-subpopulationen
anschließend
auf eine einfache Art und Weise von den Affinitätsmodulen freizusetzen, ist
es besonders vorteilhaft, wenn sich die kombinierten modularen Einheiten
nach Beladung mit der Antikörpermischpopulation
wieder voneinander trennen (disassemblieren) lassen, beziehungsweise über eine
Ansteuerung getrennt voneinander eluieren lassen. So könnten zum Beispiel
Ventile, vorzugsweise Zweiwegventile oder Mehrwegventile zwischen
den modularen Einheiten, z.B. in den die Affinitätsmodule verbindenden Schläuchen vorgesehen
sein, die bei der Beladung mit dem Antikörpergemisch und beim Waschen
der Module diese miteinander in Reihe schalten und bei der Elution
voneinander separieren. Durch den Einsatz von Ventilen ist es denkbar,
die Vorrichtung zu automatisieren, nämlich ohne manuelle Disassemblierung
der Module, die Module durch mindestens ein jeweils zwischen den
Modulen befindliches ansteuerbares Zweiweg- oder Mehrwegventil zu trennen, wobei
die Ventile von einer Durchlaufstellung, also eine die Module verbindende
Stellung, in eine die Module trennende Stellung umschaltbar sind.
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Bevorzugt
eignen sich zur Immobilisierung an den Trägermatrizen anhand der Aminosäuresequenz
des Zielproteins synthetisierte Peptide mit einer Länge von
11 bis 30 Aminosäuren,
noch bevorzugter mit einer Länge
von 17 bis 19 Aminosäuren, wobei
sich besonders der Einsatz von chemisch synthetisierten Peptiden
anbietet. Es ist aber auch denkbar, dass die Peptide aus einem gezielten
Verdau des Zielproteins stammen.
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Um
beim Reinigungsvorgang der Antikörpermischpopulation
auch diejenigen Antikörper „herausfischen" zu können, deren
Epitope im Überlappungsbereich
zwischen den Einzelpetiden liegen, bietet es sich an, die Aminosäuresequenz
jedes Einzelpeptids mit denen der flankierenden Peptide über einen
Bereich von mindestens 9 Aminosäure
zu überlappen. Wird
der Überlappungsbereich
der Sequenzen zu niedrig gewählt,
können
aufgrund der durchschnittlichen Länge der Epitope von etwa 6
Aminosäuren, wobei
auch Epitope mit einer ununterbrochenen Aminosäuresequenz von bis zu 11 Aminosäuren bekannt sind,
einzelne Antikörpersubpopulationen
bei der nachfolgenden Reinigung an den zur Verfügung stehenden Peptiden verloren
gehen.
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Bezüglich des
beanspruchten Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen
auf die Ausführungen
und die Vorteilsangaben zu der beanspruchten Vorrichtung zur Subfraktionierung
von gegen ein Polypeptid gerichtete Antikörper aus einer gegen das Polypeptid
hergestellten Antikörpermischpopulation
verwiesen. Es wird ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass das Verfahren sowohl manuell als auch automatisiert
durchführbar
ist.
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Um
die oben genannte Aufgabe zu lösen, wird
zudem ein erfindungsgemäßes Halterungssteckplatzsystem
mit zumindest einer unterhalb der modularen Einheiten angeordneten
Steckplatztafel für
die Aufnahme von Auffanggefäßen zum
Auffangen von aus den modularen Einheiten freigesetzten Antikörpern beansprucht,
welches speziell für
die erfindungsgemäße Vorrichtung
und das erfindungsgemäße Verfahren
konzipiert ist und welches die gleichzeitige Beladung aller modularen
Einheiten mit den für
die Freisetzung der Antikörper
verwendeten Lösungsmitteln
und das simultane Auffangen der freigesetzten Antikörper erlaubt.
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In
besonders vorteilhafter Weise sind in dem Halterungssteckplatzsystem
Steckplätze
für die
oben beschriebenen Peptidmatrix-Minisäulen vorhanden, die so ausgestaltet
sind, dass sich die aus den Peptidmatrix-Minisäulen freigesetzten Antikörper in
unterhalb der Steckplätze
in einer Steckplatztafel befindlichen Auffanggefäßen getrennt voneinander aufgefangen
werden können.
Dies setzt voraus, dass jeder Peptidmatrix-Minisäulen ein Auffangbehälter zugeordnet
ist.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels
werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen
der Lehre erläutert,
ohne die Lehre darauf einzuschränken.
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In der Zeichnung zeigt
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1 in
einer Grafik die Vorrichtung bei der Beladung der in Reihe geschalteten
modularen Einheiten mit einer Antikörpermischpopulation
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2 in
einer Grafik die Vorrichtung aus 1 bei der
Beladung mit Wasch- und
Elutionslösung.
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1 zeigt
die erfindungsgemäße Vorrichtung
mit über
Schläuche 3 in
Reihe geschaltete modulare Einheiten 2, die aus einer Chromatographiesäule mit
einer Trägermatrix 1 bestehen,
an die kurze Einzelpeptide gebunden sind. Über den ersten Beladungsbehälter 6 wird
die Antikörpermischpopulation 7 in
die Vorrichtung gebracht, wobei die Antikörpermischpopulation durch die
erste Trägermatrix 1 fließt und über ein
die zweite und die weiteren modularen Einheiten 2 verbindendes
Schlauchsystem durch die zweite und jede weitere Trägermatrix 1 fließt. Damit die
modularen Einheiten 1 in Reihe geschaltet sind, sind Zwei-
oder Mehrwegventile 4 vorgesehen, die sich jeweils zwischen
den modularen Einheiten 2 befinden, und in in einer Durchlaufstellung
stehen, so dass die Antikörpermischpopulation 7 nicht
in die Auffangbehälter 5 sondern
durch die die modularen Einheiten 2 verbindenden Schläuche 3 geleitet
wird. Dieses Prinzip ist natürlich
auch für
die vor der Elution durchzuführenden
Waschschritte anwendbar, wobei das wie in 2 dargestellte
simultane Waschen der Trägermatrizen
aus Zeitgründen
bevorzugt ist.
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2 zeigt
die erfindungsgemäße Vorrichtung
nach der Beladung der modularen Einheiten 2 bzw. der Trägermatrizen 1 mit
der Antikörpermischpopulation 7 und
während
der Waschschritte beziehungsweise während des Elutionsschrittes.
Durch das Umstellen der Zwei- oder Mehrwegventile 4 in eine
Trennstellung, also in eine die modularen Einheiten 2 separierende
Stellung, sind die zuvor in Reihe geschalteten modularen Einheiten 2 voneinander getrennt,
ohne das sie manuell disassembliert werden müssen, so dass die Trägermatrizen 1 simultan getrennt
voneinander über
die Beladungsbehälter 6 mit
Wasch- und Elutionspuffern 8 beladen werden können. In
den jeweils unter den modularen Einheiten befindlichen Auffangbehältern 5 werden
die zuvor an den Trägermatrizen 1 gebundenen
Antikörpersubfraktionen 9 aufgefangen.