DE102005059379A1

DE102005059379A1 - Arginin- und Lysin-spezifische Moleküle für die Proteinerkennung und- Immobilisierung

Info

Publication number: DE102005059379A1
Application number: DE200510059379
Authority: DE
Inventors: Thomas Prof. Schrader; Markus Dr. Arendt; Sebastian Koch; Christian Renner
Original assignee: Philipps Universitaet Marburg
Current assignee: Philipps Universitaet Marburg
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2007-06-14

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft polymere Materialien mit Bisphosphonatstruktur, die eine hohe Affinität zu basischen sowie Arg-getaggten Proteinen aufweisen und ein Verfahren zur Aufreinigung rekombinanter Proteine mit diesen Polymeren an einem festen Träger.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft dendrimere und polymere Materialien, die eine hohe Affinität zu basischen Proteinen und zu solchen mit Arginin-tag (Arg-tag) besitzen und sich deshalb zur Aufreinigung rekombinanter Proteine eignen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Chemie, Biologie, Biochemie, Proteomics, Molekularbiologie und Toxikologie.

Zur Proteinreinigung stehen im Stand der Technik mehrere Standardverfahren zur Verfügung. Eine grobe Auftrennung von Proteingemischen kann relativ leicht nach ihrer Größe (Gelfiltration) oder ihrer Ladung (Ionenaustauschchromatograhie) erfolgen. Die effizienteste Methode aber ist die Affinitätschromatographie, bei der das Proteingemisch mit einer festen Phase equilibriert wird, welche auf ihrer Oberfläche eine hohe Dichte von Haftgruppen trägt, die spezifisch mit dem Zielprotein wechselwirken und es daher auf dem Träger, z.B. einem Harz anreichern. Anschließende milde Ablösung der zurückgehaltenen Proteine führt zu einer aufkonzentrierten, im Idealfall reinen Lösung des Zielproteins. Für diese Technik stehen zahlreiche Haftgruppen zur Verfügung, von denen die meisten jedoch selten verwendet werden. Einige wenige Vertreter haben sich kommerziell durchgesetzt, besonders wegen ihrer universellen Anwendbarkeit und Spezifität. Allen voran geht die für ein Histidinfragment selektive Nickel-Nitrilotrisessigsäure-Gruppe, in weitem Abstand gefolgt von einer Reihe sehr bekannter tags wie z. B. der Glutathion-S-Transferase (GST), Streptavidin-tag (Strep-tag), FLAG-tag etc.

Die weltweit dominierende Technik IMCA („Immobilized metal-ion affinity chromatography") hat jedoch einige gravierende Nachteile, die die Entwicklung neuer Tags notwendig machen:

1. Nickel-II-Salze sind giftig
2. der His₆-Tag kann nicht zur Aufreinigung von Metalloproteinen verwendet werden, da deren Zentralkation(en) ebenfalls an die Imidazolliganden des Tags komplexieren
3. der His₆-Tag unterscheidet naturgemäß nicht zwischen verschiedenen His-getaggten Proteinen, so dass eine zusätzliche orthogonale und mit der IMCA kompatible Tag-Methode erforderlich ist
4. Enzyme können den His₆-Tag nicht abbauen, so dass er dauerhaft im rekombinanten Protein verbleibt

In jüngster Zeit wurden eindimensionale NanoMIPs (MIP = molecularly imprinted polymer) postuliert, welche durch „Molekulares Prägen" von einfachen Methacrylsäure-Monomeren über einer Proteinoberfläche mit anschließender radikalischer Polymerisation entstehen sollen und Proteinspezifität besitzen sollen (Piletsky et al.).

Sassenfeld und Brewer führten Arginin- bzw. Lysin-Tags bereits 1984 für die Proteinaufreinigung ein. Die Einbindung polykationischer Tags macht das Fusionsprotein bei physiologischem pH-Wert wesentlich basischer; die große Anzahl positiver Ladungen kann daraufhin genutzt werden, um das getaggte Protein mit Hilfe einer Ionentauschersäule aufzureinigen. Generell sind polykationische Tags ideal für die Produktion therapeutischer Proteine, da der Tag im allgemeinen nur einen geringen Effekt auf die Faltungsdynamik und die Bioaktivität des Proteins hat. Die Lösungseigenschaften des rekombinanten Proteins werden durch den polyionischen Tag ebenfalls verbessert und die Tendenz zur Bildung von Aggregaten wird verringert. Carboxypeptidase B spaltet Arginin-tags komplett wieder ab. Ein eventueller Abbau Arg-getaggter Peptide im Bakterium macht die Verwendung von E. coli Stämmen notwendig, die keine Omp A Protease besitzen. Die polykationischen Tags bestehen in der Regel aus 5 bis 15 Argininen, je nach Trennproblem.

Durch den Einsatz von Molekülen, die in physiologischem Medium als Haftgruppen spezifisch an Arginin binden, könnte die Anzahl der verwendeten Arginine in einem solchen Tag drastisch verringert werden, wodurch ein Teil der negativen Effekte umgangen wird. Es fehlt allerdings bis heute an Arginin-selektiven hochaffinen kleinen Bindungsmotiven, welche die vorteilhafte Haftgruppe des Arg-Tags für eine leistungsfähige Affinitätschromatographie nutzen.

Dem Fachmann ist bekannt, dass das einfache Xylylenbisphosphonat ein spezifisches Rezeptormolekül für Lysin und Arginin darstellt, allerdings nur in polar aprotischer Lösung (Acetonitril, DMSO).

Aufgabe

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Moleküle und Materialien mit Affinität zu basischen und Arg-getaggten Proteinen bereitzustellen und damit ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung solcher Proteinen vorzustellen, das einfach durchzuführen, nicht toxisch und besonders für die Reinigung und Isolierung von Metalloproteinen geeignet ist.

Lösung

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Polymere und Dendrimere mit Bisphosphonatgruppen, die eine hohe Affinität für basische und Arg-getaggte Proteine aufweisen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Immobilisierung auf Trägern sowie Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Proteinen, rekombinanten und/oder Wildtyp-Proteinen, gemäß den Ansprüchen.

Besonders vorteilhaft ist, dass die erfindungsgemäßen Polymere und Dendrimere mit Bisphosphonatgruppen einfach herzustellen und an Träger zu binden sind. Sie weisen eine hohe Affinität für Arg-Tags und basische Proteine auf und werden in einem nicht toxischen Verfahren zur Anreicherung, Isolierung und Reinigung verwendet.

Erfindungsgemäß werden unter basischen Proteinen solche Proteine verstanden, die einen isoelektrischen Punkt größer 7 aufweisen, sowie Proteine mit einem Arginin-Anteil (Arg-Tags oder Arg-getaggte Proteine) von wenigstens einem Arginin. Proteine sind natürlich vorkommende und rekombinant hergestellte Proteine.

Unter Träger werden erfindungsgemäß unpolare Harze wie z.B. polymere Methacrylamide oder Polystyrole verstanden. Alternativ können auch hochpolare Harze wie z.B. Sepharose oder Cellulose eingesetzt werden, die eine gute Quellbarkeit in Wasser aufweisen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass Xylylenbisphosphonat 1 mit verschiedenen funktionellen Gruppen in Position 5 des aromatischen Ringes (vor allem Amino- und Carbonsäuregruppe) zum Aufbau von oligomerisierbaren und polymerisierbaren Monomeren geeignet ist. Diese Moleküle sind sehr gut wasserlöslich und binden effizient Arginin- und/oder Lysinreiche Peptide und Proteine in gepufferter wässriger Lösung. Damit eignen sie sich als Haftgruppen auf polymeren Trägern zur chromatographischen Proteinreinigung, die meist in wässriger Lösung durchgeführt wird.

Bisphosphonat tragende Dendrimere der allgemeinen Struktur 2 sowie mit Bisphosphonat tragende Polymere der allgemeinen Struktur 3, werden als Haftgruppen in stationärer Phase auf Trägern beispielsweise Polymeren immobilisiert und zur Affinitätschromatographie verwendet. Sie sind hochaffin für Arg-reiche und/oder Arg-getaggte Proteine und basische Proteine.

R¹ = Alkyl oder Aryl
R² = H, CH₃
spacer = Alkyl oder Peptidyl

Die Equilibrierung von wässrigen gepufferten Proteinlösungen mit Bisphosphonat tragenden Dendrimeren 2 oder Polymeren 3 an einem festen Träger führt in einem Proteinreinigungsverfahren (Affinitätschromatographie) zu einer guten Anreicherung von basischen, Arg-reichen und/oder Arg-getaggten Zielproteinen. Die anschließende Elution mit einem kompetitiven Agens wie z.B. hochkonzentrierte Kochsalzlösung (NaCl), Guanidinlösung und NaH₂PO₄ löst das gereinigte Protein milde vom festen Träger ab.

Immobilisierung der mit Bisphosphonat tragenden Dendrimere 2 und Bisphosphonat tragenden Polymere 3 an einem Träger

Die Immobilisierung der Dendrimere 2 und Polymere 3 als Haftgruppen erfolgt alternativ auf verschiedenen Wegen:

1. Unter Verwendung von käuflich erwerbbaren Trägern z.B. Harzen, dies vereinfacht die Anbindung der Dendrimere 2 und Polymere 3 über freie Amin-Funktionaliäten am Träger mit Standardreaktionen (Amidkupplung, Bromcyan-Reaktion).
2. Durch Suspensionspolymerisation werden die Monomerbausteine z.B. Xylylenbisphosphonat 1 direkt vernetzend copolymerisiert; wobei die Einstellung einer definierten Korngröße von 1–100 mm möglich ist.
3. Die vernetzende Copolymerisation findet auch um einen festen Träger herum statt, der chemisch inert ist, aber erhebliche mechanische Stabilität verleiht, z.B. eine Glaskugel.

Alternativ erfolgt die Anbindung der Dendrimere 2 an BrCN-aktivierte Agarose (Sepharose), wegen der größeren räumlichen Ausdehnung jedes Dendrimerarms (8 Atombindungen zur nächsten funktionellen Gruppe) direkt oder über einen Spacer z.B. ω-Aminoadipinsäure.

Proteinreinigung durch immobilisierte Dendrimere 2 und Polymere 3 Die Reinigung von basischen, Arg-reichen und/oder Arg-getaggten Poteinen erfolgt beispielsweise nach einem Standardprotokoll der Affinitätschromatographie. Die Arg-Tags sind dabei N- und/oder C-terminal am Protein angebracht. Zur Validierung des Verfahrens werden zunächst Modellproteine wie z.B. reines Arg-getaggtes Maltosebindendes Protein (MBP) und/oder Cyt C bzw. Oregon-Green-gelabeltes Histon eingesetzt und die Reinigungseffizienz, Reinheit und Ausbeute überprüft und dokumentiert, z.B. durch HPLC mit UV/Vis-Detektion und SDS-PAGE. Die Elution der Proteine erfolgt, z. B. mit NaCl- oder Phosphat-Pufferlösung, vorteilhafterweise weist die Pufferlösung keine Metalle, keine biologisch aktiven Substanzen wie Imidazol oder Biotin, wie z.B. beim Streptag und, Histag im Überschuss auf.

Alternativ wird die Spezifität durch Elution mit selektiven Bisphosphonatbindern, z.B. Guanidiniumionen, gesteigert.

Bei der Reinigung von Proteingemischen aus Zellextrakten ist der Puffer so optimiert, dass Wirtszellproteine bei der Elution entfernt werden.

Die Regenerierung der stationären Phase erfolgt standardmäßig durch Waschen mit überschüssigem Puffer.

Herstellung der Bisphosphonat tragenden Dendrimere

Überraschend wurde ein einfaches Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Bisphosphonat tragenden Dendrimere gefunden, eine so genannte reduktive Aminierung im Eintopfverfahren.

Dies beruht auf der Reaktion von Polypropylenimin-(PPI)-Dendrimer-Grundbausteinen mit 5-Formyl-1,3-m-xylylenbisphosphonsäurederivat 1a (vorteilhaft direkt als Dilithiumsalz) und führt in methanolischer Lösung zu einem Imin-Intermediat, welches ohne Zwischenreinigung durch NaBH₄ in situ direkt zum Benzylamin reduziert wird. Die Abtrennung der Boratsalze erfolgt z.B. in einem nachgeschalteten Dialyseschritt. Alternativ werden die Dendrimere mit einem Fluoreszenzlabel versehen, dazu wird das PPI-Dendrimer zunächst mit 0.05–0.10 eq. eines Fluorescein-basierten Maleinimids umgesetzt, ehe die equimolare Zugabe des Formylxylylenbisphosphonats erfolgt.

Die fertigen Bisphosphonat tragenden Dendrimere werden an feste Träger, Proteine, Fluoreszenzfarbstoffe oder Spacereinheiten mit weiteren funktionellen Gruppen gebunden. Dazu wird das PPI-Dendrimer an einer equimolaren Menge Tritylharz über einfache kovalente Anbindung immobilisiert, anschließend der vollständigen reduktiven Aminierung mit Formylxylylenbisphosphonat unterworfen und schließlich milde mit heißem Trifluorethanol wieder vom Polymer abgespalten, wobei eine reaktive freie Aminogruppe erhalten wird.

Die Bisphosphonat tragenden Dendrimere sind alternativ wegen der käuflichen Grundkörper als Tetramer 4, Octamer 5 oder Hexadecamer 6 ausgebildet.

Die Ermittlung von Bindungskonstanten freier Proteine an die Bisphosphonat tragenden Dendrimere wird in 30 mM wässrigem NaH₂PO₄-Puffer per Fluoreszenztitration mit Fluorescein- bzw. OregonGreen-markierten Proteinen (N-Terminus) durchgeführt: Dabei ergeben sich für Tetramer (A), Octamer (B) oder Hexadecamer (C) folgende Bindungskonstanten:
BSA/Tetramer (A): 3 × 10³ M^–1
BSA/Octamer (B): 2 × 10⁴ M^–1
BSA/Hexadecamer (C): 1 × 10⁵ M^–1
Chymotrypsin/Tetramer (A): 2 × 10³ M^–1
Chymotrypsin/Octamer (B): 4 × 10⁵ M^–1

Daraus ergibt sich ein Anstieg in K_a von etwa einer Größenordnung beim Übergang zur nächsthöheren Dendrimergeneration.

Herstellung der Bisphosphonat tragenden Polymere

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymere erfolgt durch freie radikalische Polymerisation von Methacrylat-basierten, neutralen Phosphonsäuredimethylester-Monomeren in DMF (N,N-Dimethylformamid) mit AIBN (Azobisisobutyronitril) als Radikalstarter (1%). Nach 8–24 h wird die Polymerisation abgebrochen und das Polymer mit Methanol gefällt. Anschließende polymeranaloge Umsetzung mit LiBr in Acetonitril bei 80°C (3d) führt zur Präzipitation des reinen Polylithiumsalzes des polymeren Bisphosphonats als farbloser Feststoff.

Durch die Kombination unterschiedlicher Comonomere entstehen Copolymere mit ausgeprägter Proteinselektivität, die direkt zur Abtrennung von Proteinen aus Gemischen eingesetzt werden.

Comonomere zur Synthese Bisphosphonat tragender Polymere:

R¹ = C₁-C₃ Alkyl oder Aryl
R² = N, CH₃

spacer = C₀-C₁₀Alkyl oder Peptidyl (0–10 beliebige Aminosäuren) 7–9 Bisphosphonat-Monomere, 10 Alkylmonomere, 11 Dansylmonomere, 12–13 m-Xylylendiamin-, Amidino- und Guanidino-Monomere, 14 Aminoalkohol-Monomere.

Die Copolymerisation erfolgt nach dem oben beschriebenen allgemeinem Verfahren, nur mit einem definierten Verhältnis der Comonomere. Dabei unterscheidet sich das stöchiometrische Verhältnis zweier Monomere bis um einen Faktor von 1:10. Das fluoreszierende Dansylmonomer wird entweder in geringer Menge als Fluoreszenzlabel einpolymerisiert (2–10 Mol-%) oder alternativ als Haftgruppe für aromatische Aminosäuren auf der Proteinoberfläche verwendet (10–30 Mol-%). Zur Erkennung unpolarer aliphatischer Aminosäuren verwendet man Alkylmonomere 10, zur Erkennung saurer Aminosäuren auf der Proteinoberfläche m-Xylylenamino- oder Amidino-Monomere 12–13.

Die Ermittlung von Bindungskonstanten freier Proteine an die Bisphosphonat tragenden Polymere wird in 30 mM wässrigem NaH₂PO₄-Puffer per Fluoreszenztitration mit Dansyl-gelabeltem Polymer (10%) durchgeführt. Dabei ergeben sich folgende Bindungskonstanten:
Homopolymer/BSA: 2 × 10⁵ M^–1 (Monomer 7)
Copolymer BSA: 2 × 10⁵ M^–1 (Monomere 7 und 14 = 1:3)
Copolymer Lysozym: 4 × 10⁶ M^–1 (Monomere 7 und 14 = 1:3)
Copolymer Lysozym: 4 × 10⁷ M^–1 (Monomere 7 und 10 und 14 = 3:1:3)

Die Bisphosphonat tragenden Polymere binden deutlich stärker an Proteine als die vergleichbaren Bisphosphonat tragenden Dendrimere.

Eine weitere Anwendung dieser Polymere ergibt sich aus der Verdrängung eines kationischen Farbstoffs, welcher stark an das Polymer bindet und bei seiner Freisetzung seine Farbe oder Fluoreszenzaktivität ändert. Erfolgt diese Verdrängung durch ein spezifisches Protein in physiologischer Lösung, so lässt sich damit die Konzentration des fraglichen Proteins bestimmen (Indicator-Displacement-Assay IDA).

Ausführungsbeispiele

1. Herstellung der Bisphosphonat tragenden Dendrimere

A. Herstellung des Benzaldehyd-Bausteins:

3,5-Bis(dimethoxyphosphinylmethyl)benzaldehyd:

Eine Lösung von 3,5-bis(brommethyl)benzaldehyd (700 mg, 2.4 mmol) wird im Überschuss mit reinem Trimethylphosphit (30 mL, 254 mmol) versetzt und 4 h zum Rückfluss erhitzt. Das überschüssige Trimethylphosphit wird im Vakuum abkondensiert und das verbleibende gelbe Öl durch Chromatographie an Silica eluiert mit DCM/MeOH 20:1 (R_f = 0.32). Ausbeute: 770 mg (2.2 mmol, 92%). ¹N-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ 9.99 (s, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.53 (m, 1H), 3.71 (d, ³J_P,H = 11.0 Hz, 12H), 3.23 (d, ²J_P,H = 22.0 Hz, 4H), ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 191.6, 136.9, 133.1, 131.9, 129.9, 129.6, 53.0 (d, ¹J_P,C = 6.7 Hz), 32.3 (d, ²J_P,C = 138.2 Hz), ³¹P-{¹H}-NMR (81 MHz, CDCl₃): δ 28.2 (s), Elementaranalyse: berechnet (+1.5 eq H₂O): C = 41.39%, H = 6.14%, gefunden: C = 41.55%, N = 5.96%.

3,5-Bis[(methoxyphosphonyl)methyl]benzaldehyd dilithium Salz 1a:

Eine Lösung von 3,5-Bis(dimethoxyphosphinylmethyl)benzaldehyd (1.0 g, 2.9 mmol, 1.0 eq) wird mit trockenem Lithiumbromid (0.5 g, 5.8 mmol, 2.0 eq.) in 50 mL wasserfreiem Acetonitril zum Rückfluss erhitzt für 48 h in Argon-Atmosphäre. Das Präzipitat wird gefiltert und mehrfach mit wasserfreiem Acetonitril gewaschen. Ausbeute: 870 mg (2.6 mmol, 90%). %). ¹H-NMR (200 MHz, MeOH-d₄): δ 9.93 (s, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.58 (m, 1H), 3.51 (d, ³J_P,H = 10.2 Hz, 6h), 3.05 (d, ²J_P,H = 20.7 Hz, 4H), ¹³C-NMR (75 MHz, D₂O): δ 196.9, 137.9 (t, ³J_P,C = 5.6 Hz), 136.5 (m), 129.3 (t, ³J_P,C = 4.5 Hz), 52.2 (d, ¹J_P,C = 6.2 Hz), 33.6 (d, ²J_P,C = 128.1 Hz), ³¹P-{¹H}-NMR (81 MHz, MeOH-d₄): δ 25.2 (s), Elementar Analyse: berechnet (+1.5 eq H₂O): C = 36.59%, N = 4.75%, gefunden: C = 35.81%, N = 4.69%.

B. Verfahren zur Synthese der Biphosphonat tragenden Dendrimere:

Eine Lösung von 3,5-Bis(methoxyphosphorylmethyl)benzaldehyd Dilithiumsalz (100 mg, 0.3 mmol) wird in 1.0 eq. in Relation zu den freien Ammoniumgruppen des Polypropyleneimin Dendrimers (DAB-Am 4: 25 μL, 75.0 μmol, 0.25 eq.; DAB-Am 8: 26 mg, 37.5 μmol, 0.125 eq.; DAB Am 16: 28 mg, 18.8 μmol, 0.063 eq.) in 30 mL wasserfreiem Methanol mit Molekularsieb 3 Å unter Argon bei 25°C gerührt. Nach ca. 72 h wird Natriumborohydrid (15 mg, 0,33 mmol, 1.1 eq.) hinzugefügt und die Lösung für weitere 24 h gerührt. Das pulverisierte Molekularsieb wird abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die zurückbleibende feste Phase wird über HPLC gereinigt z.B. an einer Nucleodur 100-5 CN-RP Säule mit einem Gradienten beginnend bei 100% Wasser (1% TFA) bis zu 100% Acetonitril (1% TFA) und charakterisiert, wie folgt:

Bisphosphonat tragendes Dendrimer 4 (Tetramer):

¹H-NMR (200 MHz, MeOH-d₄): δ 7.13 (s, 12H), 3.81 (s, br, 8H), 3.51 (d, ³J_P,H = 10.5 Hz, 24H), 3.00 (d, ²J_P,H = 20.5 Hz, 16H), 2.69 (br, 8H), 2.54 (br, 12H), 1.72 (br, 8H), 1.46 (br, 4H), ³¹P-{¹H}-NMR (81 MHz, MeOH-d₄): δ 27.47, MS (MALDI-TOF) m/z 1541.7 [M_{protonierte Phosphonate} +H]⁺.

Bisphosphonat tragendes Dendrimer 5 (Oktamer):

¹H-NMR (300 MHz, McOH-d₄): δ 7.16 (m, 16H), 7.11 (s, 8H), 3.69 (s, 16H), 3.50 (d, ³J_P,H = 10.2 Hz, 48H), 2.96 (d, ²J_P,H = 20.5 Hz, 32H), 2.61 (br, 16H), 2.48 (br, 36H), 1.71 (br, 24H), 1.47 (br, 4H), ³¹P{¹H}-NMR (81 MHz, MeOH-d₄): δ 26.24, MS (MALDI-TOF) m/z 3321.7 [M_Li-salz +H]⁺.

Bisphosphonat tragendes Dendrimer 6 (Hexadecamer):

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₄): δ 7.13 (m, 48H), 3.72 (br, 32H), 3.50 (d, ³J_P,H = 10.2 Hz, 96H), 3.00 (d, ²J_P,H = 20.0 Hz, 64H), 2.34–2.73 (br, 116H), 1.68 (br, 56H), 1.29 (br, 4H), ³¹P-{¹H}-NMR (81 MHz, MeOH-d₄): δ 25.83, MS (MALDI-TOF) m/z 3292.2 [M_{protonierte Phosphonate} +2H]²⁺.

Fluoreszenztitration

Die Fluoreszenztitration wird mit OregonGreen488-markierten Proteinen durchgeführt. Der aktive Succinimidylester von OregonGreen488 ist käuflich von der Firma Molecular Probes erhältlich und wird nach Herstellerangaben zur Markierung der Proteine eingesetzt. Die Reinigung erfolgt durch Gelfiltration beispielsweise an einer HiTrap^TM Entsalzungsäule von Amersham Biosciences mit einem Fluss von 1 mL/min. Zur Elution wird Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ Puffer (pH = 7.1; 10 mM) mit 100 mM NaCl verwendet. Die Proteinlösungen werden konzentriert und durch Ultrazentrifugation beispielsweise an Vivaspin MWCO PES Filtern der Firma Vivascience/Sartorius entsalzt.

Die markierten Proteine werden in Phosphatpuffer (10 mM, pH = 7.1) aufbewahrt. Die Dendrimere werden in dieser Proteinlösung gelöst. 400 oder 700 μL dieser Lösung werden in eine Küvette gefüllt und bis zu 300 μL der Dendrimerlösung wird schrittweise zugegeben. Die Änderung der Emissionintensität wird gemessen und am Beispiel des Oktamer B) tabellarisch dargestellt (Tabelle 1): C_BSA = 5.99·10^–6 mol/l, c_Oktamer = 1.79·10^–4 mol/l

K_a(2:1) = 19700 M^–1 ± 22.7%
K_a(3:1) = 12600 M^–1 ± 21.9%

2. Herstellung der Bisphosphonat tragenden Polymere

A. Herstellung der Monomere:

5-Nitro-m-xylylenbisphosphonsäuretetramethylester.

Unter Argonatmosphäre legt man eine Lösung von 5-Nitro-m-xylol (9.52 g, 63.0 mmol) in 165 mL Tetrachlorkohlenstoff vor, versetzt diese mit N-Bromsuccinimid (24.83 g, 139.5 mmol, 2.2 eq) und katalytischen Mengen AIBN und erhitzt 13 h zum Rückfluss. Nach Abfiltration des auf der Oberfläche schwimmenden Succinimids wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Es bleibt ein gelbes Öl zurück. Durch Umkristallisation aus 7 mL Essigsäureethylester und 15 mL n-Hexan wird ein gelber, unreiner Feststoff erhalten (7.9 g Rohprodukt, 25.6 mmol; 40%). Dieser wird in 9.5 ml Trimethylphosphit (9.99 g; 80.5 mmol; 3.1 eq) versetzt und 5 h zum Rückfluss erhitzt. Die leichtflüchtigen Bestandteile werden im Ölpumpenvakuum entfernt und das Produkt säulenchromatographisch an 600 g Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (14:1 v/v, R_F = 0.29) gereinigt. Ausbeute: 4.10 g gelblicher Feststoff (11.2 mmol, 18% über 2 Stufen). ¹H-NMR (CDCl₃; 200 MHz): δ(ppm) = 3.25 (d, ²J_H,P = 22.0 Hz, 4H); 3.73 (d, ³J_H,P = 11.0 Hz, 12H); 7.57–7.62 (m, 1H); 8.04–8.07 (m, 2H). ³¹P{¹H}-NMR (CDCl₃; 81 MHz): δ(ppm) = 27.3 (s).

5-Amino-m-xytylenbisphosphonsäuretetramethylester.

5-Nitro-m-xylylenbisphosphonsäuretetramethylester (4.10 g, 11.2 mmol) werden in 110 mL Methanol gelöst und mit Palladium auf Kohle (0.93 g, 10% Pd = 93 mg, 0.9 mmol, 7.8 mol%) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Wasserstoffatmosphäre 15 h bei RT gerührt. Nach Filtration über Kieselgur zur Abtrennung des Katalysators wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Ausbeute: 3.20 gleicht gelber Feststoff (9.5 mmol, 85%). ¹H-NMR (CDCl₃; 200 MHz): δ(ppm) = 3.06 (d, ²J_H,P = 21.8 Hz, 4H); 3.06 (sb, 2H); 3.68 (d, ³J_H,P = 10.8 Hz, 12H); 6.53–6.58 (m, 2H); 6.56–6.61 (m, 1H). ³¹P{¹H}-NMR (CDCl₃; 81 MHz): δ(ppm) = 29.5 (s).

5-Methacrylamido-m-xylylenbisphosphonsäuretetramethylester 7.

5-Amino-m-xylylenbisphosphonsäuretetramethylester (900 mg, 2.7 mmol, 1.0 eq), Triethylamine (320 mg, 3.2 mmol, 1.18 eq) und katalytische Mengen 4-N,N-Dimethylaminopyridin werden in 30 mL Dichloromethan gelöst. Bei 0°C wird innerhalb von 1 h eine Lösung von Methacrylsäurechlorid (0.42 g, 4.0 mmol; 1.51 eq) und 8 mL Dichlormethan zugetropft und anschließend 1 h bei RT weitergerührt. Die organische Phase wird mit 30 mL 0.6 N Natronlauge gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wird säulenchromatographisch an 110 g Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (19:1 v/v, R_F = 0.09) gereinigt. Ausbeute: 0.90 g hochviskoses farbloses Öl (2.2 mmol; 83%). ¹H-NMR (CDCl₃; 200 MHz): δ(ppm) = 2.06 (dd, ⁴J_H,H = 1.5 Hz, ⁴J_H,H = 1.0 Hz, 3H); 3.15 (d, ²J_H,P = 22.0 Hz, 4H); 3.70 (d, ³J_H,P = 10.8 Hz, 12H); 5.47 (qd, 1H); 5.79 (qd, 1H); 6.97–7.01 (m, 1H); 7.47–7.50 (m, 2H); 7.69 (sb, 1H). ³¹P{¹H}-NMR (CDCl₃; 81 MHz): δ(ppm) = 28.9 (s). MS (ESI pos., MeOH); m/z: 444 [M + K]⁺, 428 [M + Na]⁺, 406 [M + H]⁺. HRMS (ESI pos., MeOH) berechnet for C₁₆H₂₅NNaO₇P₂ [M + Na]⁺ m/z: 428.1004, gefunden: m/z: 428.1011; Elementaranalyse: berechnet: C 47.41%; H 6.22%; gefunden: C 47.71%; H 6.41%.

5-Methacrylamido-m-xylylenbisphosphonsäuredimethylester Dilithiumsalz 7a:

5-Methacrylamido-m-xylylenbisphosphonsäuretetramethylester (591 mg, 1.5 mmol, 1.0 eq) wird unter Argonatmosphäre in 35 mL absolutem Acetonitril gelöst. Eine Lösung von Lithiumbromid (283 mg; 3.3 mmol; 2.24 eq) in 9 mL Acetonitril wird hinzugefügt und die Reaktionsmischung für ca. 8 h unter Rückfluss erhitzt. Während dieser Zeit präzipitiert das Produkt aus der Reaktionsmischung. Das Lösungsmittel wird abdekantiert und der weiße Feststoff dreimal mit Acetonitril gewaschen. Nach Trocknung unter Vakuum entsteht eine hygroskopische analytisch saubere Substanz. Ausbeute: 0.60 g farbloser Feststoff (1.5 mmol; 100%). ¹H-NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 1.99 (s, 3H); 3.01 (d, ²J_H,P = 20.5 Hz, 4H); 3.51 (d, ³J_H,P = 10.5 Hz, 6H); 5.54 (s, 1H); 5.79 (s, 1H); 7.00–7.04 (m, 1H); 7.18–7.21 (m, 2H). ³¹P{¹H}-NMR (D₂O; 81 MHz): δ(ppm) = 26.8 (s). ¹³C{¹H}-NMR (D₂O; 50 MHz): δ(ppm) = 18.1; 33.7; 52.0–52.2; 121.6–122.0; 128.3–128.6; 135.9–136.2; 136.9–137.1; 140.1; 171.3.

Methacrytamidopropan-2-ol 14.

Eine Lösung von Methacrylsäurechlorid (2.72 g, 26.0 mmol, 1.0 eq) in 40 mL trockenem Dichlormethan wird tropfenweise zu einer Mischung aus 1-Aminopropan-2-ol (4.21 g, 56.1 mmol, 2.16 eq) in 40 mL trockenem Dichlormethan bei 0°C unter Argonatmosphäre hinzugefügt. Der präzipitierende Feststoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Die Reinigung erfolgt säulenchromatographisch an 250 g Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (14:1 v/v, R_F = 0.22). Ausbeute: 1.80 g farbloser Feststoff (12.6 mmol; 48%). ¹H-NMR (CDCl₃; 200 MHz): δ(ppm) = 1.21 (d, ³J_H,H = 6.4 Hz, 3H); 1.98 (dd, ⁴J_H,H = 1.5 Hz, ⁴J_H,H = 1.0 Hz, 3H); 2.51 (sb, 1H); 3.18 (ddd, ²J_H,H = 14.0 Hz, ³J_H,H = 7.5 Hz, ³J_H,H = 5.3 Hz, 1H); 3.51 (ddd, ²J_H,H= 14.0 Hz, ³J_H,H = 6.5 Hz, ³J_H,H = 3.0 Hz, 1H); 3.96 (dqd, ³J_H,H = 7.5 Hz, ³J_H,H = 6.4 Hz, ³J_H,H= 3.0 Hz, 1H); 5.36 (qd, ⁴J_H,H = 1.5 Hz, ²J_H,H = 1.4 Hz, 1H); 5.74 (dq, ²J_H,H = 1.4 Hz, ⁴J_H,H = 1.0 Hz, 1H); 6.38 (sb, 1H).

Methacrylamido-8-aminooctan 10.

Unter Argonatmosphäre wird eine Lösung von Methacrylsäurechlorid (493 mg, 4.7 mmol, 1.0 eq) in 10 mL trockenem Dichlormethan tropfenweise einer Lösung von 1,8-Diaminooctan (2.04 g, 14.2 mmol, 3.00 eq) und Triethylamine (1.43 g, 14.1 mmol, 3.00 eq) in 30 mL trockenem Dichlormethan bei 0°C hinzugefügt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt und das Produkt säulenchromatographisch an Kieselgel mit Dichloromethan/Methano/Triethylamin (933:67:1 v/v/v, R_F = 0.13) gereinigt. Ausbeute: 0.50 g schwach gelber Feststoff (2.4 mmol; 50%) erfolgt. ¹H-NMR (CDCl₃; 200 MHz): δ(ppm) = 1.26–1.36 (m, 6H); 1.45–1.55 (m, 2H); 1.62–1.71 (m, 2H); 2.86 (t, ³J_H,H = 5.0 Hz, 2H); 3.29 (td, 2H); 5.30 (qd, 1H); 5.65–5.70 (m, 2H); 5.93 (sb, 1H).

(8-Methacrylamidooctyl)-5'-N,N-dimethylaminonaphthalinsulfonsäureamid 11.

Unter Argonatmosphäre wird 5-N,N-Dimethylaminonaphthalinsulfonsäurechlorid (0.90 g, 3.3 mmol, 1.42 eq) einer Lösung von Methacrylamido-8-aminooctan (0.50 g, 2.3 mmol, 1.0 eq), Diisopropylethylamin (0.48 g, 3.7 mmol, 1.58 eq) und katalytischen Mengen 4-N,N-Dimethylaminopyridin in 50 mL Dichloromethan bei 0°C hinzugefügt. In Abwesenheit von Licht wird die Lösung auf RT erwärmt und ca. 15 h gerührt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt und das Produkt säulenchromatographisch an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (30:1 v/v, R_F = 0.22) gereinigt. Ausbeute: 330 mg hochvisköses grünes Öl (0.74 mmol; 31%). ¹H-NMR (CDCl₃; 200 MHz): δ(ppm) = 0.99–1.54 (m, 12H); 1.96 (dd, ⁴J_H,H = 1.5 Hz, ⁴J_H,H = 0.9 Hz, 3H); 2.80–2.95 (m, 8H); 3.26 (td, ³J_H,H = 7.2 Hz, ³J_H,H = 6.0 Hz, 2H); 4.72 (t, ³J_H,H = 6.0 Hz, 1H); 5.30 (qd, ⁴J_H,H = 1.5Hz, ²J_H,H = 1.4 Hz, 1H); 5.66 (dq, ²J_H,H = 1.4 Hz, ⁴J_H,H = 0.9 Hz, 1H); 5.82 (sb, 1H); 7.19 (d, ³J_H,H = 7.3 Hz, 1H); 7.48–7.61 (m, 2H); 8.21–8.32 (m, 2H); 8.54 (d, ³J_H,H = 8.8 Hz, 1H). ¹³C{¹H}-NMR (CDCl₃; 50 MHz): δ(ppm) = 18.8; 26.4; 26.8; 28.9; 29.0; 29.5; 29.6; 39.7; 43.4; 45.5; 115.3; 118.8; 119.2; 123.3; 128.5; 129.7; 129.8; 130.0; 130.5; 134.9; 140.4; 152.2; 168.6. MS (ESI pos., MeOH); m/z: 468 [M + Na]⁺, 446 [M + H]⁺. HRMS (ESI pos., MeOH) berechnet für C₂₄H₃₅N₃NaO₃S [M + Na]⁺ m/z: 468.2291, gefunden: m/z: 468.2291; Elementaranalyse: berechnet: C 64.69%; H 7.92%; N 9.43%; gefunden: C 64.35%; H 8.00%; N 9.51%.

Verfahren zur Polymerisierungsreaktion

Eine Lösung der Monomere 7–9 (Phosphonat), 14 (Amidopropanol) und/oder 11 (Dansylamid) und eine katalytische Menge an AIBN in DMF wird entgast und für ca. 8–27 h bei 60°C gerührt (s. Tabelle). Die Reaktionsmischung wird auf eine maximale Konzentration von 5% (bezogen auf die Gesamtmasse der Monomere) mit Methanol verdünnt und tropfenweise in das 10fache Volumen Essigester gegeben. Das dabei präzipitierende Polymer (allgemeine Struktur 3) wird abfiltriert, mit Essigester gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Die folgende Tabelle fasst die Mengen an Monomer und Initiator zusammen, sowie Lösungsmittelvolumen, Polymerisationszeiten und Ausbeute an isoliertem Polymer für dansylfreie und dansylhaltige Homo- P1, P3 und Copolymere P2, P4.

Verfahren zur polymeranalogen Spaltung der Phosphonsäuremethylester

1 eq des Polymeren (bezogen auf den bei der Herstellung verwendeten Stoffmengenanteil des Bisphosphonatbausteins) wird unter Argonatmosphäre mit 2.2–2.5 eq trockenem Lithiumbromid versetzt und in abs. Acetonitril suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird 70–120 Stunden zum Rückfluss erhitzt und das Lösungsmittel abdekantiert. Der farblose Feststoff wird dreimal mit Acetonitril gewaschen. Das reine hygroskopische Produkt wird nach Trocknung im Vakuum erhalten.

Polymer Charakterisierung

Die erhaltenen Polymere P1, P2, P3, P4 werden durch ¹H-NMR und ³¹P-NMR-Spektroskopie, sowie durch Elementaranalyse (vor der Phosphonester-Spaltung, P1 und P2) charakterisiert. Die Molekulargewichtsverteilung wird durch GPC Messungen in DMF oder Wasser erhalten.

P1: Mw 41000 Mn 28000 (DMF)
P2: Mw 56000 Mn 38000 (Wasser)
P3: Mw 43000 Mn 26000 (Wasser)
P4: Mw 79000 Mn 4000 (Wasser)
P1: ¹H NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 1.29 (sb, 3H); 2.0 (sb, 2H); 2.93 (sb, 4H); 3.34 (sb, 6H); 7.00 (sb, 3H). ³¹P NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 26.7. Elementaranalyse: berechnet für (C₁₆H₂₅NO₇P₂)_n (ungespaltenes Polymer): C 47.41%; H 6.22%; N 3.46%; gefunden: C 46.97%; H 5.76%; N 3.06%
P2: ¹H NMR (D₂O; 500 MHz): δ(ppm) = 1.22 (sb); 1.91 (sb); 3.11 (sb); 3.22 (sb); 3.58 (sb); 3.94 (sb); 7.11 (sb). ³¹P NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 24.7. Elementaranalyse: berechnet for (C₁₆H₂₅NO₇P₂)_n(C₇H₁₃NO₂)_2.5n (ungespaltenes Polymer): C 52.71%; H 7.59%; N 6.42%; gefunden: C 50.98%; H 8.16%; N 6.78%.
P3: ¹H NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 1.32 (sb, 3H); 2.08 (sb, 2H); 2.93 (sb, 4H); 3.35 (sb, 6H); 7.00 (sb, 3H). ³¹P NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 26.7. (Dansyl Protonen Signale erscheinen in Wasser sehr breit, sind aber in CDCl₃ gut aufgelöst)
P4: ¹H NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 1.09 (sb); 1.80 (sb); 2.92 (sb); 3.44 (sb); 3.49 (sb); 3.83 (sb); 7.01 (sb); 7.61 (sb); 8.29 (sb). ³¹P NMR (D₂O; 200 MHz): δ(ppm) = 26.7. (Dansyl Protonen Signale erscheinen in Wasser sehr breit, sind aber in CDCl₃ gut aufgelöst)

Verfahren zur Protein-Titration

Eine Lösung des dansylhaltigen Polymers (P3, P4) wird in wässrigem Phosphatpuffer (30 mM, pH 7.1, c_Polymer = 3·310^–8–4·610^–6 mol/l) hergestellt. Eine Proteinstammlösung wird durch Lösen der Proteine in dieser gepufferten Polymerlösung (c_Protein = 9·410^–6–2·310^–4 mol/l) hergestellt. 700 μL der Polymerlösung werden in eine rührbare Küvette gegeben, schrittweise mit bis zu 1 mL der Proteinstammlösung versetzt und mittels Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Proben werden mit einer Wellenlänge von 330 nm angeregt und die Änderung der Emissionsintensität bei 525 nm oder 530 nm bestimmt. Zur Bestimmung der Stöchiometrie wird die Konzentration des Polymers mit einem virtuellen Korrekturfaktor multipliziert, bis der Job-Plot eine 1:1 Stöchiometrie zeigt. Der virtuelle Korrekturfaktor und die bestimmten Stöchiometrien sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. Bindungkonstanten sind durch nichtlineare Regression für 1:1 Stöchiometrie mit der korrigierten Polymerkonzentration berechnet.

Exemplarische Bindungskurven

1. Fluoreszierendes Homopolymer P3 vs. Cyt C: c_Homopolymer = 2.00·10^–6 mol/l, c_CytC = 7.39·10^–5 mol/l

K_a(2:1) = 5.8·10⁵ M^–1 ± 2%

2. Fluoreszierendes Polymer P3 vs. Bovines Serum Albumin (BSA): c_Homopolymer = 2.00·10^–6 mol/l, c_BSA = 4.07·10^–5 mol/l

K_a(5:2) =1.8·10⁵ M^–1 ± 15%

3. Fluoreszierendes Polymer P3 vs. Ferritin (+13.5 mM NaCl): c_Homopolymer = 3.45·10^–6 mol/l, C_Ferritin = 1.67·10^–5 mol/l

K_a(1:9) = 12·10⁶ M^–1 ± 7%

Reflektometrische Interferenz-Spektroskopie (RIfS-Messungen):

Allgemeine Arbeitsvorschrift:

Die Interferenzschicht (10 nm Ta₂O₅ und 500 nm SiO₂ auf Floatglas) wird in einer frisch hergestellten Mischung aus zwei Teilen konz. H₂SO₄ und einem Teil 30%iger H₂O₂ gereinigt. Alle weiteren Schritte werden in einem Durchflusssystem ausgeführt und Bindungseffekte mit RIfS beobachtet. Um nicht-kovalente Adsorption von negativ geladenen Polymeren auf der Detektionsoberfläche zu erreichen, wird zunächst eine Schicht Polyethylenimin (PEI, 50.000 g/mol) immobilisiert. Dies geschieht durch Spülung der Oberfläche mit 300 μl PEI-Lösung (c = 100 μg/ml) in Phosphatpuffer pH 7.0 in einer Zeitspanne von 60 s. Nach einer Waschperiode von 150 s mit Puffer wird die erhaltene kationische Oberfläche mit den Polymeren P1 oder P2 beladen. Dies wird durch 60 s Spülung mit 300 μl gepufferter wässriger Lösung der Polymere (c = 100 μg/ml) erreicht. Zur Untersuchung von nicht-spezifischer Bindung aufgrund der polyanionischen Eigenschaften des Polymers werden andere negativ geladenen Polymere als Referenz auf Oberflächen immobilisiert. Dazu werden, analog zu den anderen Polymeren, die PEI-vorbehandelten Oberflächen mit Polyvinylsulfat oder Polyphosphat gespült.

Im Verlauf der RIfS-Experimente wurde beobachtet, dass die Proteine auf unterschiedlichen Bindungsplätze auf der Polymeroberfläche binden – einem eher irreversiblen und einem reversiblen Bindungsplatz. Aus dem Signal der reversiblen Bindung konnten Bindungskurven abgeleitet werden. Um alle irreversiblen Bindungsplätze zu besetzen wurde bei den Titrationen zuerst mit der höchsten Proteinkonzentration gespült. In logarithmischen Abständen wurden 4–6 weiter Proteinkonzentrationen untersucht (c_proteins = 8·10^–7–1·10^–3 mol/l). Die Änderung der optischen Schichtdicke wurde aufgenommen und die Bindungskonstante mit nicht-linearen Regressionsmethoden bestimmt.

Für die Untersuchung der irreversiblen Bindungsplätze wurden die Dissoziationsratenkonstanten durch Anfitten des Dissoziationsabschnitts mit einem biexponentiellen Dissoziationsmodell bestimmt. Kleine Dissoziationsraten deuten auf eine starke Bindung hin. Ergebnisse:

Exemplarische Bindungskurve: Trypsin auf immobilisiertem Homopolymer P1

K_a = 1.2·10⁵M^–1 ± 27%

Abbildungslegenden

1:

1 zeigt fluoreszierendes Homopolymer P3 (Ordinate), das gegen Cytochrom C (Cyt C, Abszisse) aufgetragen wurde.
C_Homopolymer = 2.00·10^–6 mol/l, C_CytC = 7.39·10^–5 mol/l
K_a(2:1) = 5.8·10⁵ M^–1 ± 2%

2:

2 zeigt fluoreszierendes Polymer P3 (Ordinate), das gegen Bovines Serumalbumin (BSA, Abszisse) aufgetragen wurde.
C_Homopolymer = 2.00·10^–6 mol/l, c_BSA = 4.07·10^–5 mol/l
K_a(5:2) = 1.8·10^–5 M^–1 ± 15%

3:

3 zeigt fluoreszierendes Polymer P3 (Ordinate), das gegen Ferritin (+ 13.5 mM NaCl; Abszisse) aufgetragen wurde.
C_Homopolymer = 3.45·10^–6 mol/l, C_Ferritin = 1.67·10^–5 mol/l
K_a(1:9) = 1.2·10⁶ M^–1 ± 7%

4:

Immobilisierung des Homopolymers P1 (rot) und des Copolymer P2 (blau) nach vorheriger Behandlung der Oberfläche mit PEI.

5:

5 zeigt eine exemplarische Bindungskurve von Tripsin auf immobilisiertem Homopolymer P1.
K_a = 1.2·10⁵ M^–1 ± 27%

Claims

Polymere und Dendrimere mit Bisphosphonatgruppen, dadurch gekennzeichnet, dass die Bisphosphonatgruppen eine hohe Affinität für basische und Arg-getaggte Proteine aufweisen, wobei unter basischen Proteine solche Proteine verstanden werden, die einen isoelektrischen Punkt größer 7 aufweisen, sowie Proteine mit einem Arginin-Anteil (Arg-Tags oder Arg-getaggte Proteine) von wenigstens einem Arginin, und wobei Proteine natürlich vorkommende und rekombinant hergestellte Proteine sind.
Feste Phase, umfassend Polymere und Dendrimere mit Bisphosphonatgruppen gemäß Anspruch 1 sowie einen Träger.
Feste Phase gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein unpolares Harz ist, bevorzugt ein polymeres Methacrylamid oder ein Polystyrol.
Feste Phase gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein hochpolares Harz ist, bevorzugt Sepharose oder Cellulose.
Verfahren zur Herstellung Bisphosphonat tragender Polymere und Dendrimere gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Schritte – freie radikalische Polymerisation von Methacrylat-basierten, neutralen Phosphonsäuredimethylester-Monomeren in DMF mit AIBN, wahlweise im Gemisch mit Comonomeren, – Abbrechen der Polymerisation nach 8 bis '24 h, – Fällung des Polymers mit Methanol, – polymeranaloge Umsetzung mit LiBr in Acetonitril.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die polymeranaloge Umsetzung bei 80°C (3d) stattfindet.
Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Comonomere ausgewählt sind aus
R¹ = C₁-C₃ Alkyl oder Aryl R² = H, CH₃
spacer = C₀-C₁₀Alkyl oder Peptidyl (0–10 beliebige Aminosäuren)
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Comonomere und Methacrylat-basierte, neutrale Phosphonsäuredimethylester-Monomere im Verhältnis 1:1 bis 10:1 eingesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bisphosphonat tragenden Polymere und Dendrimere radioaktiv- und/oder fluoreszenzmarkiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bisphosphonat tragenden Polymere und Dendrimere fluoreszenzmarkiert sind, wobei das Fluorophor ausgewählt ist aus der Gruppe Dansyl, Fluorescein, OregonGreen.
Verfahren zur Herstellung einer festen Phase umfassend Bisphosphonat tragende Polymere oder Dendrimere an einem Träger, gekennzeichnet durch die Schritte – Herstellung Bisphosphonat tragender Polymere und Dendrimere gemäß einem der Ansprüche 5 bis 10, – Immobilisierung des Bisphosphonat tragenden Polymers oder Dendrimers mit einer äquimolaren Menge Tritylharz, – vollständige reduktive Aminierung mit Formylxylylenbisphosphonat, – Abspaltung mit heißem Trifluorethanol.
Verfahren zur Aufkonzentrierung, Isolierung und/oder Reinigung von Proteinen mit Bisphosphonat tragenden Polymeren und Dendrimeren, gekennzeichnet durch die Schritte – Validierung des Verfahrens mit Modellproteinen, – Reingigung von basischen, ARg-reichen und/oder Arg-getaggten Proteinen nach einem Standardprotokoll der Affinitätschromatographie, – Elution der Proteine.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Modellprotein ausgewählt wird aus der Gruppe reines Arg-getaggtes Maltosebindendes Protein, Cytochrom C-gelabeltes Histon, OregonGreen-gelabeltes Histon.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution mit NaCl-Pufferlösung, Phosphat-Pufferlösung oder selektiven Bisphosphonatbindern, bevorzugt Guanidiniumionen, erfolgt.
Verfahren zur Aufkonzentrierung, Isolierung und/oder Reinigung von Proteinen mit Bisphosphonat tragenden Polymeren und Dendrimeren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine festen Phase umfassend Bisphosphonat tragende Polymere oder Dendrimere an einem Träger gemäß Anspruch 11 verwendet wird.
Verwendung von Bisphosphonat tragenden Polymeren und Dendrimeren gemäß Anspruch 11 zur Anbringung auf der Oberfläche eines Chips.
Verwendung der festen Phase umfassend Bisphosphonat tragende Polymere und Dendrimere und einen Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 zur Aufkonzenrierung, Isolierung und/oder Reinigung von Proteinen.
Verwendung der festen Phase umfassend Bisphosphonat tragende Polymere und Dendrimere und einen Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen.