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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches
und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels elektrophoretischer Trennung
mit einer miniaturisierten Separationskammer, welche in einer Hauptflussrichtung
vom Analytgemisch hydrodynamisch durchströmt wird, wobei an zwei Seiten
der Separationskammer Elektroden angeordnet sind, mittels welcher
ein elektrisches Feld in der Separationskammer erzeugt wird.
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Neben
der Chromatographie zählt
die Elektrophorese, und zwar insbesondere die sogenannte Kapillarelektrophorese,
zu den am häufigsten
eingesetzten Trennmethoden. Die Elektrophorese beruht auf unterschiedlichen
Wanderungsgeschwindigkeiten von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld,
welche von der Art und Anzahl der Ladungen sowie vom Molekülradius
abhängig
sind. Diese stoffspezifische Abhängigkeit
wird als elektrophoretische Mobilität μ bezeichnet.
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Eine
andere elektrophoretische Technik ist die kontinuierliche trägerfreie
Elektrophorese (continuous free-flow electrophoresis CFFE), die
ursprünglich
als Trenntechnik zur Isolierung und Reinigung von Zellen und Proteinen
entwickelt wurde.
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Während bei
der Kapillarelektrophorese das elektrische Feld entlang der Fließrichtung
angelegt wird und sich somit eine longitudinale Wanderung und Trennung
der Analytmoleküle
ergibt, wird das elektrische Feld bei der kontinuierlichen trägerfreien Elektrophorese
orthogonal zu einem Fluss des Analytgemisches appliziert, der die
Separationskammer hydrodynamisch durchströmt. Dabei wirken auf jedes Analytmolekül zwei senkrecht
aufeinanderstehende Geschwindigkeitsvektoren. Ein Geschwindigkeitsvektor
wirkt entlang des Pufferflusses mit dessen Betrag, der zweite entlang
des elektrischen Feldes mit einem Betrag, der von der elektrophoretischen
Mobilität
des entsprechenden Analyten abhängig
ist. Der resultierende Summationsvektor ist um einen Winkel von
der Flussrichtung abgelenkt. Bei einem Gemisch aus mehreren Analytmolekülen, die
sich in ihren elektrophoretischen Mobilitäten unterscheiden, ergeben sich
voneinander verschiedene Summationsvektoren, die eine Ablenkung
der Analytmoleküle
von der Hauptflussrichtung und damit eine zweidimensionale Trennung
des Substanzgemisches nach sich ziehen. In einem sich etablierenden
Gleichgewichtszustand können
die aufgetrennten Substanzen für
weitere Bearbeitungsschritte am Ausgang der Separationskammer kontinuierlich
gesammelt oder abgeleitet werden, während die Trennung bei der
Kapillarelektrophorese nur diskontinuierlich im Zyklus zwischen Probeninjektion
und Separation erfolgen kann.
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Die
kontinuierliche trägerfreie
Elektrophorese wurde mittlerweise für den Einsatz in verschiedenen
Modi adaptiert, die aus der Kapillarelektrophorese bekannt sind.
Beispiele sind Zonenelektrophorese, Isotachophorese, Feldsprungelektrophorese
und isolelektrisches Fokussieren.
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Während kommerzielle
Geräte
Separationskammer- bzw. Trennbettvolumen von mehreren Millilitern
haben und die Trennzeit mehrere Minuten beträgt, konnten für miniaturisierte
Strukturen mit Volumen von wenigen Mikro- oder Nanolitern Trennzeiten von
Sekunden und Subsekunden erreicht werden. So konnte beispielsweise
ein Gemisch von Fluorescein und Rhodamin-110 im Modus der Zonenelektrophorese
innerhalb von 100 ms getrennt werden (Zeitschrift "Analytical Chemistry", 1. November 2003,
Volume 75, Seiten 5759–5766).
Beispielsweise in dieser Druckschrift ist eine gattungsgemäße Vor richtung beschrieben.
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Bei
den bekannten Vorrichtungen dieser Art ist eine elektrophoretische
Trennung bisher nur möglich,
wenn sich die Elektroden unterschiedlicher Potentiale in der zu
trennenden Lösung
oder in einer mit der zu trennenden Lösung in Verbindung stehenden Elektrolytlösung befinden.
Um zu verhindern, dass die Trennung durch Gasblasen, die aufgrund
der Elektrolyse an den Elektroden entstehen, beeinträchtigt wird,
befinden sich die Elektroden bei der kontinuierlichen trägerfreien
Elektrophorese in der Regel in einem Reservoir, das von der Separationskammer durch
schmale Kanäle
getrennt ist und als Stromschlüssel
(Ionenbrücke)
dient. Diese Kanäle
zwischen den Elektrodenreservoirs und dem Trennfeld in der Separationskammer
verhindern zwar die Migration von Gasblasen in die Separationskammer, stellen
aber hohe elektrische Widerstände
dar, über die
ein großer
Spannungsabfall auftritt. Um z.B. zwischen den Seiten der Separationskammer
eine Potentialdifferenz von etwa 300 V zu erzeugen, muss an den
Elektroden eine Spannung von 3.000 V angelegt werden.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine Vorrichtung der gattungsgemäßen Art
so weiterzuentwickeln, dass sich die absolut anzulegende Spannung zur
Erzeugung der notwendigen Potentialdifferenz in der Separationskammer
wesentlich verringern läßt.
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Diese
Aufgabe wird mit einer Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art
erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
dass zwischen den beiden Elektroden wenigstens eine dielektrische
Trennschicht angeordnet ist.
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Auf überraschend
einfache Weise ist es mit einer so gestalteten Vorrichtung möglich, ein
elektrisches Feld für
die Elektrophorese zu erzeugen, ohne dass eine elektrolytische Gasentwicklung
in der Separationskammer stattfindet. Damit kann auf die Integration
von Stromschlüsselelementen
(Trennkanäle) verzichtet
werden. Die absolut anzulegende Spannung kann drastisch reduziert
werden, nämlich
auf das Maß der
für die
Trennung erforderlichen Potentialdifferenz. Beim Anlegen einer Spannung
zwischen den beiden Elektroden werden mittels dielektrischer Verschiebung
an den Oberflächen
der dielektrischen Trennschicht Ladungen gleicher Vorzeichen aufgebaut.
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Um
eine Trennung der Separationskammer zu vermeiden, ist bevorzugt
vorgesehen, dass die wenigstens eine dielektrische Trennschicht
benachbart zu einer Elektrode angeordnet ist.
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Zur
Trennung mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE)
sind bevorzugt die beiden Elektroden parallel zur Hauptflussrichtung
angeordnet. Die Vorrichtung ist auch für die Kapillarelektrophorese
geeignet, wenn wenigstens eine dielektrische Trennschicht an einer
der Elektroden vorgesehen ist.
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In
besonders bevorzugter Ausgestaltung ist bei der Vorrichtung für die kontinuierliche
trägerfreie Elektrophorese
vorgesehen, dass jede Elektrode mittels einer dielektrischen Trennschicht
vom zugeordneten Rand der Separationskammer getrennt ist.
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Als
Material für
die dielektrische Trennschicht kommen grundsätzlich eine Vielzahl von Materialien
mit dielektrischen Eigenschaften in Betracht, besonders bevorzugt
besteht die dielektrische Trennschicht jedoch aus Glas.
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Wenn
die miniaturisierte Vorrichtung beispielsweise eine Separationskammer
mit Abmessungen von 4 mm × 12
mm aufweist, werden z.B. als dielektrische Trennschicht ca. 200 μm dicke Glasstege verwendet,
deren Fläche
in etwa der Elektrodenfläche
entspricht.
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Die
Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese
zeigt in:
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1 in
vergrößertem Maßstab eine
Prinzipdarstellung einer Vorrichtung nach dem Stand der Technik
und
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2 ebenfalls
in vergrößertem Maßstab eine
Prinzipdarstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Eine
bekannte miniaturisierte Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches
und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher
trägerfreier
Elektrophorese ist in 1 allgemein mit 1 bezeichnet.
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Die
Vorrichtung 1 weist eine miniaturisierte Separationskammer 2 auf
mit Außenabmessungen von
beispielsweise 4 mm × 12
mm. Die Separationskammer 2 ist unterseitig mit einer nicht
dargestellten Bodenplatte und oberseitig mit einer ebenfalls nicht dargestellten
Deckplatte versehen.
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Am
Eingang der Separationskammer 2 der Vorrichtung 1 sind
ein Probenreservoir 3 und ein Pufferreservoir 4 vorgesehen,
welches über
Zuführkanäle 5 mit
der Separationskammer 2 verbunden ist.
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Am
in Hauptströmungsrichtung 6 gesehen anderen
Ende der Separationskammer 2 sind Fraktionierungskanäle 7 vorgesehen.
Zu beiden Seiten der Separationskammer 2 ist jeweils ein
Elektrolytreservoir 8, 9 mit jeweils einer Elektrode
angeordnet, welches jeweils mit kapillarförmigen Verbindungskanälen 10 mit
der Separationskammer 2 verbunden ist, die als Stromschlüssel (Ionenbrücke) dienen
und vermeiden, dass in den Elektrolytreservoirs 8, 9 gebildete
Gasblasen in den Bereich der Separationskammer 2 gelangen
und dort die Messung verfälschen
können.
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Die
Verbindungskanäle 10 zwischen
den Elektrodenreservoirs 8, 9 und der Separationskammer 2 stellen
jedoch hohe elektrische Widerstände dar, über die
ein großer
Spannungsabfall zu messen ist. Um z.B. eine Potentialdifferenz quer
zur Hauptflussrichtung 6 in der Separationskammer 2 von
300 v zu erzeugen, muss an den beiden Elektroden der Elektrolytreservoirs 8, 9 eine
Spannung von etwa 3.000 V angelegt werden.
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Um
die Notwendigkeit derart hoher Spannungen zu vermeiden, wird gemäß 2 eine
allgemein mit 11 bezeichnete erfindungsgemäße Vorrichtung
vorgeschlagen. Diese Vorrichtung 11 ist hinsichtlich der
eigentlichen Separationskammer genauso aufgebaut wie die Vorrichtung
nach 1, sie weist eine Separationskammer 12 auf
mit Außenabmessungen
von beispielsweise 4 mm × 12
mm. Die Separationskammer 12 ist unter- und oberseitig
mit einer nicht dargestellten Boden- bzw. Deckplatte versehen. Am
Eingang der Separationskammer 12 ist ein Probenreservoir 13 und
ein Pufferreservoir 14 vorgesehen, welches über Zuführungskanäle 15 mit der
Separationskammer 12 verbunden ist.
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Am
in Hauptströmungsrichtung 16 gesehen anderen
Ende der Separationskammer 12 sind Fraktionierungskanäle 17 vorgesehen.
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Wesentlich
ist nun, dass an beiden Seiten der Separationskammer 12 zwei
Elektroden 18, 19 angeordnet sind, welche jeweils
durch eine dielektrische Trennschicht von der Separationskammer 12 getrennt
sind. Diese dielektrische Trennschicht ist beim Ausführungsbeispiel
jeweils bevorzugt von einem beispielsweise 200 μm dicken Glassteg 20 gebildet.
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Dabei
befinden sich die Elektroden 18, 19 in der gleichen
Ebene wie die Separationskammer 12. Beim Anlegen einer
Spannung zwischen den beiden Elektroden 18, 19 werden
mittels dielektrischer Verschiebung an den der Separationskammer 12 zugewandten
Oberflächen
der dielektrischen Trennschichten (Glasstege 20) Ladungen
gleicher Vorzeichen aufgebaut.
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Mit
dieser Vorrichtung kann somit ein elektrisches Feld für die Elektrophorese
erzeugt werden, ohne dass eine elektrolytische Gasentwicklung in
der Separationskammer stattfindet. Dabei kann auf die Integration
von Stromschlüsselelementen
(Verbindungskanälen 10)
verzichtet werden, so dass diese elektrischen Widerstände entfallen
und zwischen den Elektroden 18, 19 nur eine Spannung
von beispielsweise 300 V benötigt
wird.
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Natürlich ist
die Erfindung nicht auf das dargestellte Ausführungsbeispiel beschränkt, weitere Ausgestaltungen
sind möglich,
ohne den Grundgedanken zu verlassen. So reicht es grundsätzlich auch aus,
nur zwischen einer Elektrode 18, 19 und der Separationskammer 12 eine
dielektrische Trennschicht 20 vorzusehen. Ferner kann die
vorbeschriebene Vorrichtung auch für die Kapillarelektrophorese
verwendet werden.