DE102004025362A1 - Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 - Google Patents

Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 Download PDF

Info

Publication number
DE102004025362A1
DE102004025362A1 DE200410025362 DE102004025362A DE102004025362A1 DE 102004025362 A1 DE102004025362 A1 DE 102004025362A1 DE 200410025362 DE200410025362 DE 200410025362 DE 102004025362 A DE102004025362 A DE 102004025362A DE 102004025362 A1 DE102004025362 A1 DE 102004025362A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
tak1
protein
fragment
inhibitor
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE200410025362
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland GmbH filed Critical Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority to DE200410025362 priority Critical patent/DE102004025362A1/de
Publication of DE102004025362A1 publication Critical patent/DE102004025362A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines TGFbeta-aktivierten-Kinase-1-(TAK1)-Proteins, eines funktionellen Derivats oder Fragments davon oder einer für das Protein, Derivat oder Fragment codierenden Nikleinsäure zur Indentifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund aktiven Substanzen. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Identifizierung der Substanzen und die Verwendung eines Inhibitors gegen TAK1 als Arzneimittel.

Description

  • Die folgende Erfindung betrifft die Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 (TAK1) zur Identifizierung pharmazeutischer Substanzen. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Identifizierung der Substanzen und die Verwendung eines Inhibitors gegen TAK1 als Arzneimittel.
  • Bei der Osteoporose (OP) handelt es sich um eine generalisierte progressive Reduzierung der Knochendichte (Knochenmasse pro Volumeneinheit), wodurch eine Schwächung des Skeletts verursacht wird, obwohl das Verhältnis von Mineralien zu organischen Elementen unverändert ist. Somit ist die Nettogeschwindigkeit der Knochenresorption größer als die Knochenbildungsgeschwindigkeit, was zu einer Abnahme der Knochenmasse ohne einen Defekt in der Knochenmineralisierung führt. Im Jahre 2003 sind etwa 8 Millionen Frauen und 2 Millionen Männer in den USA von OP betroffen. Die hauptsächlichen klinischen Anzeichen für Osteoporose sind chronische Schmerzen verursachende Knochenfrakturen. Bis zum Alter von etwa 30 Jahren wird mehr Knochen gebildet als abgebaut; danach überholt der Abbau langsam die Knochenbildung, was zu einer Abnahme der Knochendichte führt. Ist der Körper nicht dazu in der Lage, die Knochenbildung auf einem ausreichenden Niveau zu halten, so verlieren die Knochen weiterhin an Dichte und werden zunehmend brüchig, was schließlich zu Osteoporose führt. Aufgrund der verminderten Knochendichte können OP-Patienten Frakturen ohne oder nur mit geringem Trauma erleiden. Aufgrund des Älterwerdens der Bevölkerung sieht man sich einer ständig steigenden Zahl an OP-Patienten gegenüber, deren Lebensqualität stark beeinträchtigt ist. Darüber hinaus bringt OP eine enorme sozioökonomische Last mit hohen direkten und indirekten Kosten mit sich.
  • Somit besteht ein großer Bedarf an neuen pharmazeutischen Substanzen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von OP.
  • Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mittel zur Identifizierung von bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen bereitzustellen.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch Verwendung eines TAK1-Proteins, eines funktionellen Derivats oder Fragments davon oder einer für das Protein, Derivat oder Fragment codierenden Nukleinsäure zur Identifzierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf überraschenden erfindungsgemäßen Ergebnissen, mit denen erstmals Beweise für die Beteiligung der durch den transformierenden Wachstumsfaktor (transforming growth factor, TGF)-Beta aktivierten Kinase 1 (TAK1) an den dem Knochenschwund zugrundeliegenden krankhaften Vorgängen, vor allem Osteoarthrose (OP),. vorgelegt werden. Bisher lagen noch keine Kenntnisse über eine mögliche Beteiligung von TAK1 an OP vor.
  • Bei der durch Tumorwachstumsfaktor aktivierten Kinase (TAK) 1 handelt es sich um ein Mitglied der Familie der MAPK-Kinase-Kinasen. Sie wird durch verschiedene Cytokine aktiviert, einschließlich IL1β, IL18, TNF und RANKL (Rezeptor-Aktivator des NFkB-Liganden) (Ninomiya-Tsuji, J. et al., Nature 1999; Irie, T. et al., FEBS Lett. 2000; Wald, D. et al., Eur. J. Immunol. 2001; Mizukami, J. et al., Mol. Cell. Biol., 2002). Nach Bindung von IL1β an IL1RI bilden MyD88, ITAK1 (IL1-Rezeptorassoziierte Kinase) sowie TRAF (TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor) einen Komplex. TAB (TAK1-Bindungsprotein) 2 bindet an diesen Komplex und rekrutiert TAK1 und TAB (TAK1-Bindungsprotein) 1 (Mizukami, J. et al., Mol. Cell. Biol., 2002; Takaesu, G. et al., Mol Cell., 2000; Takaesu, G. et al. Mol. Cell. Biol., 2001). Tab1 ist wichtig für die Aktivierung der TAK1 (Shibuya, H. et al., 1996). TAK1 phosphoryliert und aktiviert MKK3, MKK4, MKK6 und MKK7 MAPKK, durch die wiederum JNK und p38 aktiviert werden können (Moriguchi, T. et al., J. Biol. Chem. 1996; ShiTAK1abe, K. et al., J. Biol. Chem. 1997; Yamaguchi, T. et al.; Science 1995), wobei TAK1 ebenfalls IKKs (Inhibitor der kB-Kinase) aktiviert (Ninomiya-Tsuji, J. et al., Nature 1999). Somit reguliert TAK1 die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren über die Regulierung der Aktivität von MAPK JNK, p38 und IKK.
  • Die Sequenz des menschlichen TAK1-Gens ist im Stand der Technik bekannt. Dabei kennt man vier Isoformen der codierenden Sequenz. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung kann sich TAK1 sowohl auf die eine als auch auf die andere Isoform beziehen. Die codierenden Polynukleotidsequenzen der Isoformen stehen unter den folgenden Eingangsnummern bei der NCBI-Nukleotiddatenbank zur Verfügung: NM_003188 (Isoform A; Sequenz-ID Nr.1), NM_145331 (TAK1-Isoform B; SequenzID Nr.2), NM_145332 (TAK1-Isoform C; Sequenz-ID Nr.3), NM_145333 (TAK1-Isoform D; Sequenz-ID Nr.4). Die Proteinsequenzen stehen unter den folgenden Eingangsnummern bei der NCBI-Nukleotiddatenbank zur Verfügung: NP_003179 (Isoform A; Sequez-ID Nr.5), NP_663304 (TAK1-Isoform B; Sequenz-ID Nr.6), NP_663305 (TAK1-Isoform C; Sequenz ID Nr.7), NP_663306 (TAK1-Isoform D; Sequenz-ID Nr.8). NCBI ist das National Center for Biotechnology Information (Postanschrift: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; Internetadresse:
    www.ncbi.nhm.nih.gov). Die Klonierung des menschlichen TAK1-Gens wird von Kondo, M., et al., Int. J. Cancer (1998) beschrieben.
  • Beim Knochenumbau muß ein Gleichgewicht zwischen den Aktivitäten der Osteoblasten (den knochenbildenden Zellen) und der Osteoklasten (multinukleäre Riesenzellen, deren physiologische Rolle in der Knochenresorption besteht) eingehalten werden, um die Skelett- und Calcium-Homöostase aufrechtzuerhalten. Ein Ungleichgewicht zwischen Knochenbildung und Resorption führt zu einem Netto-Knochenschwund und somit zu Osteoporose.
  • Bei TNF handelt es sich um ein Skelettabbau-Agens, das die Osteoklastogenese bei gleichzeitiger Hemmung der Osteoblastenfunktion stimuliert. TNFa wird zusammen mit RANKL zur Stimulierung der Osteoklastogenese benötigt (Übersichtsartikel von Nanes, 2003). TNF stimuliert ebenso Osteoblasten, und zwar in einer Weise, durch die ihre knochenbildende Wirkung behindert wird. TNF unterdrückt die Rekrutierung von Osteoblasten aus Vorläuferzellen, hemmt die Expression von Matrixprotein-Genen und stimuliert die Expression von Osteoklastogenese verstärkenden Genen. Bei TNFR1 handelt es sich um die funktionelle Form des TNF-Rezeptors sowohl in Osteoblasten als auch in Osteoklasten. Sowohl aus Abu-Amer (2000) et al. als auch aus Roggia (2001) et al. ist bekannt, daß TNF die Osteoklastogenese in Mäusen mit TNFR1-Rezeptor-Knockout (R1-/-) nicht stimulieren kann. Die TNFa-Signalisierung wird von TRAFs vermittelt.
  • Bei RANKL und seinen Rezeptor RANK handelt es sich um die Hauptregulatoren der Osteoklastenentwicklung, wobei eine Hemmung der RANKL-Funktion den Knochenschwund bei der postmenopausalen Osteoporose verhindert (Übersichtsartikel von Nakashima et al., 2003). TRAF 6, der durch den Rezeptor-Aktivator von NFkB (RANK) aktiviert wird, stimuliert die Osteoklastogenese (Galibert et al., 1998, Darnay et al., 1999 und Kaji et al., 2001). RANKL aktiviert AP1 und NFkB.
  • IL-1 kann ebenfalls die Osteoklastogenese stimulieren, wobei die Stimulierung der Osteoklastogenese ebenso eine Assoziierung von TRAF6 mit dem IL1R erfordert [Cao et al., 1996].
  • Es konnte gezeigt werden, daß zusätzlich zu NFkB-Aktivierung das TRAFs-Signal über Jun-Kinase (JNK), p38-Kinase sowie Inhibitoren der p38-MAP-Kinase (MAPK) die Stimulierung der Osteoklastogenese durch TNF verringern [Kumar et al., 20011. Desweiteren deuteten Untersuchungen darauf hin, daß IL-1 in Osteoblasten, Fibroblasten und Chondrozyten die Synthese von Kollagenase-1 und -3, den für den Abbau von Typ-I-Kollagen hauptsächlich verantwortlichen Kollagenasen, stimuliert.
  • Bei TAK1 (Tumorwachstumsfaktor-aktivierte Kinase 1) handelt es sich um eine MAP3K (mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase-Kinase), die von verschiedenen Zytokinen, wie z.B. TNF (Tumornekrosefaktor), RANKL (Rezeptor des aktivierten NFkB-Liganden) und IL (Interleukin)-1, aktiviert wird und die Aktivität der MAPKs p38 und JNK sowie des Transkriptionsfaktors und NFkB reguliert. Durch TAK1-Gensuppression in der menschlichen Chondrosarkom-Zelllinie SW1353 wurde von den Erfindern überraschend festgestellt, daß es sich bei TAK1 um einen wichtigen Vermittler der IL-1-stimulierten Gensuppression, z.B. der IL-1-induzierten Expression von Kollagenase 3 und TNF, handelt. Durch dieses Ergebnis wird zum ersten Mal gezeigt, daß TAK1-Hemmung den Einfluß proinflammatorischer Zytokine auf die Zelle verringert.
  • TNF, RANKL und IL1 aktivieren TRAF. TRAF aktivieren NFkB und p38 und JNK durch Rekrutierung von TAK1 über TAB2 (TAK1-Bindungsprotein 2). TAK1 reguliert p38-, JNK- und NFkB-Aktivitiät. Die Aktivierung von p38, JNK und NFkB führt zur Expression von matrixabbauenden Enzymen, wie z.B. Kollagenase 3, wobei die Hemmung von p38 die TNF-stimulierte Osteoklastogenese reduziert. Somit verspricht die Hemmung der TAK1 eine Verringerung der Knochenresorption durch Reduktion der Osteoklastogenese und Expression proteolytischer Enzyme.
  • Es ist weiterhin bekannt, daß Prostaglandine an der Regulation des Knochenumsatzes beteiligt sind. Die Produktion von mit Knochenschwund im Zusammenhang stehenden Prostaglandinen wird vorwiegend über den COX-2 Weg vermittelt. COX2 wird durch IL-1 und TNF stimuliert.
  • Erfindungsgemäß stellte sich überraschend heraus, daß die TAK1-Gensuppression die IL-1-Signalweiterleitung hemmt sowie die TNF-Freisetzung reduziert. Somit würde eine Hemmung der TAK1 die COX2-vermittelte Prostaglandinsynthese reduzieren und läßt sich somit zur Verringerung z.B. des Prostaglandin-assoziierten Knochenschwunds einsetzen.
  • Die überraschenden erfindungsgemäßen Ergebnisse zeigen die Relevanz der TAK1 bei der Vermittlung extrazellulärer Signale, die durch proinflammatorische Zytokine, insbesondere IL1, induziert werden, was zur Aktivierung von AP1 und NFkB, zur Induktion von MMPs, wie z.B. Kollagenase 3, und Zytokinen, wie z.B. TNF, führt. Somit darf erwartet werden, daß Inhibitoren der TAK1 den pathologischen Einfluß von IL-1, TNF und RANKL auf den Knochen bei Knochenschwund, vor allem Osteoporose, verringern.
  • Zu den Molekülen, auf die zur Zeit zur Hemmung der Knochenresorption abgezielt wird, gehören das OPG/RANKL/RANK-System, Cathepsin-K-Inhibitoren, Vitronectinrezeptor-Antagonisten, Östren, das Interleukin-6 und gp-130-System, Zytokine sowie Wachstumsfaktoren.
  • Ein TAK1-Inhibitor könnte zahlreiche bei dem Krankheitsbild der Osteoporose auftretende Effekte reduzieren. Eine Hemmung der TAK1 würde die Knochenresorption über eine Hemmung der durch RANKL, TNF und IL-1 stimulierten Osteoklastogenese reduzieren. Weiterhin würde eine Hemmung der TAK1 den Prostaglandin-assoziierten Knochenschwund reduzieren. Und die Hemmung der TAK1 würde den Abbau der Matrix und die Chronizität über eine Reduzierung der durch IL-1, TNF und RANKL induzierten Exrpession von proteolytischen Enzymen und proinflammatorischen Zytokinen reduzieren. Da TNF knochenbildende Vorgänge behindert, würde die Hemmung der TAK1 weiterhin knochenbildende Vorgänge der Osteoblasten verstärken. Zudem würde die Hemmung der TAK1 aufgrund der Wirkung von TAK1 auf COX2 die Schmerzen im Zusammenhang mit Osteoporose verringern.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck Behandlung eine entweder gegen die Ursachen oder die Symptome oder sowohl die Ursachen als auch die Symptome gerichtete Maßnahme. Die Behandlung kann entweder zu einer (vollständigen oder teilweisen) Rückbildung der Krankheit führen oder ihr Fortschreiten verhindern oder verzögern.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Knochenschwund um alle Vorgänge, bei denen die Knochendichte abnimmt, oder alle Zustände, bei denen die Knochendichte unterhalb des normalen Durchschnitts liegt. Ein bevorzugtes Beispiel des Knochenschwunds ist die Osteoporose.
  • Zwei Hauptarten der OP können unterschieden werden: die primäre OP, die spontan auftritt (in Form der postmenopausalen, senilen oder idiopathischen OP) und die sekundäre OP, die durch eine andere Krankheit (z.B. chronische Niereninsuffizienz, Hormonstörungen) oder die Einnahme von Arzneistoffen (z.B. Kortikosteroiden, Barbituraten, Antikonvulsiva) verursacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck OP sämtliche der obigen OP-Arten.
  • Bei einem TAK1-Fragment kann es sich um ein beliebiges Polypeptid oder Polynukleotid handeln, das kürzer als der entsprechende Wildtyp ist, z.B kürzer als die TAK1 aus Homo Sapiens (hs) gemäß einer der Sequenzen unter den Zugangsnummern NP_003179 (SEQ ID Nr.5), NP_663304 (SEQ ID No. 6), NP_663305 (SEQ ID No.7, NP_663306 (SEQ ID No. 8) bzw. kürzer als ein Polynukleotid gemäß einer der folgenden Zugangsnummern: NM 003188 (Isoform A; Sequenz-ID Nr.1), NM_145331 (TAK1-Isoform B; Sequenz-ID Nr. 2), NM_145332 (TAK1-Isoform C; Sequenz-ID Nr.3), NM_145333 (TAK1-Isoform D; Sequenz-ID Nr.4).
  • Bei einem funktionellen TAK1-Fragment kann es sich um ein beliebiges Fragment (entweder Polypeptid oder Polynukleotid) handeln, das zumindest dazu in der Lage ist, den Phosphorylierungszustand eines Substrats (vorzugsweise eines TAK1-Substrats) zu modulieren und besonders bevorzugt noch wenigstens eine, vorzugsweise mehr als eine und ganz besonders bevorzugt alle funktionellen Eigenschaften des Vollängen-Enzyms aufweist (siehe oben und unten). In bezug auf ein Polynukleotidfragment bedeutet dies, daß das von dem Polynukleotidfragment codierte Polypeptid die obigen Eigenschaften aufweist. Bevorzugte Beispiele funktioneller TAK1-Fragmente umfassen oder bestehen aus der Kinasedomäne (siehe z.B. Dempsey, C.E., et al., Biochim. Biophys. Acta. 2000). Noch stärker bevorzugt ist ein funktionelles Fragment, das ein Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No.9 oder ein für das Polypeptid codierendes Polynukleotid umfaßt oder daraus besteht.
  • Der Ausdruck "funktionelles Derivat" der TAK1 umfaßt alle Arten der Modifikation von TAK1 in bezug auf die natürlich vorkommende Form (entweder Polypeptid oder Polynukleotid), die zumindest dazu in der Lage sind, den Phosphorylierungszustand eines Substrats zu modulieren und bevorzugt noch wenigstens eine, vorzugsweise mehr als eine und ganz besonders bevorzugt alle funktionellen Eigenschaften des Vollängen-Enzyms aufweisen (siehe oben und unten). In bezug auf ein Polynukleotidfragment bedeutet dies, daß das von dem Polynukleotidfragment codierte Polypeptid die obigen Eigenschaften aufweist. Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso funktionelle Derivate von TAK1-Fragmenten.
  • In der folgenden Liste, die nicht als limitierend zu verstehen ist, sind verschiedene Funktionen der TAK1 aufgeführt: Autophosphorylierung, Phosphorylierung und Aktivierung von MKK3, MKK4, MKK6 und MKK7 MAPKK; Aktivierung des IKKs-Inhibitors der kB-Kinase; Regulation verschiedener Transkriptionsfaktoren über die Regulierung der Aktivität der MAPK JNK, p38 und IKK (siehe auch oben); die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit bestimmten Polypeptiden, beispielsweise einem der obenerwähnten, gehört ebenso zu den Funktionen der TAK1.
  • Testverfahren zur Analyse der Proteinaktivität sind im Stand der Technik allgemein bekannt, z.B. Messung der Phosphorylierungsaktivität, der Wechselwirkung mit gewissen Zielpolypeptiden oder Fragmenten davon oder der Fähigkeit der TAK1, die obigen Polypeptide zu aktivieren oder die durch die obigen Transkriptionsfaktoren regulierte Transkription zu modulieren, über Standardverfahren.
  • Das überraschende Ergebnis der funktionellen Beteiligung der TAK1 an bei der OP stattfindenden degenerativen Prozessen gestattet das Auffinden aktiver Substanzen zur Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund, vor allem OP, indem die Wirkung potentieller aktiver Substanzen auf die Aktivität und/oder das "Steady State"-Niveau der TAK1 mittels Standardtestverfahren getestet wird. Die ursächliche Beteiligung der TAK1 an degenerativen Prozessen im Knochen ermöglicht erstmals die Durchführung eines spezifischen Screening auf aktive Substanzen für die kausale und nicht nur symptomatische Therapie von Knochenschwund.
  • Somit betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen, bei dem man:
    • a. ein TAK1-Polypeptid mit einem putativen Antagonisten/Inhibitor in Kontakt bringt; und
    • b. bestimmt, ob der putative Antagonist/Inhibitor die Aktivität des TAK1-Polypeptids hemmt.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen, bei dem man
    • a. eine für ein TAK1-Protein, ein Derivat oder Fragment davon codierende Nukleinsäure mit einer Substanz in einem transkriptionsaktiven System in Kontakt bringt;
    • b. die in dem System in Gegenwart der Substanz produzierte Menge an für das TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment codierender mRNA bestimmt;
    • c. die in dem System in Abwesenheit der Substanz produzierte Menge an für das TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment codierender mRNA bestimmt;
    • d. bestimmt, ob die Substanz zur Reduzierung der in dem System produzierten Menge an TAK1-mRNA fähig ist.
  • Bei einem transkriptionsaktiven System handelt es sich um ein beliebiges System (z.B. biochemisch oder zellulär), das zur Transkription eines gegebenen Gens oder geeigneten Vektors fähig ist; Beispiele solcher Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
  • Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen, bei dem man
    • a. eine für ein TAK1-Protein, ein Derivat oder Fragment davon codierende Nukleinsäure mit einer Substanz in einem transkriptionsaktiven System in Kontakt bringt;
    • b. die in dem System in Gegenwart der Substanz produzierte Menge an TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment bestimmt;
    • c. die in dem System in Abwesenheit der Substanz produzierte Menge an TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment bestimmt;
    • d. bestimmt, ob die Substanz zur Reduzierung der in dem System produzierten Menge an TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment fähig ist.
  • Bei einem translationsaktiven System handelt es sich um ein beliebiges System (z.B. biochemisch oder zellulär), das zur Translation eines gegebenen Gens oder geeigneten Vektors fähig ist; Beispiele solcher Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
  • Die Beobachtung, ob die TAK1-Aktivität in Gegenwart einer potentiell aktiven Substanz verglichen mit der TAK1-Aktivität in Abwesenheit der Substanz abnimmt, läßt sich gemäß analytischen Standardverfahren durchführen. Zu diesen gehören beispielsweise Verfahren, die die Fähigkeit der TAK1 zur Autophosphorylierung und zur Phosphorylierung natürlich vorkommender oder synthetischer (z.B. synthetischer Peptide, Fragmente oder Derivate natürlich vorkommender Substrate) TAK1-Substrate aufzeigen. Zu den bevorzugten Substraten gehören MEK3, MEK4, MEK6, MEK7 und IKK, ebenso wie generische Substrate, wie z.B. das auf Myelin basierende Protein (MBP). Ein weiterer Aspekt ist die Fähigkeit der TAK1 zur Modulation der Transkription verschiedener Zielgene, indem die Aktivität gewisser Transkriptionsfaktoren moduliert wird. Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Identifizierung der Substanzen in Gegenwart eines oder mehrerer Aktivatoren der TAK1 durchgeführt (d.h. eines der erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt die Verwendung eines oder mehrerer (entweder natürlich vorkommender, siehe oben, oder synthetischer) TAK1-Aktivatoren zumindest für eine beschränkte Zeitdauer oder in wenigstens einem der Verfahrensschritte).
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung betrifft die TAK1-Aktivität alle Funktionen der TAK1; dabei kann es sich entweder um eine vollständige oder eine teilweise (d.h. eine Abnahme, die ausreicht, einen gewünschten therapeutischen Effekt herbeizuführen) Hemmung dieser Funktionen durch potentielle aktive Substanzen handeln, wobei die Funktionen durch potentiell aktive Substanzen auf allen die TAK1-Proteinfunktion beeinflussenden Ebenen gehemmt werden können (z.B. durch direkte Wechselwirkung mit der Kinasendomäne; Modulation der die TAK1-Aktivität beeinflussenden posttranslationalen Modifikation; Modulation der Faltung des TAK1- Proteins; Modulation der Funktion natürlicher Inhibitoren (positiv) oder Aktivatoren (negativ) der TAK1, usw.).
  • Die Menge an TAK1 betrifft das Steady-State-Niveau der TAK1, vorzugsweise aktiven TAK1, in einem gegebenen System, z.B. in einer Zelle oder einer biochemischen Probe, zu einer gegebenen Zeit. Die TAK1-Menge kann auf einer beliebigen Ebene der TAK1-Expression oder des TAK1-Abbaus moduliert werden (z.B. Transkription einschließlich Transkript-Prozessierung und -export aus dem Nukleus, Translation, die Proteinstabilität beeinflussende posttranslationale Modifikation, usw.).
  • Geeignete analytische Verfahren oder analytische Systeme, sogenannte Assays, die zur Messung der Aktivität oder Konzentration definierter Zielmoleküle (sogenannter "Targets", hauptsächlich Proteine oder Nukleinsäuren) als Parameter für die Wirksamkeit einer potentiellen pharmazeutischen Verbindung verwendet werden, sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Bei den Assays kann es sich beispielsweise um biochemische Analyseverfahren oder um Systeme mit isolierten oder teilweise isolierten Bestandteilen, die zu einem Reaktionsgemisch räumlich und zeitlich definiert zusammengegeben werden, handeln, in denen sich die Wirksamkeit der potentiellen pharmazeutischen Verbindungen testen läßt. Assays umfassen weiterhin beispielsweise biochemische Analyseverfahren oder Systeme, in denen sich die Aktivität des Zielmoleküls sowie die Wirksamkeit eines Potentials zur Beeinflussung dieser Aktivität in einer Zelle bestimmen lassen.
  • Bei einem Assay handelt es sich um eine beliebige Art eines Analyseverfahrens oder Systems zur Überwachung eines biologischen Vorgangs. Geeigneterweise werden molekulare Kaskaden und Mechanismen, die Teile physiologischer Stoffwechselwege, aber auch krankhafter Zustände, darstellen, in zellulären oder biochemischen (In-Vitro-)Systemen reproduziert. Die pharmakologische Aktivität einer potentiellen pharmazeutischen Verbindung läßt sich somit gemäß ihrer Fähigkeit zur Störung oder Modulation dieser Kaskaden oder Mechanismen bestimmen.
  • Zur Verwendung beim Arzneistoff-Screening, insbesondere dem Screening mit hohem Durchsatz nach neuen pharmazeutischen Verbindungen, ist der Assay vorzugsweise reproduzierbar und vorzugsweise ebenfalls skalierbar und robust. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Screen mit hohem Durchsatz, daß ein erfindungsgemäßes Verfahren in einem sehr kleinen Maßstab durchgeführt wird, z.B. auf 96-, 386- oder 1536-Loch-Platten in Proben mit sehr kleinem Volumen im Bereich von wenigen Millilitern bis zu wenigen Nanolitern oder noch weniger. Somit läßt sich eine sehr hohe Anzahl an Proben innerhalb kurzer Zeit analysieren.
  • Das Screening mit hohem Durchsatz umfaßt hauptsächlich das Screening von beispielsweise ungefähr 500.000 verschiedenen Verbindungen auf eine gewünschte Fähigkeit mittels eines einzigen Assays. Vorzugsweise ist der Assay zum Hochdurchsatz-Screening chemischer Substanzen auf ihre Fähigkeit zur Modulation der Aktivität des zu untersuchenden Zielmoleküls geeignet. Die Art des Assays hängt beispielsweise von der Art des verwendeten Zielmoleküls (z.B. Polypeptid oder Polynukleotid) sowie dem „Read Out" ab, d.h. dem Parameter, gemäß dem die Aktivität des Zielmoleküls bestimmt wird (siehe unten).
  • Unterschiedliche Arten solcher Assays sind im Stand der Technik allgemein bekannt und kommerziell von kommerziellen Zulieferfirmen erhältlich.
  • Mit den Assays sollten vorzugsweise die folgenden Fragen angegangen werden: (1) Kann eine Verbindung die Aktivität der Kinase in einem homogenen Assay blockieren oder hemmen? (2) Ist die Verbindung hinreichend selektiv bei der Blockierung der Signalisierung des gewünschten Zielmoleküls? (3) Übt die Verbindung die gewünschte biologische Wirkung auf eine lebende Zelle aus? Um diese Fragestellung anzugehen, existieren verschiedene Techniken, einschließlich „Scintillation Proximity Assay" (SPA, FlashPlate), Filtration, homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (TR-FRET), Fluoreszenzpolarisierung (FP), Elektrochemilumineszenz (ECL), ALPHAScreen (AS) und DELFIA.
  • Geeignete Assays für unterschiedliche Zwecke umfassen Radioisotopen- oder Fluoreszenz-Assys, beispielsweise Fluoreszenzpolarisationsassays (wie z.B. die von Panvera kommerziell angebotenen) oder Packard BioScience (HTRF; ALPHAScreenTM) zur Messung der Wechselwirkung eines markierten Mitglieds mit einem nichtmarkierten Mitglied (z.B. der Wechselwirkung markierter Proteinrezeptoren mit ihren nichtmarkierten Liganden).
  • Zur Bestimung der Proteinphosphorylierung, z.B. Kinaseaktivität, eignen sich Fluoreszenzpolarisationsassays, die beispielsweise kommerziell von Panvera erhältlich sind; angewendet werden können außerdem HTRF („Homogeneous Time Resolved Fluorescence, Cis Bio), LANCE-Assays (Perkin Elmer Life Science) oder der Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay (ALPHAScreenTM von Packard BioScience).
  • Für den Nachweis der Kinase/Phosphotase-Aktivität existieren mehrere Readouts. Im folgenden ist eine (nicht als limitierend zu verstehende) Liste der Kinase-Asssays angegeben, mit denen die Menge an in einem Substrat eingebautem Phosphat quantitativ nachgewiesen wird:
    ISOTOPEN-READOUT: Für einen radioaktiven Readout werden üblicherweise zwei Technologien verwendet: der Scintillation Proximity Assay (SPA) und der FlashPlate-Assay. In diesen Assays werden üblicherweise Biotin/Avidin-Wechselwirkungen zum Einfangen der radioaktiv markierten Substrate ausgenutzt (gelegentlich werden Protein-G- oder Protein-A-Platten verwendet). Der Reaktionsansatz enthält die Kinase, ein biotinyliertes Peptidsubstrat sowie Gamma-[33P]ATP. Nach der Reaktion werden die biotinylierten Peptide durch Streptavidin eingefangen. Beim Scintillation Proximity-Nachweis wird Streptavidin auf Szintillator-haltigen Kügelchen gebunden, während bei der FlashPlate-Technologie das Streptavidin an die Lochinnenseite von Szintillator-haltigen Mikroplatten gebunden wird. Sobald das radioaktiv markierte Substrat immobilisiert ist, ist der Abstand zum Szintillator gering genug, um die Lichtemission zu stimulieren.
  • Von verschiedenen Firmen, einschließlich Sigma, Oncogene Research Products und Pierce (Rockford, III, USA) werden auf ELISA beruhende Kits angeboten. In diesen Kits werden Zufallspeptide eingesetzt, die sich mit einer großen Vielfalt von Kinasen phosphorylieren lassen. PK-haltige Proben werden in einen Reaktionspuffer mit ATP und die benötigten Kationen verdünnt und dann in die Plattenlöcher gegeben. Die Reaktionen werden beendet, indem man einfach die Ansätze entfernt und danach die Platten wäscht.
  • Bei DELFIA (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoro Immuno Assays) handelt es sich um einen Festphasen-Assay mit Waschschritten. Der Antikörper wird mit Europium (oder möglicherweise mit einer anderen Lanthanidmarkierung) markiert. Diese Markierung besitzt zwei einzigartige und wichtige Merkmale, die eine hohe Empfindlichkeit garantieren: (1) eine außergewöhnlich große Stokes'sche Verschiebung, d.h. den Unterschied zwischen Exitations- und Emissionswellenlängen, und (2) eine sehr lange Fluoreszenzhalbwertszeit. Dieses letztere Merkmal erlaubt den Nachweis der Europium-Fluoreszenz in einem zeitkontrollierten Modus: und zwar zu einem Zeitpunkt, wenn die Hintergrundfluoreszenz vollkommen verschwunden ist. Diese Unterscheidung zwischen gebundenem und nichtgebundenem Europium wird durch die Waschschritte erreicht. Nach dem Waschen wird eine „Verstärker"-Lösung zugegeben, durch die das Lanthanidchelat dissoziiert und ein neues hochfluoreszierendes Chelat in einer schützenden Mizelle eingefangen wird. Für auf DELFIA beruhende Kinaseassays stehen Europium-markierte Antikörper gegen (P)-Tyr, (P)-Thr, (P)-Thr-Prolin und (P)-Ser von Perkin Elmer und Packard zur Verfügung. Darüber hinaus wird ein interessanter Satz markierter „Tag"-Antikörper (his-tag, myc-tag, GST usw.) angeboten.
  • Bei der Fluoreszenzpolarisation (FP) wird polarisiertes Licht zur Anregung fluoreszierender Substratpeptide in Lösung verwendet. Diese frei in Lösung vorliegenden Fluoreszenzpeptide werden darin verwirbelt, wodurch das emittierte Licht depolarisiert wird. Bindet das Substratpeptid an ein größeres Molekül, wie z.B. (P)-Tyr, so nimmt seine Verwirbelungsgeschwindigkeit stark ab und das emittierte Licht bleibt hochpolarisiert. Zur Durchführung eines FP-Kinase-Assays gibt es zwei Möglichkeiten:
    Ein fluoreszierender Phosphopeptid-„Tracer" wird an einen (P)-spezifischen Antikörper gebunden. Die Proteinphosphorylierungsprodukte verdrängen das fluoreszierende Phosphopeptid vom Antikörper. Dadurch wird eine Veränderung der Polarisation von hoch zu niedrig herbeigeführt. Dieser Ansatz besitzt den Vorteil, daß die Phosphorylierung von Substraten >30kD ebenfalls beurteilt werden kann. Direkter Nachweis der Phosphorylierung eines fluoreszenzmarkierten Substratpeptids. Das phosphorylierte Substratpeptid bindet an den phosphospezifischen Antikörper. Dabei verschiebt sich als Ergebnis die Polarisation von niedrig zu hoch.
  • Zeitaufgelöster Fluoreszenzresonanzenergietransfer (TR-FRET):
  • Bei diesem Assay wird der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zwischen Europium und APC, einem modifizierten Allophycocyanin, ausgenutzt. Nach Anregung des Europiums mit Licht bei 337 nm fluoresziert das Molekül bei 620 nm. Ist jedoch der Abstand zwischen diesem Fluorophor und APC gering genug, so überträgt das Europium seine Anregungsenergie auf APC, das bei 665 nm fluoresziert. Bei dem PK-Substrat handelt es sich üblicherweise um ein synthetisches, biotinmarkiertes Substrat. Nach der Kinasereaktion wird ein Europium-markierter (P)-spezifischer Antikörper zusammen mit Streptavidin-APC zugegeben. Durch das phosphorylierte Peptid werden der Europium-markierte Antikörper und das Streptavidin-APC in engen Kontakt gebracht. Die enge Nachbarschaft zwischen dem APC und dem Europium-Fluorophor (typischerweise weniger als 10 nm) führt zu einem Quenchen der Europium-Fluoreszenz zum Vorteil der APC-Fluoreszenz (FRET).
  • Der Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (ALPHAScreen, BioSignal) beruht auf der Übertragung eines Singulett-Sauerstoffs zwischen Donor- und Akzeptor-Kügelchen, die über ein phosphoryliertes Peptid einander nahe gebracht wurden. Nach Anregung bei 680 nm wandeln Photosensitiser in den AS-Donor-Kügelchen Sauerstoff aus der Umgebung in Singulett-Sauerstoff um, der bis zu einer Strecke von 200 nm diffundiert. Chemilumineszierende Gruppen in den Akzeptor-Kügelchen übertragen Energie auf Fluoreszenzakzeptoren innerhalb des Kügelchens, das dann Licht bei ungefähr 600 nm emittiert. Zum Nachweis der Kinaseaktivität durch Verwendung des ALPHAScreenTM von Packard BioScience, phosphoryliert beispielsweise die interessierende Kinase ein biotinyliertes Peptid in Gegenwart von ATP. Das phosphorylierte Peptid wird von einem spezifischen Anti-Phospho-Antikörper, der selbst wiederum an Protein-A-konjugierte Akzeptor-Kügelchen gekoppelt ist, spezifisch erkannt. Der Reaktionsansatz enthält weiterhin Streptavidin-gekoppelte Donor-Kügelchen, die das Ubiquitin-Konjugat des Peptids erkennen und binden können. Bei Bindung an das Peptid geraten sowohl die Akzeptor- als auch die Donor-Kügelchen in enge Nachbarschaft zueinander, womit eine Kaskade an chemischen Reaktionen erzeugt wird, durch die ein hochamplifiziertes nachweisbares Luminiszenzsignal produziert wird: Regt eine Laserquelle einen Photosensitiser in Donor-Kügelchen an, wird Sauerstoff aus der Umgebung in Singulett-Sauerstoff umgewandelt. Der Singulett-Sauerstoff ist dazu in der Lage, ein Thioxin-Derivat im Akzeptor-Kügelchen anzuregen, welches dann Chemolumineszenz bei einer Wellenlänge von 320 nm emittiert. Dadurch werden dann weitere in den Akzeptor-Kügelchen enthaltene Fluorophore zur eigenen Lumineszenzemission angeregt (bei Wellenlängen von 520 bis 620 nm). Da die Vorbedingung der Anregung der Fluorophore in der Diffusion des Singulett-Sauerstoffs von den Donor- zu den Akzeptor-Kügelchen besteht, werden nachweisbare Signale nur dann erzeugt, wenn die Donor- und Akzeptor-Kügelchen sich in enger Nachbarschaft zueinander befinden.
  • Zu den bevorzugten Beispielen gehören weiterhin Assays auf Zellbasis, wobei eine Zellinie ein rekombinantes interessierendes Protein stabil (induzierbar oder nicht induzierbar; chromosomal oder episomal) oder transient exprimiert. Zu diesen Assays gehören beispielsweise Reportergen-Assays, wobei die Regulierung eines bestimmten Promotors oder eines Signalweiterleitungswegs eines Mitglieds einer Signalweiterleitungskaskade gemäß der Aktivität eines Reporterenzyms, dessen Expression unter der Kontrolle des bestimmten Promotors steht, gemessen wird. Für diese Art von Assay muß eine rekombinante Zellinie konstruiert werden, die das Reportergen unter der Kontrolle eines definierten Promotors enthält, der entweder selbst zu untersuchen ist oder durch die untersuchte Signalisierungskaskade reguliert wird. Geeignete Reporterenzyme sind im Stand der Technik allgemein bekannt und umfassen die Leuchtkäfer („Firefly")-Luziferase, Renilla-Luziferase (z.B. kommerziell erhältlich von Packard reagents), β-Galactosidase. Geeignete Zellinien hängen vom Ziel des Assays ab, umfassen jedoch meistens Zellinien, die leicht zu transfizieren und leicht zu kultivieren sind, wie z.B. HeLA, COS, CHO, NIH-3T3, usw.
  • In Assays auf Zellbasis (auch funktionelle Assays genannt) wird die Aktivität einer bestimmten Kinase in eine funktionelle Zellantwort, wie z.B. Wachstum, Wachstumsstillstand, Differenzierung oder Apoptose, umgewandelt. Für diese Art von Screening stellt die Hefe ein besonders geeignetes Modellsystem dar. Funktionelle Hefe-Assays wurden für mehrere Zielmoleküle entwickelt, unter anderem TAK1. Bei Kultivierung auf glucosehaltigem Medium wachsen die TAK1-Hefezellen wie normale Hefezellen. Werden sie dagegen Galaktose ausgesetzt, so wird die interzelluläre TAK1-Expression induziert. Die dadurch produzierte TAK1-Aktivität führt zum Tod der Hefezellen. Die TAK1-Aktivität hemmende Verbindungen verhindern den Zelltod. Der Prozentsatz an lebenden Hefezellen ist ein Maß für die Hemmwirkung der Verbindung.
  • Der Vorteil der Assays auf Zellbasis liegt in der Möglichkeit, die Wirksamkeit eines potentiellen Kinaseinhibitors in der "natürlichen Kinase-Umgebung", nämlich der Zelle, zu bestimmen. Innerhalb der Zelle muß der Inhibitor sich mit redundanten Signalwegen auseinandersetzen, die die Funtion der Ziel-Kinase übernehmen können. Darüber hinaus sollten Inhibitoren, die zu den ATP-Bindungsstellen von Kinasen geleitet werden, mit den hohen Konzentrationen an intrazellulärem ATP (1-5 mM) konkurrieren. Weiterhin müssen sie mit der Gegenwart einer großen Anzahl anderer ATP verwendender Proteine in der Zelle konkurrieren. Schließlich können nichtspezifische Wirkungen (z.B. Hemmung anderer Kinasen) identifiziert und das Eindringen des Arzneistoffs beurteilt werden.
  • Weitere Arten von Assays und von "Readouts" sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Screen mit hohem Durchsatz, der auf einem der obigen Verfahren beruht.
  • Die unterschiedlichen Aspekte der vorliegenden Erfindung dienen dem Auffinden pharmazeutisch aktiver Substanzen zur Behandlung oder Vorbeugung von Knochenschwund, wobei das Augenmerk auf die Fähigkeit der Substanzen zur negativen Störung/Hemmung der TAK1-Funktion bei der Förderung der zugrundeliegenden pathologischen Prozesse gerichtet ist. Die Ausdrücke negative Störung/Hemmung in bezug auf die unterschiedlichen Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen die Fähigkeit zur direkten oder indirekten Beeinflussung der TAK1-Funktion in einer negativen Weise, wodurch die TAK1-Funktion vermindert oder völlig aufgehoben wird. Diese Hemmung kann auf einem oder mehreren unterschiedlichen Mechanismen beruhen, d.h. durch Absenken des zellulären Niveaus des TAK1-Steady-State (d.h. durch negatives Beeinflussen der TAK1-Transkription und/oder-Translation, Reduzierung der Stabilität von TAK1-Protein oder -mRNA, usw.), Hemmung der enzymatischen TAK1-Aktivität oder Modulierung vorgeschalteter oder nachgeschalteter Signalweiterleitungskaskaden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen das Absenken des zellulären TAK1-Niveaus und/oder die Hemmung der enzymatischen TAK1-Aktivität. Bei einem Inhibitor der TAK1 kann es sich somit um eine beliebige Substanz, vorzugsweise eine biochemische oder chemische Verbindung, handeln, die zur negativen Störung/Hemmung der TAK1-Funktion in der Lage ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die TAK1, das Derivat oder Fragment davon als isoliertes Molekül verwendet.
  • Im Zusammenhang mit dieser Erfindung bezieht sich der Ausdruck "isoliert" in bezug auf "isoliertes Protein", "isolierte Nukleinsäure" usw. sowohl auf aus natürlichen Quellen aufgereinigten Proteinen/Nukleinsäuren als auch auf gereinigte rekombinante Proteine/Nukleinsäuren (wobei der Ausdruck gereinigt eine Teilreinigung einschließt).
  • Verfahren zur Produktion isolierter TAK1-Moleküle sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu diesen gehören beispielsweise die Amplifikation von Polynukleotiden einer gewünschten Länge über die Polymerasekettenreaktion (PCR) auf Grundlage der veröffentlichten genomischen oder codierenden Polynukleotidsequenzen und die anschließende Klonierung der hergestellten Polynukleotide in Wirtszellen. Bei der PCR (Polymerase Chain Reaction) handelt es sich um eine In-Vitro-Technik, die die spezifische Amplifizierung von Sequenzabschnitten mit Nukleotidabschnitten bekannter Sequenz in ihrer 5'- und 3'-Nachbarschaft ermöglicht. Um eine gegebene Sequenz zu amplifizieren, reicht es aus, wenn man die Sequenz im 5'-Bereich der zu amplifizierenden Sequenz kennt. In diesem Fall wird zunächst ein Fragment des zu amplifizierenden Polynukleotids erzeugt (dies kann mit einer bekannten Technik, wie z.B. Verdauung mit einer Restriktionsendonuklease, durchgeführt werden). Danach wird ein DNA-Molekül bekannter Sequenz (ein „Linker") mittels einer Ligase (wie z.B. T4-DNA-Ligase, die von verschiedenen Zulieferfirmen kommerziell erhältlich ist) an das 3'-Ende des erzeugten Polynukleotidfragments gekoppelt. Die erhaltene Sequenz ist somit von zwei bekannten Sequenzen umgeben, der bekannten 5'-Sequenz und 3' von der bekannten Linker-Sequenz, wodurch die spezifische Amplifizierung des PCR (in diesem Fall einer Linker-vermittelten PCR, „ImPCR" ermöglicht wird.
  • Zur Amplifizierung der gewählten Sequenz werden kurze einzelsträngige DNA-Moleküle ("Primer") verwendet, die zu den die zu amplifizierende Polynukleotidsequenz flankierenden Sequenzabschnitten komplementär sind. Bei Polynukleotidmatrize kann es sich entweder um DNA oder RNA handeln. Die Primer werden dann an die einzelsträngige Matrize in einer „Annealing"-Reaktion gebunden und dann unter definierten und allgemein bekannten Bedingungen mittels spezifischer Enzyme, den sogenannten Polymerasen (entweder DNA-Polymerasen, die DNA als Matrize erkennen und komplementäre DNA-Polynukleotide produzieren, oder reverser Transkriptasen, die RNA als Matrize erkennen und komplementäre DNA-Polynukleotide produzieren), womit neue DNA-Stränge erzeugt werden, deren Sequenz komplementär zu der des Matrizenstranges ist, verlängert. Durch die Wahl definierter Abfolgen von Inkubationsschritten bei definierten Temperaturen und in definierten Zeitabständen, die regelmäßig wiederholt werden, wird eine Abfolge von Denaturierungs-/Annealing-/Polymerisierungsschritten erzeugt, die schließlich zur exponentiellen Amplifikation des interessierenden Polynukleotids führt. Damit die notwendigen Temperaturen zur Denaturierung angewandt werden. können, ohne dabei die Polymerase zu zerstören, werden hitzestabile Enzyme verwendet, die ohne weiteres Temperaturen bis zu 95°C und mehr tolerieren können, wie z.B. die Taq-DNA-Polymerase (DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus), PFU usw., die beide jeweils von unterschiedlichen Zulieferfirmen kommerziell erhältlich sind. Die Wahl geeigneter Polymerasen hängt vom Verwendungszweck ab (z.B. zur Klonierung mittels PCR werden vorzugsweise Polymerasen mit Fehlerkorrektur („profreading")-Fähigkeiten verwendet, wie z.B. PFU) und liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns.
  • Eine typische PCR-Reaktion umfaßt die Polynukleotidmatrize (z.B. 0,01 bis 20 ng), zwei geeignete Primer (in einer Konzentration von z.B. jeweils 0,2 to 2 μM), dNTPs (in einer Konzentration von z.B. jeweils 200μM), 1 bis 2mM MgCl2 und 1 bis 10 Einheiten einer hitzestabilen Polymerase, wie z.B. Taq. Typische Bestandteile und Puffer sind dem Fachmann allgemein bekannt und von kommerziellen Zulieferfirmen allgemein erhältlich.
  • Geeignete Primer lassen sich mittels chemischer Synthese nach bekannten Protokollen erzeugen. Solche Primer sind ebenfalls von verschiedenen Zulieferfirmen, wie z.B. MWG-Biotech usw., kommerziell erhältlich.
  • DNA- und RNA-Matrizen und ebenfalls cDNA-Matrizen lassen sich mittels allgemein bekannter Standardverfahren (siehe z.B. die untenangegebene Standardliteratur) erzeugen und können ebenfalls von kommerziellen Zulieferfirmen, wie z.B. Promega und Stratagene usw., bezogen werden. Geeignete Puffer und Enzyme zur Durchführung der PCR sind im Fachgebiet bekannt und ebenfalls kommerziell erhältlich.
  • Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung isolierter Polynukleotide ist die Klonierung einer gewünschten Sequenz und seine anschließende vollständige oder teilweise Reinigung mittels Standardverfahren. Zur Erzeugung isolierter Polypeptide werden die Polynukleotide in Expressionsvektoren kloniert und die Polypeptide in geeigneten Wirtsorganismen, vorzugsweise einzelligen Organismen wie etwa geeignete Stämme von Bakterien oder Hefe, exprimiert und anschließend vollständig oder teilweise gereinigt.
  • Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotidfragments für die anschließende Klonierung ist die Polymerasekettenreaktion (PCR). Für die PCR-Klonierung wird vorzugsweise wenigstens ein in seinem 5'-Teil die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease (eine sogenannte „Restriktionsstelle") tragender Primer verwendet. Besonders bevorzugt tragen sowohl der 3'- als auch der 5'-Primer jeweils eine Restriktionsstelle an ihrem 5'-Ende, wobei die Stellen gleich oder verschieden sein können. Häufig verwendete Restriktionsstellen und Enzyme sind beispielsweise BamHI (GGATCC), ClaI (ATCGAT), EcoRI (GAATTC), EcoRV (GATATC), HindIII (AAGCTT), NcoI (CCATGG), SalI (GTCGAC), XbaI (TCTAGA) usw. Die Wahl geeigneter Restriktionsstellen/-enzyme und Reaktionsbedingungen liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Zur Klonierung eines Polynukleotids wird ein Vektor, der die gleiche(n) Restriktionsstelle(n) wie die das Polynukleotid flankierende(n) trägt, mit dem (den) entsprechenden Restriktionsenzymen) inkubiert („verdaut"). Dementsprechend wird das beispielsweise mittels PCR erzeugte Polynukleotid isoliert und mit dem (den) gleichen Restriktionsenzymen) verdaut, wodurch ein Fragment entsteht, das mit den Enden des linearisierten Vektors kompatible Enden trägt. Nach Reinigung von verdautem Vektor und Polynukleotidfragment werden dann das Polynukleotidfragment und der Vektor mittels einer DNA-Ligase unter geeigneten (im Stand der Technik allgemein bekannten) Reaktionsbedingungen zusammengefügt (Ligationsreaktion).
  • Bei einem Vektor handelt es sich um ein kreisförmiges oder lineares Polynukleotidmolekül, beispielsweise ein DNA-Plasmid, Bakteriophage oder Cosmid, mit dessen Hilfe Polynukleotidfragmente spezifisch in geeigneten Organismen amplifiziert werden können (d.h. Klonierung). Geeignete Organismen sind meistens einzellige Organismen mit hohen Vermehrungsraten, wie z.B. Bakterien oder Hefe. Als Organismen können ebenfalls aus mehrzelligen Geweben isolierte und kultivierte Zellen dienen, wie z.B. aus diversen Organismen erzeugte Zellinien (z.B. SF9-Zellen aus Spodoptera frugiperda, usw.). Geeignete Vektoren sind im Fachgebiet bekannt und kommerziell bei diversen biotechnischen Zulieferfirmen wie beispielsweise Roche Diagnostics, New England Biolabs, Promega, Stratagene und vielen anderen erhältlich. Geeignete Zellinien sind beispielsweise bei der ATCC (American Type Culture Collection) kommerziell erhältlich.
  • Mittels im Fachgebiet allgemein bekannter spezifischer Vektoren können isolierte Polypeptide heterolog unter Verwendung der subklonierten Polynukleotide produziert werden. Dies wird vorzugsweise durch Expression in geeigneten Wirtszellen, z.B.
  • Bakterien (vorzugsweise E.-coli-Stämme) oder eukaryontischen Wirten (z.B. SF9-Zellen, Hefezellen usw.) durchgeführt. Hierzu wird das Polynukleotid in einem für die Art der gewählten Wirtszelle geeigneten Expressionsvektor subkloniert und anschließend in die gewählte Wirtszelle eingeführt. Geeignete Verfahren zur Transformation und Transfektion sind ebenso wie Bedingungen für die Zellkultivierung und Induktion heterologer Proteinexpression im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z.B. die untenaufgeführte Standardliteratur). Eine weitere Möglichkeit zur rekombinanten Proteinproduktion besteht in der In-Vitro-Translation. Hierfür wird das Polynukleotid ebenfalls in einem geeigneten Vektor subkloniert und anschließend das Polypeptid in geeigneten Puffern und Zellextrakten (z.B. Retikulozytenlysat) exprimiert. Vektoren, notwendige Reagentien und geeignete Bedingungen sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und kommerziell erhältlich (z.B. Invitrogen).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird TAK1, das Derivat oder Fragment davon in einem biochemischen oder zellulären Assay verwendet.
  • Die TAK1 kann aus einer beliebigen Quelle stammen, stammt vorzugsweise aus Säugern und ist ganz besonders bevorzugt menschliche TAK1 und vor allem TAK1 gemäß einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 8.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei TAK1 oder dem Derivat oder Fragment davon um ein Polynukleotid.
  • Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Polynukleotid eine der folgenden Sequenzen oder besteht daraus:
    • a. Eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 4;
    • b. Eine zur Hybridisierung mit einer Sequenz gemäß a) unter Stringenzbedingungen fähige Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert;
    • c. Eine aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von einer Sequenz gemäß a) oder b) abgeleitete Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert;
    • d. Ein Fragment einer der Sequenzen gemäß a), b) oder c), das für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert und vorzugsweise für ein Polypeptid mit der Sequenz gemäß SEQ ID No. 9 codiert;
    • e. Eine mittels eines Austauschs einer oder mehrerer Nukleotide von einer der Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) abgeleitete Sequenz, wobei der Nukleotidaustausch nicht oder nicht ausschließlich auf die Degeneriertheit des genetischen Codes zurückzuführen ist und die Sequenz für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert.
  • Isolierte Polynukleotide und Oligonukleotide können zur Hybridisierung bei unterschiedlichen Stringenzbedingungen verwendet werden.
  • Stringenz beschreibt Reaktionsbedingungen, die die Spezifität der Hybridisierung oder des Annealing zweier einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle beeinflussen. Die Stringenz und somit die Spezifität einer Reaktion hängt unter anderem von der Temperatur und den Pufferbedingungen, die für eine Reaktion verwendet werden, ab: Die Stringenz, und somit die Spezifität, läßt sich beispielsweise erhöhen, indem man die Reaktionstemperatur erhöht und/oder die Ionenstärke des Reaktionspuffers reduziert. Niedrigstringenzbedingungen (und somit eine niedrige Reaktions- und Hybridisierungsspezifität) existieren beispielsweise bei Durchführung einer Hybridisierung bei Raumtemperatur in 2 × SSC-Lösung. Hochstringenzbedingungen umfassen beispielsweise eine Hybridisierungsreaktion bei 68°C in 0,1 × SSC und 0,1 % SDS-Lösung.
  • Unter einer Hybridisierung unter Stringenzbedingungen innerhalb der unterschiedlichen Aspekte der vorliegenden Erfindung versteht man vorzugsweise:
    • 1) Hybridisierung einer markierten Sonde mit einer zu analysierenden Nukleinsäureprobe bei 65°C, oder im Fall von Oligonukleotidsonden bei 5°C unterhalb der Annealing- oder Schmelztemperatur des aus dem Oligonukleotid und der Probe bestehenden Duplex (Annealing- und Schmelztemperatur sind im folgenden als Synonyme zu verstehen), über Nacht in 50mM Tris pH 7,5, 1 M NaCl, 1 % SDS, 10% Dextransulfat, 0,5 mg/ml denaturierte Lachs- oder Heringssperma-DNA.
    • 2) 10minütiges Waschen in 2 × SSC bei Raumtemperatur.
    • 3) 30minütiges Waschen in 1 × SSC/0,1 %SDS bei 65°C (oder im Fall von Oligonukleotiden: 5°C unterhalb der Annealing-Temperatur).
    • 4) 30minütiges Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 65°C (oder im Fall von Oligonukleotiden: 5°C unterhalb der Annealing-Temperatur).
  • Bei den Oligonukleotiden handelt es sich um Polynukleotide und vorzugsweise DNA-Fragmente mit einer Länge von 15 bis 30, vorzugsweise 20 Nukleotiden. Die Annealing-Temperatur wird entsprechend der Formel Tm=2x (Anzahl A+T) + 4x (Anzahl G+C)°C bestimmt.
  • Zur Herstllung einer 2 × SSC oder einer 0,1 × SSC- (oder einer beliebigen anderen Art von SSC-Verdünnung) wird beispielsweise eine 20 × SSC-Lösung entsprechend verdünnt. 20 × SSC besteht aus 3M NaCl/0,3M Na/Citrat × 2H2O.
  • Vor Durchführung einer Hybridisierungsreaktion werden die Polynukleotide, falls gewünscht nach Durchführung einer elektrophoretischen Trennung (danach: Southern Blot (DNA) oder Northern Blot (RNA)) oder ohne elektrophoretische Trennung (danach: Slot- oder Dot-Blot), auf eine geeignete Membran, z.B. eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran, übertragen. Die Hybridisierung wird unter Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Sonde durchgeführt. Geeignete Markierungstechniken sind beispielsweise die radioaktive Markierung oder die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Bei der Sonde handelt es sich um ein einzelsträngiges Polyribo- oder Polydesoxyribonukleotid, das natürlicherweise als Einzelstrang vorliegt oder, normalerweise als Doppelstrang vorliegend, durch Denaturierung einzelsträngig gemacht wurde. Diese Sonde bindet an die DNA- oder RNA-Probe (die ebenfalls in Einzelstrangform vorliegt) mittels Basenpaarung.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei TAK1 oder dem Derivat oder Fragment davon um ein Polypeptid.
  • Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid durch eine der folgenden Sequenzen codiert:
    • a. Eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 4;
    • b. Eine zur Hybridisierung mit einer Sequenz gemäß a) unter Stringenzbedingungen fähige Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert;
    • c. Eine aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von einer Sequenz gemäß a) oder b) abgeleitete Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert;
    • d. Ein Fragment einer der Sequenzen gemäß a), b) oder c), das für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert; und vorzugsweise SEQ ID No. 9 umfaßt oder daraus besteht.
    • e. Eine mittels eines Austauschs einer oder mehrerer Nukleotide von einer der Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) abgeleitete Sequenz, wobei der Nukleotidaustausch nicht oder nicht ausschließlich auf die Degeneriertheit des genetischen Codes zurückzuführen ist und die Sequenz für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Polypeptid eine Sequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID No. 5 bis 8 oder besteht daraus.
  • Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das funktionelle Fragment oder Derivat des Polypeptids eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 9 oder besteht daraus.
  • Beim Knochenschwund handelt es sich vorzugsweise um Osteoporose (OP).
  • Der vorliegende Erfindungsgegenstand betrifft weiterhin die Verwendung eines Inhibitors der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 (TAK1) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Knochenschwund, insbesondere Osteoporose. Der TAK1-Inhibitor läßt sich ebenfalls zur Behandlung der Schmerzen im Zusammenhang mit Knochenschwund verwenden, insbesondere durch Verringerung der Schmerzen bei Osteoporose.
  • Bei dem TAK1-Inhibitor handelt es sich vorzugsweise um eine biochemische oder chemische Verbindung mit der Fähigkeit zur Störung/Hemmung der TAK1-Funktion.
  • Zu derartigen TAK1-Inhibitoren gehören beispielsweise Bindungsproteine oder Bindungspeptide, die gegen TAK, insbesondere gegen das aktive Zentrum der TAK1 gerichtet sind; gegen das TAK1-Gen oder gegen TAK1 selbst gerichtete Nukleinsäuren, ein chemisches Molekül und/oder ein Naturproduktextrakt.
  • Der Ausdruck "chemisches Molekül" umfaßt nichtpolymere organische Verbindungen, Lipide, Kohlenhydrate, Peptide, vorzugsweise Peptide mit etwa 10 bis etwa 80 Aminosäuren, und Oligonukleotide, vorzugsweise mit etwa 10 bis etwa 90 Nukleotiden. Am meisten bevorzugt sind kleine chemische Moleküle, insbesondere nichtpolymere organische Verbindungen, die entweder in einem Labor synthetisiert oder in der Natur entdeckt wurden, mit einem bevorzugten Molekulargewicht von etwa 200 g/mol bis etwa 1500 g/mol, insbesondere 400 g/mol bis 1000 g/mol. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem chemischen Molekül um 5Z-7-Oxozeanol oder ein Derivat davon mit der Fähigkeit zur negativen Störung/Hemmung der TAK1-Funktion.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Inhibitor in Form eines Naturproduktextrakts, entweder in roher oder gereinigter Form, vorliegen. Der Extrakt läßt sich gemäß Standardverfahren herstellen, wie z.B. der Extraktion mit Wasser und/oder Alkohol und/oder einem organischen Lösungsmittel und/oder Säulenchromatographie und/oder Ausfällung, und zwar aus einer tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Quelle, wie etwa Schlangengift, Blätter oder mikrobiellen Fermentationsbrühen.
  • Die Ausdrücke "Bindungsprotein" oder "Bindungspeptid" beziehen sich auf eine Klasse von Proteinen oder Peptiden, die TAK binden und inhibieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, Antikörperfragmenten und gegen TAK gerichteten Proteingerüsten, z.B. Anticalinen, die gegen TAK gerichtet sind.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragments wird entsprechend dem Fachmann allgemein bekannter Verfahren durchgeführt, beispielsweise durch Immunisierung eines Säugers, z.B. eines Kaninchens, mit TAK1, gegebenenfalls in Gegenwart von beispielsweise Freunds Adjuvants und/oder Aluminiumhydroxidgel (siehe z.B. Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Die polyklonalen Antikörper, die im Tier als Ergebnis einer immunologischen Reaktion gebildet werden, lassen sich anschließend aus dem Blut unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren isolieren und beispielsweise mittels Säulenchromatographie aufreinigen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise gemäß dem bekannten Verfahren von Winter & Milstein hergestellt werden (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem Ausdruck Antikörper oder Antikörperfragment ebenfalls Antikörper oder Antigen bindende Teile davon, die rekombinant hergestellt und gegebenenfalls modifiziert wurden, wie z.B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bispezifische oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper und F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente (siehe z.B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567 , US 4,816,397 , WO 88/01649, WO 93/06213 oder WO 98/24884).
  • Als Alternative zu den klassischen Antikörpern können auch beispielsweise Proteingerüste gegen TAK1, z.B. Anticaline, die auf Lipocalin beruhen, verwendet werden (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Die natürlichen Ligandenbindungsstellen der Lipocaline, beispielsweise des Retinol bindenden Proteins oder des Bilin bindendens Proteins, lassen sich verändern, beispielsweise mittels eines "kombinatorischen Protein-Design"-Ansatzes, und zwar so, daß sie an ausgewählte Haptene, hier an TAK1, binden (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Andere bekannte Proteingerüste sind als Alternativen für Antikörper zur molekularen Erkennung bekannt (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187).
  • Der Ausdruck "Nukleinsäuren gegen das TAK1-Gen oder gegen TAK1 selbst" bezieht sich auf doppelsträngige oder einzelsträngige DNA oder RNA, die beispielsweise die Expression des TAK1-Gens oder die TAK1-Aktivität hemmt, und umfaßt, ohne darauf beschränkt zu sein, Antisense-Nukleinsäuren, Aptameren, siRNAs (small interfering RNAs) sowie Ribozyme.
  • Die Nukleinsäuren, z.B. die Antisense-Nukleinsäuren, können chemisch synthetisiert werden, beispielsweise gemäß dem Phosphotriester-Verfahren (siehe z.B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). Bei Aptameren handelt es sich um Nukleinsäuren, die mit hoher Affinität an ein Polypeptid, hier TAK1, binden. Aptamere lassen sich durch Selektionsverfahren, wie z.B. SELEX (siehe z.B.
  • Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug und Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981 ), aus einem großen Pool unterschiedlicher einzelsträngiger RNA-Moleküle isolieren. Aptamere können ebenfalls synthetisiert und in ihrer Spiegelbildform, beispielsweise als L-Ribonukleotid, ausgewählt werden (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Formen, die auf diese Weise isoliert wurden, genießen den Vorteil, daß sie nicht durch natürlich auftretende Ribonukleasen abgebaut werden und daher eine größere Stabilität besitzen.
  • Nukleinsäuren können durch Endonukleasen oder Exonukleasen, insbesondere durch DNasen and RNasen, die in der Zelle angetroffen werden können, abgebaut werden. Es ist daher vorteilhaft, die Nukleinsäuren zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, wodurch sichergestellt wird, daß eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle über einen langen Zeitraum aufrechterhalten wird (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Typischerweise läßt sich eine solche Stabilisierung erzielen, indem eine oder mehrere Internukleotid-Phosphorgruppen oder ein oder mehrere Nicht-Phosphor-Internukleotide eingeführt werden.
  • Eine Zusammenstellung geeigneter modifizierter Internukleotide findet sich bei Uhlmann und Peyman (1990), supra (siehe auch Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid-Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die in einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, enthalten beispielsweise Methylphosphonat-, Phosphorothioat-, Phosphoramidat-, Phosphorodithioat- und/oder Phosphatester, wohingegen Nicht-Phosphor-Internukleotidanaloge beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist ebenfalls vorgesehen, daß diese Modifikation die Beständigkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessern sollte.
  • Die Verwendung geeigneter Antisense-Nukleinsäuren ist weiterhin beispielsweise bei Zheng und Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen und Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419-23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697-74 or Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142) beschrieben.
  • Die Herstellung und Verwendung von siRNAs als Werkzeuge zur Störung mit RNA beim Vorgang des Herunterregulierens oder Abschaltens der Genexpression, hier der TAK1-Genexpression, ist beispielsweise bei Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 oder Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494 beschrieben.
  • Weitere geeignete Werkzeuge zur Hemmung der Translation von Nukleinsäuren, hier des TAK1-Gens, sind Ribozyme, denn sie sind dazu in der Lage, die mRNAs spezifisch zu binden und zu schneiden. Sie sind beispielsweise beschrieben bei Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2 or Couture und Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510-5.
  • Somit lassen sich die beschriebenen Nukleinsäuren zur Hemmung oder Reduzierung der Expression der TAK1-Gene in den Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verwenden und wirken demzufolge als ein TAK1-Inhibitor im Sinne der vorliegenden Erfindung. Für die Verwendung als Antisense-Oligonukleotid beziehungsweise Ribozym wird eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.
  • Für die Herstellung des Arzneimittels werden die TAK1-Inhibitoren der vorliegenden. Erfindung üblicherweise mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Zusatz- oder Hilfsstoffen formuliert, wie z.B. physiologischer Pufferlösung, z.B. Natriumchloridlösung, entmineralisiertem Wasser, Stabilisatoren, wie z.B. Protease- oder Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Pepstatin A, oder Sequesterungsmittel, wie z.B. EDTA, Gelformulierungen, wie z.B. weiße Vaseline, niedrigviskoses Parrafin und/oder gelbes Wachs, usw., je nach Art der Verabreichung.
  • Weitere geeignete Zusatzstoffe sind beispielsweise Detergentien, wie z.B. Triton X-100 oder Natriumdeoxycholat, aber auch Polyole, wie z.B. Polyethylenglycol oder Glycerin, Zucker (z.B. Saccharose oder Glucose), zwitterionische Verbindungen, wie z.B. Aminosäuren, wie etwa Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder ein Protein, wie z.B. Rinder- oder Humanserumalbumin. Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen sind bevorzugt.
  • Die physiologische Pufferlösung weist vorzugsweise einen pH-Wert von ca. 6.0-8.0, vor allem einen pH-Wert von ca. 6.8-7.8, insbesondere einen pH-Wert von ca. 7.4, und/oder eine Osmolarität von ca. 200-400 Milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 Milliosmol/Liter, auf. Der pH des Arzneimittels wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer, wie z.B. vorzugsweise einem Phosphatpuffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)piperazino]ethansulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3-Morpholino-1-propansulfonsäure), eingestellt. Die Wahl des jeweiligen Puffers hängt im allgemeinen von der gewünschten Puffermolarität ab. Phosphatpuffer eignet sich beispielsweise für Injektions- und Infusionslösungen.
  • Das Arzneimittel läßt sich in herkömmlicher Weise verabreichen, beispielsweise mittels oraler Dosierungsformen, wie z.B. Tabletten oder Kapseln, mittels der Schleimhäute, beispielsweise der Nase oder der Mundhöhle, in Form von unter der Haut implantierten Dispositorien, mittels Injektionen, Infusionen oder Gelen, die die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. Weiterhin besteht die Möglichkeit, das Arzneimittel topisch und lokal zu verabreichen, um die jeweilige Gelenkerkrankung wie oben beschrieben zu behandeln, gegebenenfalls in Form von Liposomenkomplexen. Weiterhin läßt sich die Behandlung mittels eines transdermalen therapeutischen Systems (TTS) durchführen, das eine zeitmäßig kontrollierte Freisetzung der Arzneimittel ermöglicht. TTS sind beispielsweise aus EP 0 944 398 A1 , EP 0 916 336 A1 , EP 0 889 723 A1 oder EP 0 852 493 A1 bekannt.
  • Injektionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn nur verhältnismäßig kleine Mengen einer Lösung oder Suspension, beispielsweise etwa 1 bis etwa 20 ml, dem Körper verabreicht werden müssen. Infusionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn eine größere Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehrere Liter, verabreicht werden muß. Da im Gegensatz zur Infusionslösung, im Fall von Injektionslösungen nur einige wenige Milliliter verabreicht werden, machen sich kleine Abweichungen vom pH-Wert und vom osmotischen Druck des Bluts oder der Gewebeflüssigkeit bei der Injektion nicht von selbst bemerkbar oder machen sich nur geringfügig im Hinblick auf die Schmerzempfindung bemerkbar.
  • Daher ist eine Verdünnung der erfindungsgemäßen Formulierung vor Gebrauch im allgemeinen nicht notwendig. Im Fall der Verabreichung relativ großer Mengen sollte die erfindungsgemäße Formulierung jedoch kurz vor Verabreichung so stark verdünnt werden, daß eine wenigstens ungefähr isotonische Lösung erhalten wird. Bei einer isotonischen Lösung handelt es sich beispielsweise um eine 0,9%ige Kochsalzlösung. Im Fall einer Infusion läßt sich die Verdünnung beispielsweise mit sterilem Wasser ausführen, während die Verabreichung beispielsweise über einen sogenannten Bypass durchgeführt werden kann.
  • Die oben beschriebenen Nukleinsäuren lassen sich in nackter Form, in Form von Gentransfervektoren oder komplexiert mit Liposomen oder Goldpartikeln verwenden.
  • Bei den Gentransfervektoren handelt es sich beispielsweise um Virusvektoren, z.B. Adenovirusvektoren oder Retrovirusvektoren (Lindemann et al. (1997), Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al. (1988) Mol. Cell., 2, 549-58). Durch Komplexe mit Liposomen wird üblicherweise eine sehr hohe Transfektionseffizienz erzielt, insbesondere von Hautzellen (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4:2279-85). Bei der Lipofektion werden kleine aus kationischen Lipiden zusammengesetzte unilamellare Vesikel durch Ultrabeschallung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA ist auf der Oberfläche der Liposomen in solch einem Verhältnis ionisch gebunden, daß eine positive Nettoladung übrigbleibt und die gesamte Plasmid-DNA durch die Liposomen komplexiert ist. Zusätzlich zu den von Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 7413 – 7414, eingesetzten DOTMA (1,2-Dioleyloxypropyl-3-trimethylammoniumbromid) und DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wurde inzwischen eine große Anzahl von Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit bei der Transfektion verschiedener Zellinien getestet. (Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986; Gao and Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 2550-2561). Bei den Lipidformulierungen handelt es sich beispielsweise um DOTAP N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat oder DOGS (Dioctadecylamidoglycylspermin).
  • Bei den den Transfer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhenden Hilfsstoffen kann es sich beispielsweise um Proteine oder Peptide handeln, die an die DNA gebunden werden, oder um synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Zellkern ermöglichen (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Branden et al. (1999) Nature Biotech., 17, 784). Zu den Hilfsstoffen gehören ebenfalls Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem., 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann und Peyman (1990), supra).
  • Eine weitere besonders geeignete Form läßt sich erhalten, indem die oben beschriebenen Nukleinsäuren auf Goldpartikel aufgetragen und diese Partikel mit einem unter dem Namen "Gene Gun" bekannten Gerät in das Gewebe oder die Zellen geschossen werden (Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:775-81, Tuting et al. (1998) J. Invest. Dermatol. 111:183-8).
  • Die verschiedenen Aminosäure- und Nukleotidsequenzen lassen sich aus den Abbildungen ersehen.
  • Die unterschiedlichen Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung eignen sich vor allem für die Osteoporose (OP) und den mit dieser Krankheit verbundenen Schmerzen.
  • Literatur
    • • Kondo, M., Osada, H., Uchida, K., Yanagisawa, K., Masuda, A., Takagi, K., Takahashi, T., Takahashi, T. Molecular cloning of human TAK1 and its mutational analysis in human lung cancer. 1998 Int. J. Cancer
    • • Dempsey, C.E., Sakurai, h., Sugita, T., Guesdon, F. Alternative splicing and gene structure of the transforming growth factor beta-activated kinase 1. Biochim. Biophys. Acta. 2000
    • • Mizukami J, Takaesu G, Akatsuka h, Sakurai H, Ninomiya-Tsuji J, Matsumoto K, Sakurai N. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) activates TAK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase through a signaling complex containing RANK, TAB2, and TRAF6. Mol Cell Biol. 2002 Feb;22(4):992-1000.
    • • Takaesu G, Kishida S, Hiyama A, Yamaguchi K, Shibuya H, Irie K, Ninomiya-Tsuji J, Matsumoto K. TAB2, a novel adaptor protein, mediates activation of TAK1 MAPKKK by linking TAK1 to TRAF6 in the IL-1 signal transduction pathway. Mol Cell. 2000 Apr;5(4):649-58.
    • • Takaesu G, Ninomiya-Tsuji J, Kishida S, Li X, Stark GR, Matsumoto K. Interleukin-1 (IL-1) receptor-associated kinase leads to activation of TAK1 by inducing TAB2 translocation in the IL-1 signaling pathway. Mol Cell Biol. 2001 Apr;21(7):2475-84.
    • • Shibuya H, Yamaguchi K, ShiTAK1abe K, Tonegawa A, Gotoh Y, Ueno N, Irie K, Nishida E, Matsumoto K. TAB1: an activator of the TAK1 MAPKKK in TGF-beta signal transduction. Science. 1996 May 24;272(5265):1179-82.
    • • Moriguchi T, Kuroyanagi N, Yamaguchi K, Gotoh Y, Irie K, Kano T, ShiTAK1abe K, Muro Y, Shibuya H, Matsumoto K, Nishida E, Hagiwara M. A novel kinase cascade mediated by mitogen-activated protein kinase kinase 6 and MKK3. J Biol Chem. 1996 Jun 7;271(23):13675-9.
    • • Yamaguchi K, ShiTAK1abe K, Shibuya H, Irie K, Oishi I, Ueno N, Taniguchi T, Nishida E, Matsumoto K. Identification of a member of the MAPKKK family as a potential mediator of TGF-beta signal transduction. Science. 1995 Dec 22;270(5244):2008-11.
    • • Shirakabe K, Yamaguchi K, Shibuya H, Irie K, Matsuda S, Moriguchi T, Gotoh Y, Matsumoto K, Nishida E. TAK1 mediates the ceramide signaling to stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase. J Biol Chem. 1997 Mar 28;272(13):8141-4.
    • • Ninomiya-Tsuji J, Kishimoto K, Hiyama A, Inoue J, Cao Z, Matsumoto K. The kinase TAK1 can activate the NIK-I kappaB as well as the MAP kinase cascade in the IL-1 signalling pathway. Nature. 1999 Mar 18;398(6724):252-6.
    • • Ninomiya-Tsuji J, Kajino T, Ono K, Ohtomo T, Matsumoto M, Shiina M, Mihara M, Tsuchiya M, and Matsumoto K.A Resorcyclic Acid Lactone, 5Z-7-Oxozeaenol, Prevents Inflammation by inhibiting the Catalytic Activity of TAK1 MAPK Kinase Kinase. J Biol Chem. 278(20):18485-90. 2003.
    • • L.A. McKenna, A. Gehrsitz, S. Soeder, W. Eger, T. Kirchner and T. Aigner, Effective isolation of high quality total RNA from human adult articular cartilage. Anal. Biochem. 286 (2000), S. 80-85
    • • Galibert L, Tometsko ME, Anderson DM, Cosman D, Dougall WC. The involvement of multiple tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factors in the signaling mechanisms of receptor activator of NF-kappaB, a member of the TNFR superfamily J Biol Chem. 1998 Dec 18;273(51):34120-7.
    • • Darnay BG, Ni J, Moore PA, Aggarwal BB. Activation of NF-kappaB by RANK requires tumor necrosis factor receptor-associated factor (TRAF) 6 and NF-kappaB-inducing kinase. Identification of a novel TRAF6 interaction motif. J Biol Chem. 1999 Mar 19;274(12):7724-31.
    • • Kaji K, Katogi R, Azuma Y, Naito A, Inoue JI, Kudo A. Tumor necrosis factor alpha-induced osteoclastogenesis requires tumor necrosis factor receptor-associated factor 6. J Bone Miner Res. 2001 Sep;16(9):1593-9.
    • • Cao Z, Xiong J, Takeuchi M, Kurama T, Goeddel DV. TRAF6 is a signal transducer for interleukin-1. Nature. 1996 Oct 3;383(6599):443-6.
    • • Kumar S, Votta BJ, Rieman DJ, Badger AM, Gowen M, Lee JC. IL-1- and TNF-induced bone resorption is mediated by p38 mitogen activated protein kinase. J Cell Physiol. 2001 Jun;187(3):294-303.
    • • Nanes MS Tumor necrosis factor-alpha: molecular and cellular mechanisms in skeletal pathology. Gene. 2003 Dec 4;321:1-15
    • • Abu-Amer Y, Erdmann J, Alexopoulou L, Kollias G, Ross FP, Teitelbaum SL Tumor necrosis factor receptors types 1 and 2 differentially regulate osteoclastogenesis. J Biol Chem. 2000 Sep 1;275(35):27307-10
    • • Roggia C, Gao Y, Cenci S, Weitzmann MN, Toraldo G, Isaia G, Pacifici R. Up regulation of TNF-producing T cells in the bone marrow: a key mechanism by which estrogen deficiency induces bone loss in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 20;98(24):13960-5.
    • • Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349
    • • Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299
    • • Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903
    • • Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50
    • • Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187
    • • Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584
    • • Jayasena (1999) Clin. Chem, 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981
    • • Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5
    • • Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94
    • • Zheng und Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen and Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419-23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697-74 or Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142
    • • Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 or Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494
    • • Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2 oder Couture und Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510-5
    • • Lindemann et al. (1997), Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al. (1988) Mol. Cell., 2, 549-58
    • • Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4:2279-85
    • • Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 7413 – 7414
    • • Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986; Gao und Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 2550-2561
    • • Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Branden et al. (1999) Nature Biotech., 17, 784
    • • Planck et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem., 8, 213
    • • Uhlmann und Peyman (1990), supra
    • • Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:775-81, Tuting et al. (1998) J. Invest. Dermatol. 111:183-8
  • Literatur für Standard-Laborverfahren
  • Falls nicht anders angegeben, wurden Standard-Laborverfahren gemäß der folgenden Standardliteratur durchgeführt:
    Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. S. 545 ff.;
    Current Protocols in Molecular Biology; regelmäßig aktualisiert, z.B. Ausgabe 2000; Wiley & Sons, Inc; Herausgeber: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
  • Current Protocols in Human Genetics; regelmäßig aktualisiert; Wiley & Sons, Inc; Herausgeber: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R: Smith.
  • Current Protocols in Protein Science; regelmäßig aktualisiert; Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
  • Molecular Biology of the Cell; Dritte Auflage; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;
    Short Protocols in Molecular Biology, 5. Auflage, von Frederick M. Ansubel (Herausgeber), Roger Brent (Herausgeber), Robert E. Kingston (Herausgeber), David D. Moore (Herausgeber), J.G. Seidman (Herausgeber), John A. Smith (Herausgeber), Kevin Struhl (Herausgeber), Oktober 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York
    Transgenic Animal Technology. A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, Herausgeber; Academic Press Inc., San Diego, Kalifornien, 1994 (ISBN: 0125571658)
    Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985 (für physologisch unbedenkliche Salze (anorganisch oder organisch)), siehe vor allem S. 1418)
    Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen, die nicht als limitierend zu verstehen sind, veranschaulicht.
  • Beispiel 1
  • Analyse der TAK1-Expression und -Funktion
  • Expressionsanalyse:
  • Um ein besseres Verständnis der den Gelenkerkrankungen, vor allem Osteoarthrose (OA), zugrundeliegenden pathologischen Mechanismen zu erhalten und um Zielmoleküle für eine therapeutische Maßnahme zu identifizieren, wurde ein genomischer Ansatz verwendet. Im Rahmen dieses genomischen Ansatzes wurde die Expression von mehr als 7500 Genen aus über 100 Patienten mit Osteoarthritis analysiert. Die Expression von TAK1 in Knorpel ist bislang noch nicht beschrieben worden, so daß unter diesen Genen TAK1 für die weitere Validierung gewählt wurde. Die Expression der TAK1 in normalem und osteoarthritischem menschlichem artikulärem Knorpel wurde mit QPCR bestätigt, und ähnliche TAK1-Expressionsniveaus wurden in normalem und von OA betroffenem Gewebe gefunden (nicht gezeigt).
  • Funktionsanalyse:
  • Um einen Einblick in die Funktion der TAK1 in Knorpel zu erhalten, wurde als erster Schritt die Expression des TAK1-Proteins in den unterschiedlichen Knorpelzonen analysiert. Während der endochondralen Knochenbildung durchläuft der Chondrozyt unterschiedliche phänotypische Zustände, wobei sich der Epiphysenknorpel in ruhenden, proliferierenden und hypertrophen Knorpel einteilen läßt. In der ruhenden Zone exprimierte. Gene tragen zu anabolen Vorgängen bei, wohingegen in hypertrophen Knorpel exprimierte Gene eher eine katabole Funktion aufweisen (Aigner et al. 2002). Durch Immunhistochemie konnte gezeigt werden, daß TAK1-Protein in hypertrophen Chondrozyten der epiphysen Fuge von STR/1N-Mäusen exprimiert wird (1). Dies führte zu der Annahme, daß TAK1 eine wichtige Rolle im katabolischen Knorpelstoffwechsel spielen könnte, so daß eine funktionelle Validierung durchgeführt wurde, um diese Hypothese zu bestätigen.
  • Funktionelle Validierung:
  • AP1 und NFkB werden durch IL1β aktiviert und spielen eine wichtige Rolle bei der OA-Pathologie. Es konnte gezeigt werden, daß AP1 und NFkB unter pathologischen Bedingungen verstärkt aktiviert werden, wobei die Expression wichtiger OA-Markergene, wie z.B. MMP13, von der Aktivierung dieser beiden Transkriptionsfaktoren abhängt. Um zu testen, ob TAK1 eine Rolle bei der Aktivierung dieser beiden Transkriptionsfaktoren und somit der Regulation der Expression von MMP13 spielt, wurde TAK1, TAB1, oder die kinase-inaktive TAK1-Mutante K63W, bzw. TAK1/TAB1 oder K63W/TAB1 transient in SW1353-Chondrosarcomzellen exprimiert. Die Zellen wurden 24 Stunden mit IL1β stimuliert, und die Freisetzung von MMP13 in den Überstand der Zellen wurde mittels ELISA gemessen. Die Expression von MMP13 ist durch IL1 ß induzierbar und hängt von der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB ab. Daher wurde erwartet, daß eine Überexpression von TAK1/TAB1 zu einer höheren Freisetzung von MMP13 und eine Überexpression der Kinase-Mangelmutante K63W/TAB1 zu einer reduzierten Freisetzung von MMP13 führt. Mit ELISA konnte jedoch kein Unterschied in der IL1β-induzierten Freisetzung von MMP13 zwischen Zellen, die mit TAB1, TAK1/TAB1 bzw. K63W/TAB1 transfiziert worden waren, festgestellt werden. Mittels RT-PCR wurde eine endogene Expression der TAK1 in SW1353 Chondrosarcomzellen nachgewiesen, was bedeutet, daß eine endogene TAK1-Expression vermutlich für die maximale MMP13-Freisetzung nach IL1β-Stimulierung ausreicht. Daher wurde die RNAi-Technik zur Reduzierung der endogenen TAK1-Expression in SW1353-Condrosarcomzellen eingesetzt.
  • Die Suppression des TAK1-Gens und -Proteins durch die RNAi-Methodik wurde mittels QPCR (2) und Immunoblot (3) bestimmt. Weiterhin wurde die Kinetik der Gen- und Proteinsuppression mit QPCR und Immunoblot zu mehreren Zeitpunkten, insbesondere nach 24h, 48h, 72h bzw. 96h, bestimmt, um den besten Zeitpunkt für ein Nachfolgeexperiment, nämlich die Stimulierung mit IL1β, und dem MMP13-Nachweis im Überstand der Zellen zu finden. Als Kontrolle wurden die drei Fehlpaarungen tragende TAK1-siRNA sowie scheintransfizierte Zellen verwendet. Die mRNA-Werte für die Fehlpaarung und die Scheinkontrolle wurden für jeden Posttransfektionszeitpunkt jeweils gleich 100% gesetzt. Die TAK1-mRNA-Niveaus nach TAK1-Gensuppression mit TAK1-siRNA wurden mit der Fehlpaarungs- und der Scheinkontrolle verglichen und darauf bezogen. Innerhalb der ersten 24h nach Transfektion wurde eine starke Gensuppression auf der Ebene der mRNA erzielt, die über die nachfolgenden Tage um 70-80% herum verbleibt und 96h nach Transfektion andauert. Die Wirkung der TAK1-Gensuppression war stärker im Vergleich mit der Scheinkontrolle als mit den drei Fehlpaarungskontrollen. Daraus läßt sich schließen, daß das Zielmolekül der siRNA mit den drei Fehlpaarungen zu einem gewissen Grad die TAK1-mRNA ist, womit die erstere zu einer schwachen TAK1-Gensuppression führt. Somit ist der Unterschied der TAK1-Gensuppression weniger stark im Vergleich mit der Drei-Fehlpaarungen-Kontrolle als mit der Scheinkontrolle. Diese beiden Kontrollen, nämlich die Drei-Fehlpaarungen- und die Scheinkontrolle wurden dazu verwendet, den Bereich der TAK1-Gensuppression, die durch eine sehr nahe verwandte siRNA oder nur durch Lipofektion ausgelöst wurde, abzudecken.
  • Eine Gensuppression konnte ebenso auf der Proteinebene beobachtet werden. Auswirkungen auf die TAK1-Proteinexpression ließen sich 48h und 96h nach Transfektion nachweisen, wobei die stärksten Auswirkungen 72h nach Transfektion auftraten. Die Gensuppression auf Proteinebene wird nicht so schnell erreicht, wie die auf mRNA-Ebene, weil das Protein eine gewisse Halbwertszeit aufweist. Im Fall der TAK1 beträgt die Halbwertszeit etwa um die 36 Stunden. Als Kontrolle für einen ähnlichen Proteinauftrag in jeder Spur der SDS-PAGE wurden die Membranen des Immunoblots anschließend mit einem Antikörper gegen Tubolin inkubiert. Der Immunoblot mit Tubolin zeigt ähnliche Proteinauftragsmengen zwischen den mit TAK1 oder der siRNA mit den drei Fehlpaarungen transfizierten Zellen oder scheintransfizierten Zellen.
  • Zur Untersuchung der TAK1-Funktion bei der IL1β-Signalweiterleitung wurde die TAK1-Genexpression zunächst durch RNAi supprimiert, wonach die Zellen mit IL1β 24h stimuliert wurden und die Konzentration an MMP13 im Überstand der Zellen bestimmt wurde (4). Die MMP13-Expression hängt von der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB ab und ist durch iL1β induzierbar. Handelte es sich bei TAK1 um einen wichtigen Vermittler der IL1 β-Signalweiterleitung, so sollte die TAK1-Gensuppression eine signifikante Abnahme der MMP13-Freisetzung nach IL1β-Stimulierung ergeben. Die Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transfektion stimuliert. Die Stimulierung, die 72h nach Transfektion beginnt, führt zu einer signifikanten Abnahme der MMP13-Sekretion nach IL1 β-Stimulierung und lag um die 30%, verglichen mit der Drei-Fehlpaarungen-Kontrolle und um die 50%, verglichen mit der Scheinkontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, daß TAK1 ein wichtiger Regulator der IL1β-induzierten Transkriptionsaktivität ist.
  • Durch Transfektion mit gegen das TAK1-Gen gerichteter siRNA konnte eine starke Gensuppression auf der Ebene sowohl der mRNA als auch des Proteins erzielt werden. Aufgrund der langen Halbwertszeit des TAK1-Proteins gegenüber der Dauer der Gensuppression auf der mRNA-Ebene ist der Zeitrahmen einer starken Genexpression auf Proteinebene für das folgende Experiment, nämlich die Stimulierung mit IL1β über 24 Stunden, kurz. Daher wurden aufeinanderfolgende Doppeltransfektionen innerhalb von 72 Stunden durchgeführt, um die Wirkung der Gensuppression zu verlängern und zu verstärken. Durch die Doppeltransfektion mit siRNA innerhalb von 72h lag die Reduzierung der IL1β-stimulierten MMP13-Freisetzung um ungefähr 10-20% höher als durch Einzeltransfektionen mit siRNA (5).
  • Die obigen Experimente zeigen, daß TAK1 die IL1β-induzierte Transkriptionsaktivität regulieren kann, so daß die Expression weiterer Gene, die durch IL1β induzierbar sind, über die Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB reguliert werden und eine wichtige Rolle bei dem Krankheitsbild der OA spielen, wie z.B. TNFa und MMP1, analysiert wurde. Zur Untersuchung der Frage, ob TAK1 ebenfalls für die IL1β-induzierte TNFa- und MMP1-Freisetzung wichtig ist, und zur Beurteilung des relativen Einflusses der TAK1 auf die IL1β-stimulierte MMP13-, TNFa- und MMP1-Freisetzung wurde die Freisetzung von MMP1, MMP13 und TNFa in den (gleichen) Überstand der Zellen nach TAK1-Gensuppression (durch aufeinanderfolgende Doppeltransfektion mit siRNA) und 24stündiger Stimulierung mit IL1β gemessen (5). Als Kontrolle wurden Zellen entweder mit TAK1-Fehlpaarung-siRNA oder mit gegen das Luciferasegen, das nicht in Säugerzellen exprimiert wird, gerichteter siRNA transfiziert. Es stellte sich heraus, daß sich die TAK1-Gensuppression am stärksten auf die IL1β-induzierte TNFa-Freisetzung (um die 60-70%) und auf die IL1β-induzierte MMP13-Freisetzung (um die 40-50%) auswirkte und daß eine mäßige Reduzierung der IL1β-induzierten MMP1-Freisetzung (um die 20-30%) stattfand. Die beobachteten Werte für die MMP13-, TNFa- und MMP1-Freisetzung stehen in Beziehung zum Niveau der Gensuppression und sind nicht das Ergebnis einer vollständigen Inaktivierung oder einem zellulären Knock-Out der TAK1.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Inhibitor gegen TAK1 die Wirkung von IL1β auf den Chondrozyten zu reduzieren und somit die Wirkungen eines DMOAD (disease-modifying OA drug [krankheitsmodifizierender oA-Arzneistoff]) und NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drug [nicht-steorider entzündungshemmender Arzneistoff]) miteinander zu kombinieren verspricht.
  • Die Erfindung beruht auf erfindungsgemäßen experimentellen Ergebnissen, die erstmals die Expression von TAK1 in normalen und von OA betroffenen menschlichen partikulären Chondrozyten zeigen. Weiterhin konnte TAK1 als integraler Vermittler der IL1β-induzierten Genexpression in menschlichen Chondrosarkomzellen identifiziert werden. Zudem zeigten Gensuppressionsexperimente, in denen die Expression von TAK1 in SW1353-Chondrosarkomzellen durch RNAi aufgehoben wurde, eine Beteiligung der TAK1-Funktion bei der Freisetzung von MMP13, MMP1 und TNFa, bei denen es sich um Moleküle handelt, die alle am Krankheitsbild der Osteoarthritis beteiligt sind. Diese überraschenden Ergebnisse zeigen, daß TAK1 funktionell am Krankheitsbild der Osteoarthritis beteiligt ist. Somit verspricht ein Inhibitor gegen TAK1 die Wirkung von IL1β auf den Chondrozyten zu reduzieren und somit die Wirkungen eines DMOAD (disease-modifying OA drug) und eines NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drug) miteinander zu kombinieren, so daß zum ersten Mal eine gegen die Ursachen und Symptome gerichtete Kombinationstherapie ermöglicht wird.
  • Material und Methoden
  • Zellkultur und Transfektionen – SW1353-Chondrosarkomzellen wurden von der ATCC bezogen, und die Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagles's medium (DMEM mit hoher Glukosekonzentration, GibcoBRL) mit 10% fötalem Kälberserum (fetal calf serum FCS) und Penicillin/Streptomycin (37° C, 5% CO2) gezüchtet. Die Transfektionen und Stimulierungsexperimente wurden mit Sechs-Loch-Platten durchgeführt.
  • Zur Transfektion mit siRNA wurde die Transfektionseffizienz von drei unterschiedlichen Transfektionsreagentien, LipofectamineTM2000 (Invitrogen), TransIT®siRNA Transfektionreagens (Mirus) und OligofectamineTM (Invitrogen) getestet. Für die Transfektionen wurden 3 × 105/Loch mit 1μM FITC-markierter siRNA sowie LipofectamineTM2000, TransIT®siRNA Transfektionreagens bzw. OligofectamineTM transfiziert, wie von der Zulieferfirma beschrieben. Die Transfektioneffizienz wurde unter einem Inversionsfluoreszenzmikroskop abgeschätzt und lag um die 90-100%, 50% bzw. 0-10%. Weitere siRNA-Transfektionen wurden mit LipofectamineTM2000 und gegen die TAK1-Sequenz gerichteter siRNA, TAK1-siRNA mit drei Fehlpaarungen (als Kontrolle) oder gegen das Luciferasegen gerichteter siRNA (als Kontrolle) bei einer RNA-Endkonzentration vo 100nM durchgeführt. Aufeinanderfolgende Doppeltransfektionen wurden innerhalb von 72h durchgeführt.
  • Für die Stimulierungsexperimente wurden mit siRNA transfizierte Zellen 24h, 48h, 72h bzw. 96 Stunden nach Transfektion zur Beurteilung der für die maximale Gensuppression besten Inkubationszeit inkubiert. Vor der Stimulierung wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS) gewaschen. Für die Stimulierungsexperimente wurden die Zellen 24h mit 1 ml serumfreiem DMEM mit oder ohne 10 ng/ml menschlichem IL-1β (Roche) inkubiert.
  • RNA-Isolierung – RNA wurde aus Knorpelgewebe wie zuvor beschrieben isoliert (L.A. McKenna, A. Gehrsitz, S. Soeder, W. Eger, T. Kirchner und T. Aigner, Effective isolation of high quality total RNA from human adult articular cartilage. Anal. Biochem. 286 (2000), S. 80-85). Die Durchschnittsausbeute an RNA betrug 8.4 μg/g für normalen artikulären Knorpel und 6.7 μg/g für osteoarthritischen Knorpel. Die Qualität der isolierten RNA wurde mit Elektrophorese und Spektrophotometrie kontrolliert. Die gereinigte RNA wies ein durchschnittliches OD 260/280- Verhältnis im Bereich von 1,8-1,9 auf, und kein RNA-Abbau wurde auf mit Ethidiumbromid angefärbtem 1,2% Agarose/Formaldehyd- oder 1,2%-Agarosegelen beobachtet. Eine Anfärbung von DNA oder Protein war nicht zusehen.
  • RNA aus SW1353-Zellen wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) wie von der Zulieferfirma beschrieben isoliert.
  • TAQMAN-PCR – TAQMAN-PCR wurde zum Nachweis menschlicher TAK1 in RNA-Proben aus menschlichem artikulärem Knorpel verwendet. Die Primer (MWG Biotech, Deutschland) und die TAQMAN-Sonde (Eurogentec, Belgien) wurden mit der PRIMER EXPRESS TM-software (Perkin Elmer) konstruiert. Um quantifizierbare Ergebnisse für alle Gene erhalten zu können, wurden spezifische Standardkurven unter Verwendung sequenzspezifischer Kontrollsonden parallel zu den Analysen durchgeführt. Somit wurde für TAK1 ein genspezifisches cDNA-Fragment mit den genspezifischen Primern amplifiziert und in pGEM T Easy (Promega, Mannheim, FRG) kloniert. Zur Bestätigung der korrekten Klonierung wurde das klonierte Amplifikationsprodukt sequenziert. Klonierte Standardsonden wurden mit dem Qiagen-Amplificationskit (Qiagen, FRG) amplifiziert, linearisiert und nach sorgfältiger Abschätzung der Konzentration verwendet (Gel-Elektrophorese, UV-Spektrophotometrie sowie fluorimetrischer Assay für Ribonukleinsäuren (Picogreen; Molecular Probes, Oregon, USA)). Für die Standardkurven wurden Konzentrationen von 10, 100, 1000, 10 000, 100 000 sowie 1 000 000 Molekülen pro Assay verwendet (jeweils in Dreifachbestimmung). Alle Experimente wurden als Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Standardisierung wurde mit GAPDH als "House-Keeping"-Gen durchgeführt. Der Assay für GAPDH wurde bereits beschrieben (Gehrsitz, J of Orthopedic Research 2001: 19: 478-482).
  • LightCycler-PCR – LightCycler-PCR wurde zum Nachweis der TAK1 in menschlichen Chrondrosarkomzellproben verwendet. Die Erststrang-cDNA wurde aus schein- und siRNA-transfizierten SW1353-Zellen präpariert. RNA wurde unter Verwendung des 1st strand cDNA Synthesis Kit für RT-PCR (AMV) (Roche) (geprimed mit oligo(dT)15) gemäß dem vom Hersteller gelieferten Protokoll in cDNA reverse-transkribiert. Die QPCR wurde unter Verwendung des LightCycler- FastStart DNA Sybr Green Master I (Roche), des LightCycler-Geräts und der LightCycler-Software (Roche) sowie des folgenden Protokolls durchgeführt: 10 Minuten bei 95°C, 45 Zyklen von jeweils 95°C für 15 Sekunden, 55°C für 5 Sekunden und 72°C für 10 Sekunden, mit anschließender Schmelzkurve zur Kontrolle von Mehrfachspezies in jeder PCR-Amplificationsreaktion. Die Werte für die Expression wurden mit einer TAK1-cDNA-Standardkurve verglichen und auf die GAPDH-Expression normiert.
  • Immunoblotting – Zellysate von 200 000 wurden in 5Oμl Lysepuffer (150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 10 mM PIPES, pH6,8, 0.5 % Triton X-100, 10 mM NaF, supplementiert mit komplettem/EDTA-Proteaseinhibitor-Cocktail, Roche) sowie mit 10 Sekunden Beschallung präpariert. Die Proteine wurden auf einem 4-12% NuPAGE-Gel (Invitrogen) getrennt und danach auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen.
  • Für den Immunnachweis wurde entweder ein polyklonaler TAK1-Antikörper (M-579, SantaCruz) oder ein monoklonaler Tubulinantikörper (AB-1, Oncogene) verwendet. Kurz gesagt, die Membranen wurden mit 5% Milchpulver 0.5 h blockiert, eine h in einer 1/400-Verdünnung von Antiserum gegen TAK1 inkubiert und schließlich 1h in einer 1/2000-Verdünnung von Antiserum gegen mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Kaninchen- oder Maus-IgG (DakoCytomation) inkubiert, wobei alle Verdünnungen in TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,6, 0.1 % Tween 20) erfolgten. Die Membranen wurden unter Verwendung von ECL gemäß den Angaben des Herstellers weiterbehandelt (Amersham Pharmacia Biotech).
  • MMP1, MMP13, und TNFa ELISA – Die Zellkulturüberstände wurden geerntet und die Freisetzung von MMP1, MMP-13 (Amersham Bioscience) sowie TNFa (PromoCell) mittels ELISA gemäß dem vom Hersteller beigelegten Protokoll überwacht. Die Zellzahlen wurden mit einem CASY®1-Zellzählgerät (Schärfe System GmbH) bestimmt. Die Assay-Werte wurden auf die Zellzahlen normiert.
  • Immunohistochemie – Die Immunhistochemie wurde wie anderswo beschrieben durchgeführt (Klatt et al., Matrix Biology 2003). Kurz gesagt wurden entparaffinierte Schnitte eines Knies einer 68 Tage alten STR1/N-Maus nacheinander mit 1 Rinderserumalbumin, einem polyklonalen Kaninchen-Anti-TAK1-Antiserum (Santa Cruz, M-579), einem Biotin-SP-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG sowie mit alkalische-Phosphotase-konjugiertem Streptavidin (beide von Dianova) 60 min inkubiert. Alle Verdünnungen wurden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Die Objektträger wurden mit Fast Red TR/Naphthol (Sigma) entwickelt.
  • Figurenbeschreibungen
  • 1. Immunohistochemischer Nachweis der TAK1-Expression in der Wachstumsfuge von STR/1N-Mäusen. Der TAK-1-spezifische Antikörper zeigte starke Anfärbung in hypetrophen Chondrocyten der Wachstumsfuge einer 68 Tage alten STR/1N-Maus (B). Der Kontrollschnitt (A), der nur mit dem sekundären Antikörper behandelt worden war, zeigte keinerlei Anfäbung.
  • 2. TAK1-siRNA-Transfektion supprimiert TAK1-mRNA-Expression. SW1353-Chondrosarcomzellen wurden mit gegen das TAK1-Gen gerichteter siRNA transfiziert. Als Kontrolle wurden Zellen scheintransfiziert oder mit drei Fehlpaarungen tragender TAK1-siRNA transfiziert. Die Menge an TAK1-mRNA wurde mit QPCR 24, 48, 72 und 96 Stunden nach Transfektion quantifiziert. Die TAK1-mRNA-Niveaus der beiden Kontrollen (Fehlpaarung: graue Balken, schein: schwarze Balken) wurden bei jedem Zeitpunkt jeweils gleich 100% gesetzt, so daß die Balken die Suppression von TAK-1 gegenüber beiden Kontrolltransfektionen wiedergeben.
  • 3. TAK1-Gensuppression führt zu geringeren TAK1-Proteinniveaus. Die Lysate von mit gegen das TAK1-Gen gerichteter siRNA transfizierten (TAK1), mit der Drei-Fehlpaarungen-siRNA transfizierten (3MM) oder scheintransfizierten (Mock) SW1353-Chondrosarcomzellen wurden einer SDS-PAGE sowie einem Immunoblotting unterzogen. Der Immunoblot wurde mit einem Antikörper gegen TAK1-Protein bzw. mit einem Antikörper gegen Tubolin als Kontrolle entwickelt. 48, 72 und 96 h nach Transfektion waren die Niveaus der TAK-1-Proteinexpression in TAK-1-behandelten Zellen reduziert, jedoch nicht in den Schein- und Fehlpaarungbehandelten Zellen.
  • 4. TAK1-Genesuppression reduziert IL1-stimulierte MMP-13-Freisetzung. Zunächst wurden SW1353-Zellen 48, 72 oder 96 h mit TAK-1-siRNA zur Supprimierung der TAK-1-Genexpression transfiziert. In einem zweiten Schritt wurden die transfizierten Zellen dann 24 Stunden mit IL1β zur Induktion der IL1β-abhängigen Expression von MMP-13 stimuliert. Die IL1-stimulierte MMP13-Freisetzung wurde mittels ELISA im Überstand der Zellen bestimmt. Die MMP-13-Freisetzung der Fehlpaarung- und Scheinkontrolle wurde (an jedem Zeitpunkt) gleich 100% gesetzt, wobei die nach TAK-1-Gensuppression erhaltene MMP13-Fresetzung auf die Drei-Fehlpaarungen-Kontrolle (hell) und die Scheinkontrolle (dunkel) bezogen wurde. Die stärkste Reduzierung der IL1-induzierten MMP13-Freisetzung wurde 72 Stunden nach Transfektion erhalten. Bei den Werten der MMP13-Freisetzung 72 Stunden nach Transfektion handelt es sich um Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten.
  • 5. TAK1-Genesuppression reduziert IL1-stimulierte TNFα- und MMP-1-Freisetzung. SW1353-Chondrosarcomzellen wurden mit gegen das TAK1-Gen gerichteter siRNA transfiziert. Als Kontrolle wurden Zellen mit drei Fehlpaarungen tragender TAK1-siRNA oder mit gegen das Luciferasegen (nicht exprimiert in Säugerzellen) gerichteter siRNA transfiziert. Die Transfektion wurde nach 72 Stunden wiederholt, um den Effekt der Genexpression zu verlängern und zu verstärken. 72 Stunden nach der zweiten Transfektion wurden die Zellen 24 Stunden mit IL1β stimuliert und die Freisetzung von MMP-13, TNFα und MMP-1 mittels ELISA im Überstand der Zellen bestimmt. Die Werte der Kontrollen wurden gleich 100% gesetzt, und die mit TAK1-siRNA erhaltenen Werte wurden auf die Drei-Fehlpaarungen-Kontrolle (3MM) sowie die Luciferase-Kontrolle (Luci) bezogen. Die durch Vergleich mit der Fehlpaarung-Kontrolle erhaltenen Werte sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten.
  • 6. Funktion der TAK1 im Signalweiterleitungsweg pro inflammatorischer Zytokine.
  • 7. SEQ ID No.1 (hs TAK1-Isoform A, cds; NM_003188)
  • 8. SEQ ID No.2 (hs TAK1 -Isoform B, cds; NM_145331)
  • 9. SEQ ID No.3 (hs TAK1-Isoform C, cds; NM_145332)
  • 10. SEQ ID No.4 (hs TAK1-Isoform D, cds; NM_145333)
  • 11. SEQ ID No.5 (hs TAK1-Isoform A, Aminosäuresequenz; Kinasedomäne AS 43 bis 295 rot gekennzeichnet)
  • 12. SEQ ID No.6 (hs TAK1-Isoform B, Aminosäuresequenz)
  • 13. SEQ ID No.7 (hs TAK1-Isoform C, Aminosäuresequenz)
  • 14. SEQ ID No.8 (hs TAK1-Isoform D, Aminosäuresequenz)
  • 15. SEQ ID No.9 (Fragment der hs TAK1-Isoform A Aminosäuresequenz, umfassend die Kinasedomäne AS 36 bis 291)
  • 16. Schematische Darstellung der von den TAK1-mRNA-Spleißvarianten codierten Proteine nach Dempsey CE, Sakurai H, Sugita T, Guesdon F. Alternative splicing and gene structure of the transforming growth factor beta-activated kinase 1. Biochim Biophys Acta. 2000 Dec 15;1517(1):46-52. Die graue Box in der Nähe des aminoterminalen Endes repräsentiert die katalytische Domäne. Die von den zwei translativen Exons codierten Bereiche sind in schwarz gezeigt. Die beiden aufgrund der Translation von Exon 17 in alternativen Leserastern produzierten unterschiedlichen carboxyterminalen Sequenzen sind in dunkelgrau (Varianten a und b) bzw. hellgrau (Varianten c und) gezeigt.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (27)

  1. Verwendung eines TAK1-Proteins, eines funktionellen Derivats oder Fragments davon oder einer für das Protein, Derivat oder Fragment codierenden Nukleinsäure zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen.
  2. Verfahren zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen, bei dem man: a. ein TAK1-Polypeptid mit einem putativen Antagonisten/Inhibitor in Kontakt bringt; und b. bestimmt, ob der putative Antagonist/Inhibitor die Aktivität des TAK1-Polypeptids hemmt.
  3. Verfahren zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen, bei dem man a. eine für ein TAK1-Protein, ein Derivat oder Fragment davon codierende Nukleinsäure mit einer Substanz in einem transkriptionsaktiven System in Kontakt bringt; b. die in dem System in Gegenwart der Substanz produzierte Menge an für das TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment codierender mRNA bestimmt; c. die in dem System in Abwesenheit der Substanz produzierte Menge an für das TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment codierender mRNA bestimmt; d. bestimmt, ob die Substanz zur Reduzierung der in dem System produzierten Menge an TAK1-mRNA fähig ist.
  4. Verfahren zur Identifizierung von bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenschwund wirksamen Substanzen, bei dem man a. eine für ein TAK1-Protein, ein Derivat oder Fragment davon codierende Nukleinsäure mit einer Substanz in einem tranlationsaktiven System in Kontakt bringt; b. die in dem System in Gegenwart der Substanz produzierte Menge an TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment bestimmt; c. die in Abwesenheit der Substanz in dem System produzierte Menge an TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment bestimmt; d. bestimmt, ob die Substanz zur Reduzierung der in dem System produzierten Menge an TAK1-Protein, -Derivat oder -Fragment fähig ist.
  5. Screen mit hohem Durchsatz, beruhend auf einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 5, wobei es sich bei der verwendeten TAK1, dem Derivat oder Fragment davon um ein isoliertes Molekül handelt.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei TAK1, das Derivat oder Fragment davon in einem biochemischen oder zellulären Assay verwendet wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Assay um einen biochemischen oder zellulären Assay handelt.
  9. Verwendung nach Anspruch 1, Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 5, wobei es sich bei TAK1 um menschliche TAK1 handelt.
  10. Verwendung nach Anspruch 1 oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 5, wobei es sich bei TAK1 oder dem Derivat oder Fragment davon um ein Polynukleotid handelt.
  11. Verwendung oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 10 oder Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Polynukleotid eine der folgenden Sequenzen umfaßt oder daraus besteht: a. Eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 4; b. Eine zur Hybridisierung mit einer Sequenz gemäß a) unter Stringenzbedingungen fähige Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert; c. Eine aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von einer Sequenz gemäß a) oder b) abgeleitete Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert; d. Ein Fragment einer der Sequenzen gemäß a), b) oder c), das für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert und für ein die Sequenz gemäß SEQ ID No 9 umfassendes oder daraus bestehendes Polypeptid codiert; e. Eine mittels eines Austauschs einer oder mehrerer Nukleotide von einer der Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) abgeleitete Sequenz, wobei der Nukleotidaustausch nicht oder nicht ausschließlich auf die Degeneriertheit des genetischen Codes zurückzuführen ist und die Sequenz für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert.
  12. Verwendung nach Anspruch 1 oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 5, wobei es sich bei TAK1 oder dem Derivat oder Fragment davon um ein Polypeptid handelt.
  13. Verwendung oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 12 oder Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, wobei das Polypeptid durch eine der folgenden Sequenzen codiert ist: a. Eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 4; b. Eine zur Hybridisierung mit einer Sequenz gemäß a) unter Stringenzbedingungen fähige Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert; c. Eine aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von einer Sequenz gemäß a) oder b) abgeleitete Sequenz, die für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert; d. Ein Fragment einer der Sequenzen gemäß a), b) oder c), das für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert; e. Eine mittels eines Austauschs einer oder mehrerer Nukleotide von einer der Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) abgeleitete Sequenz, wobei der Nukleotidaustausch nicht oder nicht ausschließlich auf die Degeneriertheit des genetischen Codes zurückzuführen ist und die Sequenz für ein Polypeptid mit TAK1-Funktion codiert.
  14. Verwendung oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 13 oder Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, wobei das Polypeptid eine der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 5 bis 8 umfaßt oder daraus besteht.
  15. Verwendung oder Screen mit hohem Durchsatz nach Anspruch 14 oder Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, wobei das funktionelle Fragment oder Derivat eine Sequenz gemäß SEQ ID No. 9 umfaßt oder daraus besteht.
  16. Inhibitor der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 (TAK1) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Knochenschwund.
  17. Verwendung eines Inhibitors der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 (TAK 1) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Knochenschwund.
  18. Verwendung, Verfahren, Screen mit hohem Durchsatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Behandlung um eine symptom- oder ursachengerichtete Maßnahme handelt.
  19. Verwendung, Verfahren oder Screen mit hohem Durchsatz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Knochenschwund um Osteoporose handelt.
  20. Inhibitor der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 (TAK1) zur Verwendung als Arzneimittel zur Vorbeugung oder Behandlung von Schmerzen im Zusammenhang mit Knochenschwund.
  21. Verwendung eines Inhibitors der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 (TAK1) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Schmerzen im Zusammenhang mit Knochenschwund.
  22. Inhibitor nach Anspruch 20 oder Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Schmerzen im Zusammenhang mit Osteoporose stehen.
  23. Inhibitor oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 16 oder 17 bis 21, wobei es sich bei TAK1 um menschliche TAK1 handelt.
  24. Inhibitor oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 16 oder 17 bis 23, wobei es sich bei dem TAK1-Inhibitor um ein chemisches Molekül oder einen Naturproduktextrakt, ein gegen TAK1 gerichtetes Bindungsprotein oder Bindungspeptid oder eine gegen das TAK1-Gen gerichtete Nukleinsäure handelt.
  25. Inhibitor oder Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem Inhibitor TAK1 um 5Z-7-Oxozeaenol handelt.
  26. Inhibitor oder Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem Bindungsprotein oder Bindungspeptid um einen Antikörper, einen Antigen bindenden Teil eines Antikörpers oder ein Proteingerüst gegen TAK handelt.
  27. Inhibitor oder Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich bei der Nukleinsäure um eine Antisense-Nukleinsäure, ein Aptamer, eine siRNA oder ein Ribozym handelt.
DE200410025362 2004-05-19 2004-05-19 Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1 Withdrawn DE102004025362A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200410025362 DE102004025362A1 (de) 2004-05-19 2004-05-19 Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200410025362 DE102004025362A1 (de) 2004-05-19 2004-05-19 Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102004025362A1 true DE102004025362A1 (de) 2005-12-22

Family

ID=35432997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE200410025362 Withdrawn DE102004025362A1 (de) 2004-05-19 2004-05-19 Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102004025362A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008007072A2 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Astrazeneca Ab Methods for cancer treatment using tak1 inhibitors

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008007072A2 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Astrazeneca Ab Methods for cancer treatment using tak1 inhibitors
WO2008007072A3 (en) * 2006-07-10 2008-05-08 Astrazeneca Ab Methods for cancer treatment using tak1 inhibitors

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ferrari et al. Bone response to intermittent parathyroid hormone is altered in mice null for β-arrestin2
DE60314236T2 (de) Verfahren zur diagnose und therapie von schizophrenie
Fukai et al. Akt1 in murine chondrocytes controls cartilage calcification during endochondral ossification under physiologic and pathologic conditions
JP5128273B2 (ja) 未分化哺乳動物細胞の分化を骨芽細胞へと誘導するための方法、作用物質、及び化合物スクリーニングアッセイ
Squarzoni et al. Interleukin‐6 neutralization ameliorates symptoms in prematurely aged mice
JP2010517511A (ja) 抗糖尿病化合物のスクリーニング方法
CN103945868A (zh) 骨生成促进剂
Bouleftour et al. Deletion of OPN in BSP knockout mice does not correct bone hypomineralization but results in high bone turnover
CN115066498A (zh) Pcsk9的拮抗剂
Evangelisti et al. Modulation of TGFbeta 2 levels by lamin A in U2-OS osteoblast-like cells: understanding the osteolytic process triggered by altered lamins
Pintus et al. Reduced vasorin enhances angiotensin II signaling within the aging arterial wall
Camera et al. Learning, memory and long-term potentiation are altered in Nedd4 heterozygous mice
DE602004008658T2 (de) Behandlung neurodegenerativer krankheiten
DE602004013202T2 (de) Behandlung neurodegenerativer krankheiten durch verwendung von scd4-inhibitoren
EP2275116A1 (de) Verwendung von Pak-inhibitoren zur Behandlung von Gelenkerkrankungen
Lee et al. c-JUN expression and apoptotic cell death in kainate-induced temporal lobe epilepsy
US8187828B2 (en) Use of PAK inhibitor for the treatment of a joint disease
Takahashi et al. Ultraviolet B irradiation induces apoptosis of keratinocytes by direct activation of Fas antigen
DE102004025362A1 (de) Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1
DE102004025360A1 (de) Verwendung der TGFbeta-aktivierten Kinase 1
WO2004094641A2 (en) A novel method of modulating bone-realted activity
Castillo-Badillo et al. Sphingosine 1-phosphate-mediated α1B-adrenoceptor desensitization and phosphorylation. Direct and paracrine/autocrine actions
JP2007517498A (ja) 骨形態形成タンパク質（ｂｍｐ）２ａ及びその使用
CN116261461A (zh) 刺激细胞增殖的方法
DE60219164T2 (de) Polypeptid mit zelltodhemmender wirkung

Legal Events

Date Code Title Description
R005 Application deemed withdrawn due to failure to request examination

Effective date: 20110519