DE102004004115B4

DE102004004115B4 - Mikroskopsystem und Verfahren zur Shading-Korrektur der im Mikroskopsystem vorhandenen Optiken

Info

Publication number: DE102004004115B4
Application number: DE102004004115.6A
Authority: DE
Inventors: Frank Olschewski; Jochen Nickel; William C. Hay
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2004-01-28
Filing date: 2004-01-28
Publication date: 2016-08-18
Anticipated expiration: 2024-01-29
Also published as: WO2005073776A1; DE102004004115A1; EP1709473A1; JP2007519962A; US20070076232A1

Abstract

Ein Mikroskopsystem (1) mit mindestens einer im Mikroskopsystem (1) vorhandenen Optik (9), die ein Beleuchtungsfeld (46) definiert, mindestens einer Lichtquelle (3), die einen Beleuchtungslichtstrahl (5) emittiert, der durch die Optik (9) hindurch eine Probe (10) beleuchtet, mindestens einem Detektor (20), der einen von der Probe (10) ausgehenden Detektionslichtstrahl (12) pixelweise detektiert, einer, dem Detektor (20) nachgeschalteten, elektronischen Schaltung (14) mit einer Speichereinheit (15), in der eine wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfelds (46) der im Mikroskopsystem (1) vorhandenen Optiken (9) abgelegt ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein ansteuerbares Element (13) vorgesehen ist, das die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls (5) pixelweise in Abhängigkeit von der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung steuert, so dass das Beleuchtungsfeld (46) homogen beleuchtet ist, und dass die elektronische Schaltung (14) pixelweise die mit dem Detektor (20) aufgenommenen Daten mit der abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart verrechnet, dass ein homogen ausgeleuchtetes Bildfeld (40) entsteht.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskopsystem. Im besonderen betrifft die Erfindung ein Mikroskopsystem mit mindestens einer im Mikroskopsystem vorhandenen Optik, die ein Beleuchtungsfeld definiert, mindestens einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl emittiert, der durch die Optik hindurch eine Probe beleuchtet, mindestens ein Detektor, der einen von der Probe ausgehenden Detektionslichtstrahl pixelweise detektiert, einer, dem Detektor nachgeschalteten, elektronischen Schaltung mit einer Speichereinheit, in der eine wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeld der im Mikroskopsystem vorhandenen Optiken abgelegt.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Shading-Korrektur von mindestens einer im Mikroskopsystem vorhandenen Optik, die ein Beleuchtungsfeld definiert, mindestens einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl emittiert, der durch die Optik hindurch eine Probe beleuchtet und mindestens einen Detektor umfasst.
Das U.S. Patent US 6 355 919 B1 offenbart ein Verfahren zur Kalibrierung eines Scanmikroskops. Dabei kann die Kalibrierung des Scanmikroskops beliebig oft ausgeführt werden. Die Mittel zur Kalibrierung sind in einer Ebene eines Zwischenbildes angeordnet und können vom scannenden Lichtstrahl abgetastet werden. Die Mittel zur Kalibrierung sind außerhalb des aktuellen Bildfeldes angeordnet und sind als Referenzstrukturen ausgebildet. Hiermit ist jedoch kein Ausgleich der Bildfeldwölbung möglich.
Aus WO 2002/005 549 A1 ist eine Fotokamera mit einem speziellen Beleuchtungssystem bekannt. Das Beleuchtungssystem ist dazu ausgebildet, die Beleuchtungsverhältnisse an die jeweils zu fotografierende Szene anzupassen, um beispielsweise unterschiedliche Bereiche der Szene mit unterschiedlicher Lichtintensität und/oder unterschiedlicher Lichtfarbe zu beleuchten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Mikroskopsystem zu schaffen, mit dem eine Abbildung und eine Beleuchtung erzielbar ist, die eine Korrektur der durch die Bildfeldwölbung hervorgerufene Randverdunklung ausgleicht.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskopsystem, das die Merkmale des Anspruchs 1 umfasst.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zu schaffen, mit dem Shading-Effekte der Optik eines Mikroskopsystems eliminiert werden können.
Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 17 aufweist.
Es ist vorteilhaft, wenn das Mikroskopsystem mit mindestens einer im Mikroskopsystem vorhandenen Optik, die ein Beleuchtungsfeld definiert, versehen ist. Ferner ist mindestens Lichtquelle im Mikroskopsystem vorgesehen, die einen Beleuchtungslichtstrahl emittiert, der durch die Optik hindurch eine Probe beleuchtet. Ebenso ist mindestens ein Detektor implementiert, der einen von der Probe ausgehenden Detektionslichtstrahl pixelweise detektiert. Eine dem Detektor nachgeschaltete elektronische Schaltung dient zur Bearbeitung der vom Detektor aufgenommenen Bilddaten. In einer Speichereinheit ist eine wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeldes der im Mikroskopsystem vorhandenen Optiken abgelegt. Ein ansteuerbares Element ist im Beleuchtungslichtstrahl vorgesehen, das die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls pixelweise in Abhängigkeit von der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung steuert, so dass das Beleuchtungsfeld homogen beleuchtet ist. Die elektronische Schaltung verrechnet pixelweise die abgelegte, wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung derart, dass ein homogen ausgeleuchtetes Bildfeld entsteht.
Das ansteuerbare Element im Beleuchtungslichtstrahl ist eine LCD-Matrix, deren einzelnen Pixel entsprechend der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung angesteuert sind. In einer Ausführungsform ist der Detektor ein CCD-Chip.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine Scaneinrichtung im Beleuchtungslichtstrahl des Mikroskopsystems vorgesehen, die den Beleuchtungslichtstrahl pixelweise über oder durch die Probe führt. Das ansteuerbare Element im Beleuchtungslichtstrahl ist ein akustooptisches Element ist, das in Abhängigkeit von der in der Speichereinheit abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart ansteuerbar ist, dass das aus den einzelnen Pixel zusammengesetzte Beleuchtungsfeld eine homogene Helligkeitsverteilung aufweist. Das akustooptische Element ist ein AOTF, oder ein AOBS, oder ein AOM.
Das Mikroskopsystem kann mit unterschiedlichen Lichtquellen, wie z.B. einem Laser, einem Mehrlinien-Laser oder einem Laser, der ein kontinuierliches Wellenlängenspektrum aussendet, ausgestattet sein.
Wird ein Laser mit der Scaneinrichtung verwendet, ist der Detektor des Mikroskopsystems mindestens ein lichtempfindliches Element, das seriell die Pixel des Beleuchtungsfeldes auf der Probe aufnimmt. Die elektronische Schaltung setzt die einzelnen Pixel zu einem Bildfeld zusammen, das mit der entsprechenden, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung verrechenbar ist.
Verfahren zur Shading-Korrektur ist gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• Hinterlegen der wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung in einer RAM-Tabelle
• pixelweises Ansteuern eines Elements mit einer wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeldes der Optik, derart dass das Beleuchtungsfeld homogen beleuchtet ist;
• pixelweises Aufnehmen des von der Probe ausgehenden Detektionslichtstrahls; und
• Verrechnen des mit der Optik aufgenommenen Bildfeldes mit der wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeldes der Optik.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung können den Unteransprüchen entnommen werden.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einem ansteuerbaren Element im Beleuchtungslichtstrahl;
2 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops mit einem ansteuerbaren Element im Beleuchtungslichtstrahl;
3 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des Scanmikroskops mit einer Steuerschaltung zur Veränderung der Intensität des von der Lichtquelle ausgehenden Beleuchtungslichtstrahls;
4a eine schematische Darstellung der Helligkeitsverteilung für ein Bildfeld;
4a eine schematische Darstellung der Helligkeitsverteilung für ein Beleuchtungsfeld;
5 eine schematische Darstellung eines Flächensensors zum Aufnehmen des von der Probe ausgehenden Detektionslichtstrahls; und
6 eine schematische Darstellung des ansteuerbaren Elements, bei dem die einzelnen Pixel entsprechend der Helligkeitsverteilung für eine Wellenlänge angesteuert sind.
In 1 beschreibt schematisch ein Mikroskopsystem 1. Die hier dargestellte Ausführungsform des Mikroskopsystems umfasst ein Auflichtmikroskop. Es ist selbstverständlich, dass das Mikroskopsystem 1 ebenfalls ein Durchlicht Mikroskop oder eine umschaltbare Konfiguration aus beiden Beleuchtungsarten umfasst. In der schematischen Darstellung des Mikroskops sind nur diejenigen Bestandteile gezeigt, die für die Beschreibung wesentlich sind. Alle übrigen Elemente oder Bestandteile, wie z.B. Stativ, Objektivrevolver, Tubus Okular, Kamera, Kameratubus etc., sind einem Fachmann hinlänglich bekannt und brauchen somit hier nicht ausdrücklich erwähnt werden. Das Mikroskop umfasst mindestens eine Lichtquelle 3, die einen Beleuchtungslichtstrahl 5 emittiert, der in 1 als eine durchgezogene Linie dargestellt ist. In der hier dargestellten Ausführungsform ist ein Stahlumlenkmittel 7 vorgesehen, das den Beleuchtungslichtstrahl 5 auf eine in der Arbeitsposition befindliche Optik 9 lenkt. Die Optik 9 ist über einer Probe 10 angeordnet, die sich ihrerseits auf einem Objektträger 11 Träger befindet. Es ist einem Fachmann hinlänglich bekannt, dass der Objektträger 11 auf einen verfahrbaren Tisch positioniert sein kann. Der Einfachheit halber ist der Tisch hier nicht dargestellt. In der hier beschriebenen Ausführungsform handelt es sich um ein Auflichtmikroskop, so dass das von der Probe 10 ausgehende Licht von der Optik 9 auf mindesten einen Detektor 20 abgebildet wird. Der Detektor 20 und die Optik 9 sind im Detektionslichtstrahl 12 angeordnet. Der Detektionslichtstrahl 12 ist als gestrichelte Linie dargestellt. Lässt man bei einer Optik, einem so genannten Linsensystem, alle Aberrationen, wie z.B. Astigmatismus, Farblängsfehler, Farbquerfehler etc., außer Acht, so wird immer nur eine gekrümmte Fläche auf eine andere gekrümmte Fläche abgebildet. Dies wird auch als Bildfeldwölbung bezeichnet. Diese Gegebenheit gilt für einzelne Objektive und ganze Mikroskopsysteme und führt zu einem Shading-Effekt bei aufgenommenen Bildern. In 4a ist ein Bildfeld 40 dargestellt. Jedes Bildfeld 40 wird von einem Mittelpunkt 41 aus gemessen immer dunkler, d.h. die Intensität des aufgenommenen Bildfeldes 40 oder auch die Intensität des Beleuchtungsfeldes nimmt vom Mittelpunkt 41 nach außen hin ab. Dieser Abfall der Intensität vom Mittelpunkt 41 nach außen hin ist ebenfalls von der Wellenlänge abhängig. Das Bildfeld 40 ist z.B. rechteckig und auf eine erste und die zweite Langseite 42a und 42b bzw. auf eine erste und zweite Kurzseite 43a und 43b hin nimmt die Intensität ab. Ein ansteuerbares Element 13 ist im Beleuchtungslichtstrahl 5 und im Detektionslichtstrahl 12 vorgesehen. Das ansteuerbares Element 13 ist mit einer elektronischen Schaltung 14 verbunden, die mit einer Speichereinheit 15 versehen ist. In der Speichereinheit 15 ist eine wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung, wie z.B. in 4a) des Beleuchtungsfeldes der im Mikroskopsystem vorhandenen Optiken 9 abgelegt. Ebenso kann die elektronische Schaltung 14 auch mit der Optik 9 oder dem Revolver verbunden sein, damit die elektronische Schaltung 14 ständig Information über die momentan im Beleuchtungs- oder Detektionslichtstrahl befindliche Optik 9 erhält. Es ist für jeden Fachmann klar, dass unterschiedliche Optiken unterschiedliches Shading zeigen. Die elektronische Schaltung 14 dient dazu die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls 4 pixelweise in Abhängigkeit von der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung zu steuern. Das ansteuerbare Element 13 wird mit der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart angesteuert, dass das Beleuchtungsfeld 46 (siehe 4b) homogen ist und keinen Abfall der Intensität zu den Langseiten 42a, 42b und/oder den Kurzseiten 43a, 43b hin zeigt. Der von der Probe 9 ausgehende Detektionslichtstrahl 12 wird mit der in der Speichereinheit 15 gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart verrechnet, dass ein homogen ausgeleuchtetes Bildfeld 40 entsteht. Der von der Probe ausgehende Detektionslichtstrahl 12 wird vom Detektor 20, der ein CCD-Chip ist, pixelweise detektiert. Diese Daten werden der elektronischen Schaltung 14 zugeführt, die dann in Abhängigkeit von der Wellenlänge die gespeicherte Helligkeitsverteilung mit der gemessenen Helligkeitsverteilung verrechnet.
In 2 zeigt den schematischen Aufbau eines Scanmikroskops 100, in dem die erfindungsgemäße Idee Verwendung findet. Der von mindestens einer Lichtquelle 3 kommende Beleuchtungslichtstrahl 5 wird auf ein ansteuerbares Element 13 gerichtet. Vom ansteuerbaren Element 13 aus gelangt der Beleuchtungslichtstrahl 5 zu einem Scaneinrichtung 16 geleitet. In der hier offenbarten Ausführungsform umfasst die Scaneinrichtung 16 einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 18, der den Beleuchtungslichtstrahl 3 durch eine Scanoptik 19 und eine Optik 9 hindurch über bzw. durch eine Probe 10 führt. Der Beleuchtungslichtstrahl 5 wird bei nicht transparenten Proben 10 über die Probenoberfläche geführt. Bei biologischen Proben 10 (Präparaten) oder transparenten Proben 10 kann der Beleuchtungslichtstrahl 5 auch durch die Probe 15 geführt werden. Um den Kontrast zu erhöhen werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem geeigneten Farbstoff präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in der Probe 10 vorhandenen Farbstoffe werden durch den Beleuchtungslichtstrahl 5 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Dieses vom der Probe ausgehende Licht definiert einen Detektionslichtstrahl 12. Dieser gelangt durch die Optik 9, die Scanoptik 19 und über die Scaneinrichtung 16 zum ansteuerbaren Element 13, passiert dieses unbeeinflusst und gelangt über z.B. ein Detektionspinhole 21 auf mindestens einen Detektor 20, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z.B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren eingesetzt werden können. Der von der Probe 10 ausgehende bzw. definierte Detektionslichtstrahl 12 ist in 2, wie in 1 als gestrichelte Linie dargestellt. Im Detektor 20 werden elektrische, zur Leistung des von der Probe 9 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, von der Probe 9 nicht nur Licht einer Wellenlänge ausgesandt wird, ist es sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor 20 ein Selektionsmittel für das von der Probe 9 ausgehende Spektrum einzufügen. Das Selektionsmittel ist in der hier gezeigten Ausführungsform ein SP Modul 23. Das SP Modul 23 ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda Scan aufnehmen kann, d.h., das alle von der Lichtquelle 3 aussandten Wellenlängen aufgezeichnet werden können. Ebenso können mehrere von der Probe 9 ausgehende Wellenlängen räumlich getrennt und gegebenenfalls auch zeitlich parallel aufgezeichnet werden. Die vom Detektor 20 erzeugten Daten werden an die elektronische Schaltung 14 weitergegeben. Der elektronischen Schaltung 14 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet. Das Peripheriegerät 27 kann z.B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops oder den aktuellen Setup erhält und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit der elektronischen Schaltung 14 die Speichereinheit 15 verbunden, in der, wie bereits beschrieben, die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung, wie z.B. in 3b, des Beleuchtungsfeldes 46 der im Mikroskopsystem 1 vorhandenen Optiken 9 abgelegt ist.
Durch das SP-Modul 23 wird der Detektionslichtstrahl 12 wird mit einem Prisma 31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35, die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden zusammen als SP-Modul 23 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
Die Scaneinrichtung 16 führt den Beleuchtungslichtstrahl 5 pixelweise über oder durch die Probe 9. Das ansteuerbare Element 13 im Beleuchtungslichtstrahl 5 ist ein akustooptisches Element, das in Abhängigkeit von der in der Speichereinheit 15 abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart ansteuerbar ist, dass das aus den einzelnen Pixel zusammengesetzte Beleuchtungsfeld 46 eine homogene Helligkeitsverteilung aufweist. Das akustooptische Element 13 ist ein AOTF, oder ein AOBS, oder ein AOM. Die Lichtquelle 3 besteht aus mindestens einem Laser, der den Beleuchtungslichtstrahl 5 erzeugt. Der mindestens eine Laser kann ein Mehrlinien-Laser sein. Ebenso ist es denkbar, dass der Laser ein kontinuierliches Wellenlängenspektrum aussendet, so dass die Probe 9 entweder mit einem kontinuierlichen Wellenlängenspektrum beleuchtet wird oder der Benutzer beliebige Wellenlängen aus dem kontinuierlichen Wellenlängenspektrum zur Beleuchtung der Probe 9 auswählt.
3 zeigt eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des Scanmikroskops 100 mit einer Steuerschaltung 60 zur Veränderung der Intensität des von der Lichtquelle 3 ausgehenden Beleuchtungslichtstrahls 5. Gleiche Elemente, wie bereits in der Beschreibung zu 2 beschreiben, sind mit dem gleichen Bezugszeichen bezeichnet. Die Lichtquelle 3, die als Mehrlinienlaser ausgebildet ist, ist mit der Steuerschaltung 60 versehen, so dass die Intensität des vom Laser ausgehenden Beleuchtungslichts in Abhängigkeit von der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung gesteuert ist. Das Beleuchtungsfeld 46 (siehe 4b) ist dann homogen ausgeleuchtet und zeigt keinen Abfall der Intensität zu den Langseiten 42a, 42b und/oder den Kurzseiten 43a, 43b hin. Die in der Probe 10 vorhandenen Farbstoffe werden durch den Beleuchtungslichtstrahl 5 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Dieses von der Probe ausgehende Licht definiert einen Detektionslichtstrahl 12. Dieser gelangt durch die Optik 9, die Scanoptik 19 und über die Scaneinrichtung 16 zu einem Wellenlängen selektiven Element 63, passiert dieses unbeeinflusst und gelangt über z.B. über ein Detektionspinhole 21 auf mindestens einen Detektor 20, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Anderen Ausführungen des Detektors sind bereits in der Beschreibung zu 2 erwähnt.
5 zeigt eine schematische Darstellung des Detektors 20, der in dieser Ausführungsform als ein Flächensensor 44 zum Aufnehmen des von der Probe 10 ausgehenden Detektionslichtstrahls 12 ausgebildet ist. Der Flächensensor 44 umfasst mehrere Pixel 45 _1,1, 45 _1,2, 45 _1,3, ..., 45 _n,m-1, 45 _n,m die in einer Fläche angeordnet sind. Das von der Probe 10 ausgehende Licht wird von der Optik 9 auf den Flächensensor 44 wird. Die einzelnen Pixel 45 _1,1, 45 _1,2, 45 _1,3, ..., 45 _n,m-1, 45 _n,m registrieren die Intensität, wobei dieser der Shading-Effekt der Optik 9 überlagert ist. In der Speichereinheit 15 ist die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung abgelegt und die elektronische Schaltung 14 verrechnet die mit dem Detektor 20 aufgenommenen Daten mit der wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung, so dass das aufgenommene Bildfeld 40 bei der Wellenlänge λ_n homogen beleuchtet ist.
6 zeigt eine schematische Darstellung des ansteuerbaren Elements 13, bei dem die einzelnen Pixel 50 _1,1; 50 _1,2; 50 _1,3; ...; 50 _n,m-1; 50 _n,m entsprechend der Helligkeitsverteilung für eine Wellenlänge angesteuert sind. Die den einzelnen Pixel 50 _1,1; 50 _1,2; 50 _1,3; ...; 50 _n,m-1; 50 _n,m zugeordneten Grauwerte stellen in der Gesamtübersicht den durch die Optik 9 verursachten Shading-Effekt dar. Dies ist die Negativdarstellung für die Ansteuerung der einzelnen Pixel 50 _1,1; 50 _1,2; 50 _1,3; ...; 50 _n,m-1; 50 _n,m. Die bedeutet, dass die Pixel 50 _1,1; 50 _1,2; 50 _1,3; ...; 50 _n,m-1; 50 _n,m in Abhängigkeit von Grauwert invers angesteuert werden, d.h. je dunkler die Pixel 50 _1,1; 50 _1,2; 50 _1,3; ...; 50 _n,m-1; 50 _n,m sind desto geringer ist die durch die Ansteuerung verursachte Abschattung. Wie bereits erwähnt, ist die Ansteuerung des ansteuerbaren Element 13 derart, dass das Beleuchtungsfeld 46 auf der Probe 10 homogen ausgeleuchtet ist.
Beleuchtet ein Laserstahl die Probe 10 meanderförmig, so dass die Probe beleuchtet 10, d.h. das Beleuchtungsfeld zeitlich nacheinander, mit einer Vielzahl von Bildpunkten überdeck ist. Eine Scaneinrichtung 16 führt den Beleuchtungslichtstrahl 5 pixelweise über oder durch die Probe 10, um ein homogen ausgeleuchtetes Beleuchtungsfeld 46 zu erhalten, ist das ansteuerbare Element 13 im Beleuchtungslichtstrahl 5 ein akustooptisches Element 13. Entsprechend der Darstellung in 5 wird das akustooptische Element 13 ebenfalls invers angesteuert. Dies bedeutet, dass je größer der Grauwert aufgrund des Shadings ist, muss der Laserstrahl, wenn er diese Position erreicht, mit einer höheren Intensität beaufschlagt werden. Dies erfolgt in Abhängigkeit von der in der Speichereinheit 15 abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart, dass das aus den einzelnen Pixel zusammengesetzte Beleuchtungsfeld 46 eine homogene Helligkeitsverteilung aufweist.
Wie bereits oben erwähnt tritt der Shading-Effekt auf. Den Shading-Effekt kann man mit f(x, y, λ) beschrieben werden. Dabei ist x die X-Position und y die Y-Position des einzelnen Pixels im Beleuchtungsfeld. Es ist besonders vorteilhaft, wenn die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung als ein Model dargestellt wird. Die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung bzw. die Abschwächung lässt sich für jede Wellenlänge als Funktional darstellen. Dabei wird F(x, y) = a + bx + cy + dxy + ex² + fy² als gute Näherung angesehen, wobei die Koeffizienten von der Wellenlänge abhängig sind. Es gilt a(λ), b(λ), c(λ), d(λ), e(λ), f(λ). Es ist dem Fachmann hinreichend klar, das auch höhere polynominelle Modelle genutzt werden können. Ein Beleuchtungsmuster, das den Shading-Effekt korrigiert ist dann: G(x, y) = F^–1(x – x0, y – y0) welches in dem Sinne die Beleuchtungscharakterisitk anhebt wo die Optik eine Dämpfung verursacht, dabei steht die Verschiebung x0, y0 für die Qualität der Justage. Läuft der Laser z.B. nicht zentral in Beleuchtungsfeld 46 auf die Probe 10, dann kann diese Dejustage auch bei der Ermittlung der wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung berücksichtigt werden. Das System wendet dann die entsprechende Korrektur bei der Beleuchtung der Probe 10 an.

Claims

Ein Mikroskopsystem (1) mit mindestens einer im Mikroskopsystem (1) vorhandenen Optik (9), die ein Beleuchtungsfeld (46) definiert, mindestens einer Lichtquelle (3), die einen Beleuchtungslichtstrahl (5) emittiert, der durch die Optik (9) hindurch eine Probe (10) beleuchtet, mindestens einem Detektor (20), der einen von der Probe (10) ausgehenden Detektionslichtstrahl (12) pixelweise detektiert, einer, dem Detektor (20) nachgeschalteten, elektronischen Schaltung (14) mit einer Speichereinheit (15), in der eine wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfelds (46) der im Mikroskopsystem (1) vorhandenen Optiken (9) abgelegt ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein ansteuerbares Element (13) vorgesehen ist, das die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls (5) pixelweise in Abhängigkeit von der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung steuert, so dass das Beleuchtungsfeld (46) homogen beleuchtet ist, und dass die elektronische Schaltung (14) pixelweise die mit dem Detektor (20) aufgenommenen Daten mit der abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart verrechnet, dass ein homogen ausgeleuchtetes Bildfeld (40) entsteht.
Mikroskopsystem (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) eine Steuerschaltung (60) ist, die direkt die Intensität des von der Lichtquelle (3) ausgehenden Beleuchtungslichtstrahls (5) entsprechend der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung steuert.
Mikroskopsystem (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) im Beleuchtungslichtstrahl (5) angeordnet ist.
Mikroskopsystem (1) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) im Beleuchtungslichtstrahl (5) eine LCD-Matrix ist, deren einzelnen Pixel entsprechend der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung angesteuert sind, und dass der Detektor (20) ein CCD-Chip ist.
Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Scaneinrichtung (16) im Beleuchtungslichtstrahl (5) des Mikroskopsystems vorgesehen ist, die den Beleuchtungslichtstrahl (5) pixelweise über oder durch die Probe (10) führt.
Mikroskopsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) im Beleuchtungslichtstrahl ein akustooptisches Element ist, das in Abhängigkeit von der in der Speichereinheit (15) abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart ansteuerbar ist, dass das aus den einzelnen Pixel zusammengesetzte Beleuchtungsfeld eine homogene Helligkeitsverteilung aufweist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Element (13) ein AOTF, oder ein AOBS, oder ein AOM ist.
Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle (3) mindestens ein Laser vorgesehen ist, der den Beleuchtungslichtstrahl erzeugt.
Mikroskopsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Laser ein Mehrlinien-Laser ist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Laser ein kontinuierliches Wellenlängenspektrum aussendet.
Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (20) mindestens ein lichtempfindliches Element (36, 37) umfasst, das seriell die Pixel des Beleuchtungsfeldes auf der Probe (10) aufnimmt, und die elektronische Schaltung (14) die einzelnen Pixel zu einem Bildfeld (40) zusammensetzt, das mit der entsprechenden, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung verrechenbar ist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (20) einen Multibanddetektor (SP-Modul), mit mindestens einem lichtempfindlichen Element (36, 37), umfasst.
Mikroskopsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronische Schaltung (14) ein FPGA ist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronische Schaltung (14) in einem dem Mikroskop zugeordneten PC realisiert ist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung als Model realisiert ist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die räumliche, wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung als Polynom höherer Ordnung approximiert ist und die mehreren Koeffizienten des Models als Spline- oder andersartig modellierte spektrale Funktion approximiert sind.
Verfahren zur Shading-Korrektur von mindestens einer in einem Mikroskopsystem (1) vorhandenen Optik (9), die ein Beleuchtungsfeld definiert, wobei das Mikroskopsystem (1) mindestens eine Lichtquelle (3), die einen Beleuchtungslichtstrahl (5) emittiert, der durch die Optik (9) hindurch eine Probe (10) beleuchtet, und mindestens einen Detektor (20) aufweist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: • Hinterlegen einer wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeldes der Optik (9) in einer Speichereinheit (15) einer elektronischen Schaltung (14); • pixelweises Ansteuern eines anteuerbaren Elements (13) mit der wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeldes der Optik (9) derart, dass das Beleuchtungsfeld homogen beleuchtet ist; • pixelweises Aufnehmen des von der Probe (10) ausgehenden Detektionslichtstrahls (12); und • Verrechnen der mit dem Detektor (20) aufgenommenen Daten mit der wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung des Beleuchtungsfeldes der Optik (9) derart, dass ein homogen ausgeleuchtetes Bildfeld (40) entsteht.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung für jede im Mikroskopsystem (1) vorhandene Optik (9) mit dem Detektor (20) pixelweise ermittelt wird, und dass die ermittelte Helligkeitsverteilung in der Speichereinheit (15) der elektronischen Schaltung (14) abgelegt ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) eine Steuerschaltung (60) ist, mit der direkt die Intensität des von der Lichtquelle (3) ausgehenden Beleuchtungslichtstrahls (5) entsprechend der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) im Beleuchtungslichtstrahl (5) angeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) im Beleuchtungslichtstrahl (5) eine LCD-Matrix ist, deren einzelne Pixel entsprechend der gespeicherten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung angesteuert werden, und dass der Detektor (20) ein CCD-Chip ist, mit dem die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung des Bildfeldes (40) ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Scaneinrichtung (16) im Beleuchtungslichtstrahl (5) des Mikroskopsystems (1) vorgesehen ist, mit der der Beleuchtungslichtstrahl (5) pixelweise über oder durch die Probe (10) geführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das ansteuerbare Element (13) im Beleuchtungslichtstrahl (5) ein akustooptisches Element ist, das in Abhängigkeit von der in der Speichereinheit (15) abgelegten, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung derart angesteuert wird, dass das aus den einzelnen Pixeln zusammengesetzte Beleuchtungsfeld eine homogene Helligkeitsverteilung auf oder in der Probe (10) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Element (13) ein AOTF, oder ein AOBS, oder ein AOM ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle (3) mindestens ein Laser vorgesehen ist, mit dem der Beleuchtungslichtstrahl (5) für das Mikroskopsystem (1) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Laser ein Mehrlinien-Laser ist.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Laser ein kontinuierliches Wellenlängenspektrum aussendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (20) mindestens ein lichtempfindliches Element (36, 37) umfasst, mit dem seriell die Pixel des Beleuchtungsfeldes auf der Probe (10) aufgenommen werden, und dass mit der elektronischen Schaltung (15) die einzelnen Pixel zu einem Bildfeld (40) zusammensetzt werden, das mit der entsprechenden, wellenlängenabhängigen Helligkeitsverteilung verrechnet wird.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (20) einen Multibanddetektor (SP-Modul) mit mindestens einem lichtempfindlichen Element (36, 37) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronische Schaltung (14) ein FPGA ist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronische Schaltung (14) in einem dem Mikroskopsystem (1) zugeordneten PC realisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung als Model dargestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die räumliche, wellenlängenabhängige Helligkeitsverteilung als Polynom höherer Ordnung approximiert wird und die mehreren Koeffizienten des Models als Spline- oder andersartig modellierte spektrale Funktion approximiert werden.