DE102004003793A1

DE102004003793A1 - Elektrochemischer Biosensor mit verbesserter Langzeitstabilität

Info

Publication number: DE102004003793A1
Application number: DE200410003793
Authority: DE
Inventors: Karlheinz Dr. Hildenbrand
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2005-08-11

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Reagenzträgerschicht für einen elektrochemischen Biosensor, enthaltend eine Zwei-Schicht-Membran, wobei die erste Schicht ein wässrige Polymerdispersion mit eingearbeiteten Reagenzien enthält und die zweite Schicht eine dünne, wasserresistente, permeable Oberflächenschicht ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenzträgerschicht für einen mehrfach verwendbaren und für eine Langzeitmessung einsetzbaren elektrochemischen Biosensor zum Nachweis von Stoffen in Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Reagenzträgerschicht und zur Herstellung eines entsprechenden Biosensors. Der Nachweis von Stoffen in Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten, erfolgt mit Hilfe von Reagenzien wie Enzymen und anderen Hilfsstoffen, die in semipermeablen Schichten nach dem Enzym-Einschlussverfahren immobilisiert sind. Die erfindungsgemäßen Reagenzträgerschichten haften ohne Verwendung von weiteren Hilfsmitteln oder Verfahren, wie Klebstoffe oder Verschweißung auf den Transducern. Als Transducer werden Substrate bezeichnet, auf deren Oberfläche Elektroden aufgebracht sind.
Biosensoren mit derartigen Reagenzträgerschichten können zum Beispiel für die kontinuierliche Blutzuckerüberwachung oder für die Mehrfachverwendung eines Sensors in Arztpraxen beispielsweise für die Bestimmung von Kreatinin, Harnstoff, Lactat, Blutgasen und Ionen eingesetzt werden.
Am Beispiel des Kreatinin Nachweises, soll das Funktionsprinzip eines elektrochemischen Biosensors erläutert werden. Für den Nachweis von Kreatinin wird häufig das folgende enzymatische Detektionssystem eingesetzt:
Die Wasserstoffperoxid-Konzentration, die proportional zur Kreatinin-Konzentration gebildet wird, kann nach bekannten Methoden, zum Beispiel colorimetrisch oder elektrochemisch, beispielsweise amperometrisch nachgewiesen werden.
Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen, die elektrochemische Biosensoren für die Langzeit- oder Mehrfachmessung beschreiben.

Das US Patent 6,033,866 offenbart einen Sensor mit einer porösen, wasserabsorbierenden Matrix, die mit einem Enzymsytem (Glucoseoxidase, Peroxidase) imprägniert, mit einem Detergens und einem Stabilisator wie Gelatine oder Albumin versetzt und anschließend mit Glutardialdehyd vernetzt wird. Die Enzym-Membran wird mit Hilfe eines Schmelzklebers auf den Transducer appliziert.

WO 93/13408 beschreibt einen elektrochemischen Biosensor bestehend aus einer porösen Basismembran aus Polyamid oder Polyvinylidenflourid, in deren Poren sich Enzyme befinden. Mit Hilfe einer nicht porösen Schutzmembran werden die Enzyme nach dem Einschlussverfahren immobilisiert, wobei die nicht poröse Schutzmembran gleichzeitig zum Verschweißen mit dem Transducer nach dem Ultraschall Verfahren dient.

In US 5,312,590 ist ein mehrschichtiges Membran-Enzymsystem beschrieben. Auf dem Transducer befindet sich ein perflourierter Ionenaustauscher Film aus Nafion^®, der einen Redoxmediator sowie ein Enzym enthält. Über diesem Ionenaustauscher-Film befindet sich eine weitere Membran aus Celluloseacetat, Polyvinylalkohol oder Polyurethan.

Die Biosensoren nach den beschriebenen Veröffentlichungen haben einen relativ komplexen Aufbau, wodurch neben den Produktionskosten in der Regel auch die Reproduzierbarkeit der entsprechenden Assays negativ beeinflusst wird.

In EP 0 226 767 sind einschichtige, enzymhaltige Reagenzträgerschichten für den Glucosenachweis beschrieben. Die Rezeptur der Reagenzträgerschicht beruht auf der Basis ionischer Polymerdispersionen in Kombination mit wasserlöslichen oder wasserquellbaren Polymeren. Es wird offenbart, dass in Blends anionischer Polyurethandispersionen mit wasserlöslichen Polymeren, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, problemlos Enzyme eingearbeitet werden können. Derartige Testelemente, die für den Einmalgebrauch konzipiert sind, können über einen langen Zeitraum gelagert werden wobei die Enzymaktivität erhalten bleibt. Werden derartige Rezepturen auf Polymerfolien beschichtet und verdampft das Wasser, so entstehen wasserresistente, enzymhaltige Membranschichten. In diesen Membranschichten bleibt die Aktivität von Glucoseoxidase und Peroxidase über einen langen Zeitraum voll erhalten.

Nachteilig an diesen Membranschichten ist jedoch, dass sich bei Kontakt einer solchen Membranoberfläche mit Wasser das in die Membranschicht eingearbeitete Enzymsystem nach und nach löst, so dass derartige Nachweissysteme für Langzeit- oder Mehrfachtests ungeeignet sind.

Aus „Microencapsulation by means of step-wise adsorption of polyelectrolytes", J. Microencapsulation 2000, Vol.17, Nr.2, 177–185 ist das Prinzip der Einkapselung durch die schrittweise Adsorption von Polyelektrolyten vom Prinzip her bekannt. Es wird der schrittweise Aufbau von Polyelektrolyt-Multischichten aus Natriumpolystyrolsulfonsäure und Polyallylaminhydrochlorid an der Oberfläche von kolloidalen Partikeln beschrieben. Die hier offenbarten Schichtsysteme sind jedoch nicht als permeable Reagenzträger an der Oberfläche von elektrochemischen Transducern geeignet.

Aus „Basic Principles of Membrane Technology", Marcel Mulder, Kluwer Academic Publishers; 2. Auflage, 1996, S. 81–89 sind Membranstrukturen mit einer hochporösen und hochpermeablen Basismembran und einer dichten, nur für kleine Moleküle permeablen Oberflächenschicht (Composite Membranen) bekannt. Sie bestellen aus einer hochporösen Basismembran, auf deren Oberfläche durch eine Phasengrenzflächen-Polymerisation eine dicht strukturierte Membranschicht aufgebracht wird.

Die hier beschriebenen Membranen sind jedoch für technische Anwendungen wie die Umkehrosmose konzipiert. Wegen sehr geringer Durchlässigkeit für Wasser können diese technischen Composite Membranen nur bei hohen Drücken von etwa 30 bar betrieben werden und sind deshalb für den Anwendungsbereich der Biosensoren ungeeignet.

Es ist deshalb die Aufgabe eine Reagenzträgerschicht für einen elektrochemischen Biosensor zu entwickeln, die eine gute Langzeitstabilisierung der Enzymaktivitäten auch bei Mehrfachverwendung aufweist, sowie eine einfache Herstellbarkeit verbunden mit einer guten Haftung auf den entsprechenden Substraten. Aus produktionstechnischen Gründen ist es wünschenswert, dass das gesamte Reagenzsystem aus einer Rezeptur appliziert werden kann.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe besteht in einer Reagenzträgerschicht für einen elektrochemischen Biosensor enthaltend eine Zwei-Schicht-Membran, wobei die erste Schicht eine wässrige Polymerdispersion mit eingearbeiteten Reagenzien enthält und die zweite Schicht eine dünne, wasserresistente, permeable Oberflächenschicht ist.

Für die erste Schicht der Zwei-Schicht-Membran kommen alle bekannten wässerigen Polymerdispersionen in Frage. Bei Polymerdispersionen handelt es sich um Polymere, die in Wasser, oft mit Hilfe von Dispergierhilfsmitteln (Emulgatoren, Tenside) dispergiert sind, wobei Feststoffgehalte von etwa 30 bis 60 Gew.-% üblich sind. Je nach Polymerstruktur haben diese Dispersionen unterschiedliche Eigenschaften.

Ein Beispiel für eine nichtionische Polymerdispersion aus einem Homopolymerisat ist die Polyvinylacetat Dispersion „Mowilith D^®" der Fa. Clariant. Sie wird hergestellt durch Suspensionspolymerisation von Vinylaceteat in Gegenwart von Polyvinylalkohol als Emulgator.

Auf ähnliche Weise werden Polyacrylat Dispersionen hergestellt, die beispielsweise von der Fa. Röhm unter dem Namen Eudragite^® vertrieben werden. Bei der Type „Eudragite NE 30D^®" handelt es sich um ein Copolymerisat von Ethylacrylat und Methylmethacrylat (MMA).

Aus der Eudragite^®-Serie gibt es auch ionische Polymerdispersionen, die durch Copolymerisation von Methylmethacrylat mit ionischen Acrylmonomeren hergestellt werden. Handelt es sich beim ionischen Acrylmonomer um Acrylsäure bzw. deren Natriumsalz, so wird dementsprechend eine anionische Polymerdispersion erhalten, die von der Fa. Röhm unter dem Namen „Eudragite L 30^®" vertrieben wird.

Wird Methylmethacrylat mit einem kationischen Acrylatmonomeren beispielsweise Trimethylammoniumethylmethacrylat copolymerisiert, so wird eine kationische Polymerdispersion erhalten, die unter dem Namen „Eudragite RL 30D^®" erhältlich ist.

Das ionische Comonomer ist üblicherweise in weniger als 40 Gew.-% im Copolymerisat enthalten.

Bei ionischen Polyurethan Dispersionen handelt es sich um Verbindungen, die – ausgehend von Diisocyanaten, Diolen und Diaminen – nach dem Polyadditionsverfahren hergestellt werden. Die ionische Komponente wird üblicherweise über entsprechend modifizierte Diamine eingeführt. Weitere Details sind beschrieben in: D. Dietrich, „Aqueous Emulsions, Dispersions and Solutions of Polyurethanes; Synthesis and Properties", Progress in Organic Coatings 9 (1981), 281–340.

Derartige wässrige ionische Polyurethandispersionen, die auch „Ionomere" genannt werden, werden beispielsweise von der Fa. Bayer AG (jetzt Bayer Polymers AG) unter dem Handelsnamen Impranil^® vertrieben. In diesem Sortiment sind zahlreiche kationisch und anionisch modifizierte Varianten enthalten.

Eine ganz besonders bevorzugte Dispersion für die erfindungsgemäßen Zwei-Schicht-Membranen ist die anionische Polyurethandispersion Impranil DLS^®. Es handelt sich hierbei um ein Reaktionsprodukt aus 82 Teilen eines Polyesters (MW. 1700) aus Adipinsäure, Hexandiol und Neopentylglykol, 15 Teilen Hexamethylendiisocyanat, 1 Teil Ethylendiamin und 2 Teilen Na ethylendiamin-ethylsulphonat. Durch die zuletzt genannte Komponente wird der ionische Charakter dieser Polyurethandispersion erzeugt. Wird in der Impranil DLS^® -Rezeptur die zuletzt genannte anionische Komponente durch eine kationische Verbindung, zum Beispiel dem Ammoniumsalz von 2-Ethyl-2-dialkylamino-1,3-propandiol ersetzt, so erhält man dementsprechend eine kationisch modifizierte Polyurethandispersion, die auch unter dem Namen „Impranil Bayderm Grund^®" erhältlich ist.

Die ionischen, insbesondere die anionischen Polyurethandispersionen zeichnen sich im Hinblick auf die erfindungsgemäßen Reagenzträgerschichten durch eine Reihe besonders günstiger Eigenschaften aus: Sie stabilisieren die nativen Enzymstrukturen und garantieren daher eine hervorragende Langzeitstabilität der Enzyme in ionische Polyurethanmatrizen. Durch ihr sehr gutes Haftvermögen lassen sich Rezepturen aus ionischen Polyurethanen auf unterschiedlichste Substrate beschichten. Wegen ihres elastomeren, nicht brüchigen Charakters sind die mechanischen Eigenschaften und Langzeitbeständigkeiten dieser Membranschichten besonders vorteilhaft.

Die für den Nachweis erforderlichen Reagenzien, üblicherweise Enzyme, können einfach über die wässerige Phase der Polymerdispersion eingearbeitet werden. In diese Reagenzrezeptur können auch weitere Hilfsstoffe, wie Puffer, Detergenzien, rheologische Additive und Mediatoren integriert werden.

Soll der Sensor mit der erfindungsgemäßen Reagenzträgerschicht zum Nachweis von Kreatinin dienen, so wird das Enzym-System Creatininamidohydrolase (CNH), Creatinamidinohydrolase (CRH) und Sarcosinoxidase (SAO) in die erste Schicht der Zwei-Schicht-Membran eingebracht.

Soll der Sensor mit der erfindungsgemäßen Reagenzträgerschicht zum Nachweis von Blutzucker dienen, so wird Glucoseoxidase (GOD) in die erste Schicht der Zwei-Schicht-Membran eingebracht.

Zur Erhöhung der Permeabilität der ersten Schicht können zusätzlich zu den Reagenzien wasserquellbare oder wasserlösliche Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure Natriumsalz oder Polyethylenoxid eingearbeitet werden. Dabei beträgt der Anteil der wasserquellbaren oder wasserlöslichen Polymere bevorzugt höchstens 10 % des Trockengewichts der Membran. Bezogen auf das Trockengewicht der Reagenzträgerschicht ist der Feststoffgehalt der Polymerdispersion bevorzugt höher als 90 Gew.-%.

Die Dicke der ersten Schicht der Zwei-Schicht-Membran liegt im Bereich von 10 Mikrometern bis 1 mm, bevorzugt im Bereich von 50 μm bis 500 μm.

Die erfindungsgemäße zweite Schicht ist so beschaffen, dass niedermolekulare Verbindungen, wie Glucose, Kreatinin oder Harnstoff von der Oberfläche der Reagenzträgerschicht her in die erste Schicht der Zwei-Schicht-Membran eindiffundieren können, wo dann die biochemische Nachweisreaktion stattfindet. Die hochmolekularen Reagenzien in der Reagenzträgerschicht können jedoch nicht aus der ersten Schicht nach außen diffundieren.

Die zweite Schicht hat bevorzugt eine Dicke im Bereich von 1 nm bis zu 50 nm und ist bevorzugt nur für Moleküle mit einer Molmasse kleiner 1000 Dalton permeabel.

Zur Herstellung der zweiten Schicht können Polymerlösungen bevorzugt wässrige Polymerlösungen verwendet werden.

Für den Fall, dass die erste Schicht durch eine ionische Polymerdispersion gebildet wird, ist die zweite Schicht bevorzugt eine Polyelektrolyt-Doppelschicht. Eine solche Polyelektrolyt-Doppelschicht kann dadurch gebildet werden, dass auf die ionische Polymerdispersion eine ionische Polymerlösung mit zur ionischen Polymerdispersion entgegengesetzter Ladung aufgebracht wird. Die Polyelektrolyt-Doppelschicht zeichnet sich durch besondere Wasserresistenz bei gleichzeitig hoher Wasserpermeabilität aus.

Bei einer ersten Schicht auf Basis einer anionischen Polymerdispersion kann die Polyelektrolyt-Doppelschicht durch Aufbringung einer kationischen Polymerlösung, beispielsweise einer Lösung von Polyallylaminhydrochlorid (PAH), Polydiallyldimethylammoniumchlorid (PolyDADMAC), Polyethyleniminhydrochloriden (PEI.HCl) oder von kationischen Cellulosepolymeren, wie Diethylaminoethylcellulosehydrochloride oder Chitosaminhydrochloride gebildet werden.

Im Falle einer ersten Schicht auf Basis einer kationischen Polymerdispersion kann die Polyelektrolyt-Doppelschicht durch Aufbringung einer anionischen Polymerlösung wie die Lösung der Natriumsalze von Polystyrolsulphonsäure (PSS), von der Polyacrylsäure (PAS) oder von deren Copolymerisaten, von der Polymaleinsäure oder von deren Copolymerisatengebildet werden oder auch durch Aufbringung von biokompatiblen Polymeren wie Heparinen oder Hyaluronsäure gebildet werden.

Neben den Polymerlösungen können zur Herstellung der zweiten Schicht auch Lösungen von niedermolekularen Verbindungen zum Beispiel Tensiden eingesetzt werden. Innerhalb der großen Produktgruppe der Tenside mit anionischen, kationischen, neutralen und zwitterionischen Vertretern ist insbesondere die Gruppe der zwitterionischen Phosphatidylcholine, beispielsweise „Phospholipon G 90^®" (Fa. Rhone-Poulenc), bevorzugt zu verwenden.

Auf anionische Polymerdispersionen als erste Schicht wird bevorzugt eine Alkohollösung zum Beispiel eine Isopropanollösung des zwitterionischen Tensids „Phospholipon 90 G^®" aufgebracht.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die zweite Schicht der Zwei-Schicht-Membran mit biokompatiblen Agentien beschichtet. Bei den biokompatiblen Agentien kann es sich zum Beispiel um Hyaluronsäure, zwitterionische Tenside aus der Gruppe der Phosphatidylcholine, Polyethylenglykolen oder Polyethylenoxiden handeln. Die biokompatiblen Agentien bewirken eine bessere Benetzbarkeit und Biokompatibilität der zweiten Schicht mit zu testenden Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Urin.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer oben beschriebenen Reagenzträgerschicht für einen elektrochemischen Sensor enthaltend die Schritte

a. Bereitstellung eines Substrats,
b. Bereitstellung einer wässrigen Polymerdispersion,
c. Einarbeiten von Reagenzien in die wässrige Polymerdispersion,
d. Aufbringen der wässrigen. Polymerdispersion mit den eingearbeiteten Reagenzien auf das Substrat als erste Schicht,
e. Trocknen der ersten Schicht auf dem Substrat,
f. Aufbringen einer wässrigen Polymerlösung oder von niedermolekularen Verbindungen als zweite Schicht auf die erste Schicht.

Das Substrat ist vorzugsweise eine Polymerfolie oder Silika Wafer, auf dessen Oberfläche Zwei- oder Mehr-Elektroden Arrays beispielsweise aus Graphit, Gold, Silber, Silberchlorid oder Platin aufgebracht sind. Zwischen den Elektroden können sich hydrophobe Dielektrizitätsschichten zum Beispiel aus Polysiloxanen befinden.

Das Aufbringen der wässerigen Polymerdispersion mit den eingearbeiteten Reagenzien auf das Substrat kann durch gängige Verfahren wie Aufrakeln, Spin Coating, Dip Coating, Mikropipetting oder Siebdruck erfolgen. Die Trocknung erfolgt durch anschließendes Verdampfen des Wassers. Bei Enzym-haltigen Rezepturen sind die Temperaturbedingungen an die Stabilität der Enzyme anzupassen. Warmluft bei etwa 35°C ist normalerweise geeignet.

Als weiterer Schritt kann eine Oberflächenmodifizierung durch Aufbringung biokompatibler Agenzien auf die zweite Schicht erfolgen.

Das Aufbringen der zweiten Polymerschicht sowie gegebenenfalls der biokompatiblen Oberflächenbeschichtung kann durch Spin Coating, Dip Coating oder Spray Coating erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein elektrochemischer Biosensor enthaltend ein Substrat mit darauf befindlichen Elektroden und eine oben beschriebene Reagenzträgerschicht, die sich auf dem Substrat befindet.

In der erfindungsgemäßen Reagenzträgerschicht werden Enzyme nach dem Einschlussverfahren bevorzugt basierend auf dem Prinzip der Polyelektrolyt-Doppelschichten immobilisiert. Im Vergleich zu den häufig verwendeten kovalenten Immobilisierungsmethoden ist in der erfindungsgemäßen Reagenzträgerschicht die Gefahr der Enzymdenaturierung ausgeschlossen und außerdem ist die Menge der immobilisierten Enzyme nicht durch die Anzahl der kovalenten Bindungspartner beschränkt. Die Permeabilität von kleinen Molekülen, wie Glucose, Kreatinin, Harnstoff oder Wasserstoffperoxid wird durch die zweite Schicht nur geringfügig reduziert, während große Verbindungen, wie Enzyme immobilisiert werden.

Die erfindungsgemäßen Reagenzträgerschichten sind vorteilhaft in Bezug auf Beschichtbarkeit, Haftung und Langzeitbeständigkeit auf unterschiedlichsten Substraten, so dass außer Trocknen keine weiteren Hilfsmittel oder Verfahren, wie Klebstoffe oder Schweißprozesse, erforderlich sind. Aufgrund ihres elastomeren und gleichzeitig filmbildenden Charakters, ihres guten Haftvermögens auf unterschiedlichsten Substraten sowie der Stabilisierung von Enzymaktivitäten ist die erfindungsgemäße Reagenzträgerschicht auf der Basis von ionischen Polyurethandispersionen besonders vorteilhaft.

Beispiele

Zur näheren Erläuterung der Erfindung ist im Folgenden das Herstellprinzip einer anionisch geladenen Polyurethan-Basismembran, die das biochemische Reagenzsystem für einen Kreatinin Nachweis enthält, beschrieben:
Die Enzyme Creatininamidohydrolase (CNH), Creatinamidinohydrolase (CRH) und Sarkosinoxidase (SAO) werden in einer wässerigen Polyethylenoxid (MW: 900 000) Lösung gelöst. Diese enzymhaltige Polymerlösung wird in die anionisch modifizierte Polyurethandispersion Impranil^® DLS (50 Gew.-% in Wasser, Bayer AG) eingerührt. Nach Entgasen wird diese Polymerblend-Rezeptur auf ein Substrat, beispielsweise Polymerfolie oder Transducer beschichtet und bei 35°C mit Warmluft getrocknet.

Mit diesem einschichtigen enzymhaltigen Membransystem konnte zwar ein quantitativer Kreatinin Nachweis durchgeführt werden, aber ein Mehrfach- oder Langzeittest mit ein und derselben Testmembran war nicht möglich.

Erst durch Behandlung der Oberfläche dieser anionischen enzymhaltigen Membranschicht mit kationischen Polymeren, wie Polydiallyldimetylammoniumchlorid (Poly DADMAC) und einer dadurch verursachten Bildung einer Polyelektrolyt-Oberflächenstruktur, konnten Mehrfach- bzw. Langzeittests erfolgreich durchgeführt werden. Durch die Polyelektrolyt-Oberflächenstruktur wurden die Reaktivität und die Reaktionskinetik der Reagenzträgerschicht, nicht negativ beeinflusst.

Beispiel 1: Anionisch geladene Polyurethan-Basismembran für den Nachweis von Kreatinin
PHO Polymerlösung:
262 mg Polyethylenoxid (Polyox WRS 1105, MW. 900 000, Fa. Union Carbide) wurden in 3238 ml Phosphatpuffer pH 7.5 gelöst, wobei 3.5 g einer 7.5%igen PEO Lösung in Phosphatpuffer erhalten werden.
Enzymlösung:
In 1.5 ml Phosphatpuffer pH 7.5 wurden die folgenden Enzyme gelöst:
48 mg Creatininamidohydrolase (CNH, 246U/mg)
445 mg Creatinamidinohydrolase (CRH, 13.2U/mg) und
400 mg Sarkosinoxidase (SAO, 14.7U/mg)
Enzym-Polymerlösung:
Die 2.4 g dieser Enzymlösung wurden unter Rühren mit 3.5 g der PEO Polymerlösung vermischt.
Dispersion/Polymer/Enzym Rezeptur
22,8 g Impranil^® DLS (50% in Wasser, Bayer AG) wurden unter Rühren in die Enzym-Polymerlösung eingearbeitet. Der Ansatz wurde unter Rühren entgast wobei eine homogene hellgelb gefärbte Gießlösung erhalten wurde.
Beschichtung auf Polymerfolie:
Die Gießlösung wurde mit Hilfe eines Rakels in einer Schichtdicke von 500 μm auf eine Polycarbonat Folie (Makrofol DE 1-4, Bayer AG) aufgetragen und anschließend bei 35°C mit Warmluft getrocknet.
Kreatinin Performance Test
Auf die Oberfläche der reagenzhaltigen Basismembran wurden jeweils 10 μl einer wässerigen Kreatininlösung mit 10, 1, 0.5 und 0.1 mmol Kreatinin aufgegeben. Nach einer Wartezeit von einer Minute wurde die im Testtropfen gebildete Wasserstoffperoxidkonzentration mit Hilfe von Peroxid Teststreifen (Merckoquant 110081 und Merckoquant 116975) nachgewiesen.
Entsprechend der zunehmenden Kreatininkonzentrationen konnten auf dem Teststreifen abgestufte Blaufärbungen festgestellt werden.
Langzeittest (Lagerung in Pufferlösung):
Hinsichtlich Mehrfachverwendung bzw. Langzeitverhalten wurden die hier beschriebenen Testsysteme (Kreatinin-Basismembran) in eine Phosphatpufferlösung (pH: 7.5, 0.2 molar)getaucht und nach einer Verweilzeit von einigen Stunden sowie nach einem Tag wieder auf Kreatinin Reaktivität untersucht. Während nach einer Verweilzeit von einigen Stunden im Vergleich zum nicht mit Puffer gewaschenen Analogon nur noch stark reduzierte Wasserstoffperoxid Konzentrationen nachgewiesen werden konnten, war die Reaktivität nach einer Waschzeit von einem Tag praktisch auf Null abgesunken. Offensichtlich wurden die Enzyme aus dieser einschichtigen Membran in die Waschpufferlösung extrahiert.
Beispiel 2: Aufbringen einer kationischen Oberflächenschicht (Poly DADMAC)
Die auf Folie beschichtete anionische Reagenzmembran von Beispiel 1 wurde auf einem Spin Coater (Fa. Laurell) fixiert und auf deren Oberfläche die Lösung des kationischen Polymers (Polydiallyldimethylammoniumchlorid 9%ig in Wasser) aufgegeben.
Durch Rotieren wurde der Überschuss der kationischen Polymerlösung entfernt. Dieser Prozess wurde wiederholt und durch Aufgeben und Abrotieren von Wasser beendet.
Die mit dem kationischen Polymer behandelten Membranen wurden teilweise nach, teilweise ohne Trocknung wie oben beschrieben mit Kreatinin Lösungen getestet.
Ergebnisse (ohne Lagerung in Puffer):
Die kationisch modifizierten Membrantestsysteme wurden in Analogie zu Beispiel 1 mit 10, l, 0.5 und 0.1 mmol Kreatinin Testlösungen geprüft, wobei weitgehend analoge Ergebnisse wie in Beispiel 1 (abgestufte Blaufärbungen in Korrelation zur Konzentration der Kreatinin Testlösungen) erhalten wurden. Die nach der kationischen Modifizierung durchgeführte Trocknung war für das Testresultat ohne Belang, so dass auf diesen Schritt auch verzichtet werden konnte.
Ergebnisse nach Lagerung in Phosphatpuffer pH 7.5 (PBS):
Das einen Tag in PBS Puffer gelagerte Testsystem zeigte keinerlei Einbußen an Reaktivität, so dass die Lagerzeitlagerung in der Pufferlösung auf mehrere Wochen ausgedehnt wurde.
Die Testsysteme wurden wöchentlich hinsichtlich Reaktivität untersucht, wobei der Waschpuffer jeweils erneuert wurde.
Selbst nach einer Lagerzeit von vier Wochen konnte keine deutliche Einbuße an Reaktivität, bedingt durch die kationisch stabilisierte Membranoberfläche, festgestellt werden konnte.
Beispiel 3: Anionisch geladene Polyurethan Basismembran für den Nachweis von Glucose
PEO Polymerlösung:

7.5%ige PEO Lösung analog Beispiel 1

Enzymlösung:

200 mg Glucoseoxidase (GOD, 180U/mg) wurden in 3 ml PBS Phosphatpuffer pH 7.5 gelöst.

Dispersion/Polymer/Enzym Gießlösung:
Zu 7.1 g der PEO Lösung wurden unter Rühren 3.2 g der Enzymlösung (GOD) gegeben.
In diese Polymer/Enzymlösung wurden unter Rühren 45.5 g der wässrigen Polyurethandispersion Impranil^® DLS (50%ig in Wasser) gegeben. Nach Entgasen im Vacuum wurde die Gießlösung analog Beispiel 1 auf eine Folie beschichtet und nach Trocknen mit Glucose Testlösungen (200, 100, 50 mg/dl Glucose) getestet.
Glucose Performance Test:
Auf die Oberfläche der einschichtigen Membran wurden die o.g. Testlösungen aufpipettiert.
Nach einer Verweilzeit von 60 sec. wurde die Wasserstoffperoxid-Konzentration mit Hilfe der Peroxid Teststreifen ermittelt, wobei mit zunehmender Glucosekonzentration eine zunehmende Intensität der Blaufärbung ermittelt wurde. Ein Mehrfach- bzw. Langzeittest war in Analogie zu den Testsystemen in Beispiel 1 nicht möglich.
Beispiel 3a: Oberflächenbehandlung mit Poly DADMAC
Die Oberflächenbehandlung mit dem kationischen Polymer erfolgte in Analogie zu Beispiel 1. Die derart modifizierten Test Membranen konnten, ebenfalls in Analogie zu Beispiel 1, problemlos einem Mehrfach- bzw. Langzeittest unterworfen werden.
Beispiel 3b: Oberflächenbehandlung mit einem Phospholipid Detergens
Die GOD-haltige Polyurethanmembran aus Beispiel 3 wurde zunächst mit einer wässerigen Poly DADMAC Lösung beschichtet und getrocknet. Darauf wurde eine 10%ige isopropanolische Lösung von Phospholipon 90 G (Fa. Rhone Poulenc) appliziert, die ebenfalls mit Warmluft getrocknet wurde.
Die so oberflächenmodifizierten Membranen konnten problemlos einem Langzeittest unterworfen werden. Im Vergleich zu den reinen Poly DADMAC -Modifikationen fiel bei diesen Tensidmodifizierten Testsystemen eine hervorragende Benetzbarkeit (sehr kleine Randwinkel) mit den Testflüssigkeiten auf.
In weiteren Versuchen wurde das Phospholipid Detergens Phospholipon 90 G ohne die kationische Zwischenschicht Poly DADMAC auf die anionische enzymhaltige Basismembran aufgebracht wobei die Effekte der Langzeitstabilisierung ebenfalls erreicht werden konnten.
Beispiel 4: Kationisch modifizierte GOD haltige Basismembran
200 mg GOD (180U/mg) wurden in 7.0 g PEO Lösung (7.5%ig in Phosphatpuffer pH 7.5) gelöst. Dazu wurden unter Rühren 75 ml einer kationisch modifizierten Polymethylmethacrylatdispersion (Eudragite RL 30 D, Fa. Röhm) gegeben. Nach Entschäumen wurde die enzymhaltige Gießlösung analog zu Beispiel 3 auf eine Folie beschichtet, getrocknet und mit Glucoselösungen getestet.
Wie in Beispiel 3 wurden konzentrationsabhängige Blaufärbungen der Peroxid-Teststreifen erhalten. Beim Lagern in Pufferlösungen fiel die Reaktivität jedoch sehr schnell ab.
Beispiel 4a: Polyelektrolytschicht aus Polystyrolsulfonsäure Natriumsalz
In Analogie zu den Beispielen 1-3 wurde die Oberfläche der kationischen Reagenzmembran mit einer 30%igen, wässrigen Lösung Polystyrolsulfonsäure Natriumsalz (MW: 70 000, Aldrich) behandelt.
Die so Oberflächen-modifizierte Membran zeigte auch nach Lagern in Pufferlösungen eine gute Langzeitstabilität.
Beispiel 5: Elektrochemischer Kreatinin Nachweis
Die in Beispiel 1 beschriebene Dispersion/Polymer/Enzym Rezeptur wurde auf Silizium Wafer mit Gold Elektroden beschichtet. Nach der Oberflächenbehandlung mit Poly DADMAC wurden die elektrochemischen Biosensoren im Konzentrationsbereich von 0 bis 0.88 mM Kreatinin getestet, wobei der Kreatinin-Konzentration proportionale Stromstärken im Bereich von 0 bis 10 nA ermittelt wurden.

Claims

Reagenzträgerschicht für einen elektrochemischen Biosensor enthaltend eine Zwei-Schicht-Membran, wobei die erste Schicht eine wässrige Polymerdispersion mit eingearbeiteten Reagenzien enthält und die zweite Schicht eine dünne, wasserresistente, permeable Oberflächenschicht ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Feststoffgehalt der wässrigen Polymerdispersion im Bereich von 30 bis 60 Gew.% liegt.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der ersten Schicht im Bereich von 10 μm bis 1 mm, bevorzugt im Bereich von 50 μm bis 500 μm liegt.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Feststoffgehalt der Polymerdispersion bezogen auf das Trockengewicht der Reagenzträgerschicht höher als 90 Gew.% ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine Polyvinyacetat Dispersion oder eine Polyacrylat Dispersion ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine ionische Polymerdispersion ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion ein Coploymerisat von Methylmethacrylat mit ionischen Acrylmonomeren ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine ionische Polyurethan Dispersion ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schicht eine Dicke im Bereich von 1 nm bis 50 nm hat.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schicht nur für Moleküle mit einer Molmasse kleiner als 1000 Dalton permeabel ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schicht durch eine Polymerlösung oder durch eine Lösung niedermolekularer Verbindungen gebildet wird.
Reagenzträgerschicht nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine ionische Polymerdispersion ist und die zweite Schicht eine Polyelektrolyt-Doppelschicht ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyelektrolyt-Doppelschicht durch Aufbringen einer ionischen Polymerlösung mit zur ionischen Polymerdispersion entgegengesetzter Ladung auf die ionische Polymerdispersion erhalten wird.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die kationische Polymerlösung Polydiallyldimethylammoniumchlorid (PolyDADMAC), Polyallylaminhydrochlorid (PAH), Polyethyleniminhydrochloride (PEI.HCl) oder kationische Cellulosepolymere wie Diethylaminoethyl-cellulose-hydrochlorid oder Chitosaminhydrochloride enthält.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die anionische Polymerlösung eine Lösung der Natriumsalze von Polystyrolsulphonsäure (PSS), von der Polyacrylsäure (PAS) oder von deren Copolymerisaten, von der Polymaleinsäure oder von deren Copolymerisaten enthält oder dass die anionische Polymerlösung biokompatible Polymere wie Heparin oder Hyaluronsäure enthält.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die niedermolekularen Verbindungen Tenside sind.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein zwitterionisches Phosphatidylcholin als Tensid verwendet wird.
Reagenzträgerschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion zusätzlich zu den Reagenzien in Wasser lösliche oder in Wasser quellbare Polymere enthält.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in Wasser löslichen oder in Wasser quellbaren Polymeren um Polyethylenoxid, Polyvinyl-alkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyacrylsäure Natriumsalz handelt.
Reagenzträgerschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass unter den Reagenzien Enzyme sind.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass unter den Reagenzien weiterhin Hilfsstoffe wie Puffer, Detergenzien, rheologische Additive oder Redox Mediatoren sind.
Reagenzträgerschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Schicht der Zwei-Schicht-Membran mit biokompatiblen Agentien beschichtet ist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den biokompatiblen Agentien um Hyaluronsäure, zwitterionische Tenside aus der Gruppe der Phosphatidylcholine, Polyethylenglykol oder Polyethylenoxid handelt.
Verfahren zur Herstellung einer Reagenzträgerschicht nach den Ansprüchen 1 bis 21 enthaltend die Schritte a. Bereitstellung eines Substrats, b. Bereitstellung einer wässerigen Polymerdispersion, c. Einarbeiten von Reagenzien in die wässrige Polymerdispersion, d. Aufbringen der wässerigen Polymerdispersion mit den eingearbeiteten Reagenzien auf das Substrat als erste Schicht, e. Trocknen der ersten Schicht auf dem Substrat, f. Aufbringen einer Polymerlösung oder einer Lösung niedermolekularer Verbindungen als zweite Schicht auf die erste Schicht.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat Polymerfolie oder Silika Wafer ist, auf dessen Oberfläche Elektroden aufgebracht sind.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen den Elektroden hydrophobe Dielektrizitätsschichten befinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen der wässerigen Polymerdispersion mit den eingearbeiteten Reagenzien auf das Substrat durch Aufrakeln, Spin Coating, Dip Coating, Micropipetting oder Siebdruck erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt f. in einem weiteren Schritt biokompatible Agenzien auf die zweite Schicht aufgebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den biokompatiblen Agentien um Hyaluronsäure, zwitterionische Tenside aus der Gruppe der Phosphatidylcholine, Polyethylenglykol oder Polyethylenoxid handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen der zweiten Schicht auf die erste Schicht oder das Aufbringen der biokompatiblen Agenzien auf die zweite Schicht durch Spin Coating, Dip Coating oder Spray Coating erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 24 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine Polyvinyacetat Dispersion oder eine Polyacrylat Dispersion ist.
Verfahren nach Anspruch 24 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine ionische Polymerdispersion ist.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion ein Coploymerisat von Methylmethacrylat mit ionischen Acrylmonomeren ist.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine ionische Polyurethan Dispersion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Polymerdispersion eine ionische Polymerdispersion ist und die wässrige Polymerlösung eine ionischen Polymerlösung ist, wobei die ionische Polymerlösung eine zur ionischen Polymerdispersion entgegengesetzte Ladung aufweist.
Reagenzträgerschicht nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die kationische Polymerlösung Polydiallyldimethylammoniumchlorid (PolyDADMAC), Polyallylaminhydrochlorid (PAH), Polyethyleniminhydrochloride (PEI.HCl) oder kationische Cellulosepolymere wie Diethylaminoethyl-cellulose-hydrochlorid oder Chitosaminhydrochloride enthält.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die anionische Polymerlösung eine Lösung der Natriumsalze von Polystyrolsulphonsäure (PSS), von der Polyacrylsäure (PAS) oder von deren Copolymerisaten, von der Polymaleinsäure oder von deren Copolymerisaten enthält oder dass die anionische Polymerlösung biokompatible Polymere wie Heparin oder Hyaluronsäure enthält.
Verfahren nach Anspruch 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die niedermolekularen Verbindungen Tenside sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c. in die wässrige Polymerdispersion zusätzlich zu den Reagenzien in Wasser lösliche oder in Wasser quellbare Polymere eingearbeitet werden.
Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in Wasser löslichen oder in Wasser quellbaren Polymeren um Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyacrylsäure Natriumsalz handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass unter den Reagenzien Enzyme sind.
Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass unter den Reagenzien weiterhin Hilfsstoffe wie Puffer, Detergenzien, rheologische Additive oder Redox Mediatoren sind.
Elektrochemischer Biosensor enthaltend ein Substrat mit darauf befindlichen Elektroden und eine auf dem Substrat aufgebrachte Reagenzträgerschicht gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.