DE10154436A1

DE10154436A1 - pyro-Bakteriopheophorbidderivate

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Publication number: DE10154436A1
Application number: DE2001154436
Authority: DE
Original assignee: RODOTECH GmbH
Current assignee: RODOTECH GmbH
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2003-05-15

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft pyro-Bakteriopheophorbid, welche an mindestens einer Ketogruppe des Porphorinsystems derivatisiert sind sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Arzneimittel, insbesondere in der photodynamischen Therapie, sowie zur Diagnose eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pyro-Bakteriopheophorbidverbindungen, welche an mindestens einer Ketogruppe des Porphyrinsystems derivatisiert sind sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Arzneimittel, insbesondere in der photodynamischen Therapie, sowie zur Diagnose eingesetzt werden.
Die photodynamische Therapie (PDT) ist ein modernes Therapiekonzept für die Behandlung von Krebserkrankungen und anderen Indikationen. Das Prinzip der photodynamischen Therapie beruht auf Anreicherung von photoaktiven Farbstoffen, insbesondere Porphyrinen in bestimmten Gewebearten, beispielsweise Tumorgewebe, welche anschließend durch Bestrahlung mit Laserlicht zerstört werden können. Der Zerstörung des Tumorgewebes liegt die lichtabhängige Umwandlung von molekularem Sauerstoff in der Zelle in eine reaktive Form (Singulettsauerstoff) zugrunde, welcher dann oxidativ die Tumorzelle zerstört.
Während das allgemeine Prinzip der photodynamischen Therapie gut etabliert ist, wird der Grund für die Anreicherung von Porphyrinen in Tumorgewebe bislang noch kontrovers diskutiert. Die Anreicherung bekannter Farbstoffe in verschiedenen Tumorgeweben variiert derzeit zwischen 1 : 2 bis 1 : 200. Es wurden im Stand der Technik verschiedene Versuche unternommen, die Anreicherung im Zielgewebe zu erhöhen. Darüberhinaus gibt es zahlreiche Veröffentlichungen, welche Porphyrinderivate bzw. ihre Verwendung in der photodynamischen Therapie beschreiben z. B. DD 248 282, DE 196 20 154, DE 199 36 997, DE 29 91 6518, EP 0 071 991, EP 0 142 732, EP 0 168 832, EP 0 213 272, EP 0 322 198, EP 0 584 552, EP 0 651 75 l, EP 0 680 365, EP 0 947 222, EP 1 l10 963, WO 9313769, WO 9316692, WO 9508551, WO 9513809, WO 9532206, WO 9705127, WO 9719081, WO 9732885, WO 9930620, WO 9963900, WO 9967248, WO 9967249, WO 0000204, WO 0032602, WO 0033833, WO 0034763, WO 0071028, WO 0103706, WO 0107034, WO 0108704, WO 0139764, WO 0140232, WO 0152814.
Trotzdem besteht nach wie vor ein großer Bedarf an Verbindungen, welche verbesserte Eigenschaften zum Einsatz in der photodynamischen Therapie, insbesondere eine geringe allgemeine Zelltoxizität und eine hohe spezifische Photozelltoxizität nach Bestrahlung für Tumorzellen aufweisen. Weiterhin sind Verbindungen wünschenswert, welche in hoher Reinheit hergestellt werden können, welche eine hohe Stabilität aufweisen und welche eine Anregungswellenlänge besitzen, die eine hohe Eindringtiefe von Licht in Gewebe erlaubt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereitstellung solcher Verbindungen, welche zudem eine hohe Stabilität aufweisen sollten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Verbindung der allgemeinen Formel

oder

worin
R¹ und R² jeweils unabhängig O, N-R⁶ oder C(R⁶) (R⁷) darstellen, worin R⁷ Wasserstoff oder R⁶ bedeutet und R⁶ jeweils unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen darstellt, mit der Maßgabe, dass wenigstens einer von den Resten R¹ und R² nicht Sauerstoff ist,
R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander H oder OH darstellen,
R⁵ Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen darstellt und
M ein Metallatom ist
sowie Salze davon.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch Derivatisierung von pyro-Bakteriopheophorbidverbindungen an einer oder beiden Ketogruppen des Porphyrinringsystems Verbindungen erhalten werden können, die hervorragende Eigenschaften in der photodynamischen Therapie zeigen. Die Verbindungen weisen insbesondere eine vorteilhafte Anregungswellenlänge, insbesondere im Infrarotbereich auf. Dadurch wird eine hohe Eindringtiefe des Lichts in das Tumorgewebe erzielt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass chemisch reine, stereospezifische Verbindungen mit eindeutiger Dosis-Wirkungsbeziehung erhalten werden können. Darüber hinaus weisen sie eine geringe Toxizität und gleichzeitig eine hohe Phototoxizität auf.
Die Derivatisierung an den am Porphyrinsystem vorhandenen Carbonylgruppen ermöglicht insbesondere eine physikochemische Optimierung der Substanzen hinsichtlich der Fett-/Wasserlöslichkeit, der Absorptionscharakteristika und der Quantenausbeuten.
Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, dass sie eine hohe Phototoxizität aufweisen. So wurde überraschenderweise festgestellt, dass bei Bestrahlung mit Licht bereits geringe Dosierungen, beispielsweise in der Größenordnung von 0,01 bis 1 µg/ml, insbesondere von 0,1 bis 0,5 µg/ml ausreichend sind, um eine gewünschte Phototoxizität zu erreichen, während bei bekannten Verbindungen des Standes der Technik üblicherweise mindestens 5 µg/ml für eine ausreichende Phototoxizität erforderlich sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind darüber hinaus sehr stabil, Zudem können sterile Arzneimittelzubereitungen hergestellt werden, da als Ausgangsstoff pyro-Bakteriopheophorbid a eingesetzt werden kann, welches autoklaviert werden kann. Ausgehend von sterilem pyro- Bakteriopheophorbid können dann arzneimitteltaugliche erfindungsgemäße Verbindungen durch Umsetzung in Reinräumen erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ein zentrales Metallatom M enthalten (Verbindungen der Formel II). Bevorzugt ist der Ionenradius eines solchen Zentralatoms M kleiner als 95 µm. Bevorzugt werden das Zentralatom M aus Metallen der III und/oder IV Hauptgruppe sowie aus den Nebengruppenelementen ausgewählt. Beispiele für geeignete divalente Zentralatome M sind Mg, Sn(II), Pd, Pt, Co, Ni, Cu, Zn, Mn und Fe. Beispiele für geeignete trivalente Zentralatome M sind Fe, Mn, Al, Ga, Co, Rh und Ir. Beispiele für geeignete tetravalente Zentralatome M sind Sn(IV), Si, Ge, Pt und Ir. In verschiedenen Porphyrinen sind verschiedene Oxidationsstufen bevorzugt. Im Fall von tetravalenten Zentralatomen, beispielsweise Sn(IV) kann eine zweifach positive Nettoladung resultieren, die dann durch Gegenionen kompensiert wird. Geeignete Gegenionen sind beispielsweise Acetat-Anionen.
Die Verwendung von Verbindungen, welche Al als Zentralatom aufweisen ist insbesondere in diagnostischen Anwendungen bevorzugt.
Die Erfindung umfasst weiterhin Verbindungen, welche kein zentrales Metallatom aufweisen (Verbindungen der Formel I). Diese sind in vielen Anwendungen, insbesondere bei therapeutischen Anwendungen bevorzugt.
Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die Reste R¹ bzw. R². Diese stellen jeweils unabhängig =O, =N-R⁶ oder =C(R⁶)(R⁷) dar, mit der Maßgabe, dass wenigstens einer von den Resten R¹ und R² nicht Sauerstoff ist. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich also um Verbindungen, welche an mindestens einem Carbonylsauerstoff des Porphyrinsystems derivatisiert worden sind. Die Derivatisierung kann dabei an der Carbonylgruppe in Position 13-1 oder an der Carbonylgruppe in Position 3a oder an beiden Carbonylgruppen erfolgt sein.
Bevorzugt hat mindestens einer von den Resten R¹ und R² die Bedeutung N-R⁶. R⁶ ist dabei ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen. R⁶ kann einen linearen, verzweigten oder cyclischen sowie einen gesättigten, ungesättigten oder aromatischen Rest darstellen. Weiterhin kann die Kohlenstoffkette des Restes R⁶ durch ein oder mehrere, insbesondere durch 1 bis 5 Heteroatome ausgewählt aus Sauerstoff (O), Stickstoff (NH) und Schwefel (S) unterbrochen sein. R⁶ umfasst weiterhin nicht-substituierte sowie substituierte Kohlenwasserstoffreste, etwa Kohlenwasserstoffreste, welche eine oder mehrere, insbesondere 1 bis 5, bevorzugt 1 bis 3 funktionelle Gruppen aufweisen. Die funktionellen Gruppen befinden sich in einer bevorzugten Ausführungsform endständig an dem Rest R⁶. Geeignete funktionelle Gruppen sind beispielsweise = O, = S, OH, SH, NH₂, CHO, COOH, COOR⁸, SO₃ ^- und/oder PO₄. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt R⁶ die Formel -((CH₂)_k-X)_l-(CH₂)_m-Y, worin k eine ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt 2 ist, l eine ganze Zahl von 0 bis 10, bevorzugt 0, 1 oder 2 ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, X ausgewählt ist aus O, N und S und Y einen Substituenten darstellt, ausgewählt aus OH, SH, NH₂, CHO, COOH, COOR⁸, PO₄ ^- und SO₃ ^-.
Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und (II), in denen mindestens einer von den Resten R¹ und R² N-R⁶ darstellt, können durch Umsetzung der entsprechenden Prophyrinsysteme, welche zwei Carbonylgruppen aufweisen, mit einem Amin erhalten werden.
Durch die Auswahl des Restes R⁶ können insbesondere die Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen und damit ihre Verteilung in verschiedenen Geweben beeinflusst werden. So führt z. B. die Verwendung von Fettsäureresten mit C₁₄-C₂₅ als R⁶ zu einer erhöhten Einlagerung der Verbindungen in Membranen. Die Verwendung von Resten R⁶, welche hydrophile Substituenten aufweisen, führt hingegen zu einer erhöhten Wasserlöslichkeit der Verbindungen. Während hydrophile Gruppen die Löslichkeit in Blut erhöhen führen lipophile Gruppen zu einem verbesserten Membranübergang. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist R⁶ ein C₄-C₁₀-Kohlenwasserstoffrest.
Beispiele für besonders bevorzugte Reste R⁶ sind n-Hexyl, 2- Hydroxyethyl-, Carboxypentyl-, Hydroxyethoxyethyl, 5-Aminopentyl und 5-Sulfonylpentyl.
Weiterhin wird darauf hingewiesen, dass Verbindungen, in denen wenigstens einer von den Resten R¹ und R² die Bedeutung N-R⁶ aufweist in zwei tautomeren Formen vorliegen können, nämlich als Imin mit dem Formelausschnitt:

und als Enamin, umfassend den Formelausschnitt:
Beide tautomeren Formen der Verbindungen sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Im Falle der Umsetzung einer pyro- Bakteriopheophorbidverbindung mit einem primären Amin H₂NR⁶ ist R⁹ Wasserstoff, im Falle der Umsetzung mit einem sekundären Amin HNR⁶R⁶ hat R⁹ die oben für R⁶ angegebenen Bedeutungen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt mindestens einer der Reste R¹ oder/und R² die Gruppe = C(R⁶)(R⁷) dar. Solche C=C-verknüpfte Derivate können z. B. durch Reaktionen der entsprechenden Carbonylverbindungen mit Carbonionen, etwa durch eine Wittig-Reaktin, eine Mannich-Reaktion oder eine Aldolkondensation hergestellt werden. R⁶ weist dabei die oben angegebenenen Bedeutungen auf und R⁷ hat die Bedeutung Wasserstoff oder R⁶, wobei die beiden Substituenten R⁶ an einem C gleich oder verschieden sein können.
Die Reste R³ und R⁴ stellen bevorzugt Wasserstoff dar (≈⁣ pyro- Bakteriopheophorbid).
R⁵ stellt Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen dar oder im Fall von Salzen der Verbindungen (I) und (II) ein Gegenion. Bevorzugte Gegenionen sind z. B. Li⁺, K⁺, NH₄ ⁺, Na⁺, (Mg)_0,5 ⁺ und (Ca)_0,5 ⁺. (n Lösung oder in physiologischer Umgebung liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen dann als freie Säureanionen an der Gruppe 17 (also C^17aH₂-C^17bH₂-C^17cOO^-) vor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt R⁵ Wasserstoff oder Na⁺ dar. Geeignete Kohlenwasserstoffreste für R⁵ können linear, verzweigt oder cyclisch sowie gesättigt, ungesättigt oder aromatisch sein. Bevorzugt enthält der Rest R⁵ 2 bis 30, besonders bevorzugt 4 bis 10 Kohlenstoffatome.
Die Kohlenstoffkette des Restes R⁵ kann durch ein oder mehrere, insbesondere durch 1 bis 5 Heteroatome ausgewählt aus Sauerstoff (O), Stickstoff (NH) und Schwefel (S) unterbrochen sein. R⁵ umfasst weiterhin nicht-substituierte sowie substituierte Kohlenwasserstoffreste, etwa Kohlenwasserstoffreste, welche eine oder mehrere, insbesondere 1 bis 5, mehr bevorzugt 1 bis 3 funktionelle Gruppen aufweisen. Geeignete funktionelle Gruppen sind beispielsweise =O, =S, OH, SH, NH₂, CHO, COOH, COOR⁸, SO₃ ^- oder PO₄ ^- _.
Besonders bevorzugte Reste R⁵ sind der Methanolrest, der Ethanolrest, der Phytolrest sowie der Geranylgeraniolrest. Der Rest R⁵ an der Propionsäuregruppe an Position 17 kann auf einfache Weise durch Verestern (z. B. Zugabe eines entsprechenden Alkohols und einer Säure oder durch Zugabe eines entsprechenden Alkohols und Dicyclocarbohexyldiimid (DCC)) an die freie Säuregrupe angebracht werden, um beispielsweise die Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen weiter zu beeinflussen.
R⁸ stellt hierin einen C₁-C₁₂-Kohlenwasserstoffrest dar. Auch dieser Rest kann linear, verzweigt oder cyclisch sowie gesättigt, ungesättigt oder aromatisch sein und durch ein oder mehrere, insbesondere durch 1 bis 5 Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel unterbrochen sein. R⁸ kann weiterhin substituiert oder nicht substituiert sein, insbesondere mit einem der oben bei R⁵ genannten Substituenten. Besonders bevorzugt stellt R⁸ einen Alkylrest, insbesondere einen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- oder Hexylrest dar.
Die Erfindung umfasst auch die Salze der oben genannten Verbindungen. Eine Salzbildung kann insbesondere an der Propionsäuregruppierung C17 erfolgen, wobei mögliche Gegenionen z. B. Li⁺, Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, (Mg)⁺ _0,5 sowie (Ca)⁺ _0,5 sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf einfache Weise durch Umsetzung von Phorphyrinsystemen, welche zwei Carbonylgruppen aufweisen, mit einer Aminverbindung hergestellt werden. Die Erfindung betrifft somit weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder (II), worin mindestens einer von den Resten R¹ und R² N-R⁶ darstellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) oder (IV)

oder

mit einem Amin der allgemeinen Formel HN(R⁶)(R⁷) umsetzt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Porphyrinsysteme von Bakteriochlorophyllverbindungen insbesondere von pyro- Bakteriopheophorbiden mit herkömmlicher Carbonylchemie derivatisiert werden können. Zur Bildung des Imins ist die bloße Zugabe einer entsprechenden Aminverbindung ausreichend. Bei der Aminverbindung kann es sich um ein sekundäres Amin handeln, wobei dann ein Enamin gebildet wird. Bevorzugt wird jedoch eine primäre Aminverbindung eingesetzt (d. h. R⁷ = H).
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann unmittelbar durch Umsetzung einer Verbindung (III) oder (IV), welche bereits die gewünschten Gruppen M, R³, R⁴ und R⁵ enthält, hergestellt werden. Alternativ ist es auch möglich, die Gruppen M, R³, R⁴ oder/und R⁵ nach Umsetzung der Verbindungen (III) oder (IV) mit einem Amin zu verändern bzw. anzubringen oder zu entfernen, insbesondere eine Veresterung an Position 17c durchzuführen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können vorteilhaft aus Bakteriochlorophyll-a (BCla) beispielsweise wie folgt erhalten werden. In einem ersten Schritt wird BCla mit einer Säure, beispielweise mit 1 N HCl umgesetzt und das metallfreie Bakteriopheophytin a (Bphe) gebildet. Durch Umsetzung mit Trifluoressigsäure wird das Bakteriopheophorbid-a (Bpheida) gebildet, welches an Position 17 eine freie Säuregruppe aufweist. Durch Umsetzung mit Collidin, bevorzugt bei erhöhten Temperaturen von beispielsweise 150 bis 300°C, insbesondere bei 200 °C wird die COOCH₃ Gruppe an Position 13-2 entfernt und das pyro- Bakteriopheophorbid a gebildet (p-Bpheida). Dieses kann durch Derivatisierung an den Carbonylkohlenstoffen, beispielsweise mit einem primären oder sekundären Amin, oder mit einem Carbonion, zu den erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden. Vorteilhaft ist dabei, dass p-Bpheida eine hohe thermische Stabilität aufweist und sogar autoklaviert, also sterilisiert werden kann. Da p-Bpheida kein reaktives Wasserstoffatom an Position 13-2 aufweist, treten bei der Umsetzung keine oder nur sehr wenige unerwünschte Nebenreaktionen auf. Durch Umsetzung von erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen R⁵ = Wasserstoff ist, mit einem Alkohol, gegebenenfalls in Gegenwart einer Säure, kann die Säuregruppe in Position 17c verestert werden. Durch Einbringung hydrophiler oder hydrophober Gruppen an dieser Position können die Löslichkeitseigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen beeinflusst werden. Weiterhin ist es möglich, ausgehend von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) durch Umsetzung mit Metallatomen die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II) herzustellen.
Zur erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen R¹ oder/und R² für C(R⁶)(R⁷) steht, gelangt man durch Umsetzung der entsprechenden pyro- Bakteriopheophorbide mit Carbonionen, beispielsweise in einer Wittig- Reaktion, Mannich-Reaktion oder Aldolkondensation.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere zur Verwendung in der photodynamischen Therapie geeignet. Die Erfindung umfasst deshalb weiterhin ein Arzneimittel, welches mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen enthält. Das Arzneimittel kann weiterhin übliche Hilfs- bzw. Trägerstoffe umfassen. Es ist auch möglich, Kombinationspräparate bereitzustellen, welche neben einer erfindungsgemäßen Verbindung wenigstens einen weiteren Wirkstoff enthalten.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden insbesondere derart formuliert, dass sie zur intravenösen, topischen, intratumoralen oder/und intraarteriellen Verabreichung geeignet sind. Aufgrund der hohen Phototoxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen ist es möglich, diese in deutlich geringeren Mengen als bisher bekannte Phototherapeutika einzusetzen. So beträgt die Menge an Wirkstoff, die üblicherweise einen Patienten pro Tag verabreicht wird, von 0,01 mg/kg bis 50 mg/kg, insbesondere von 0,1 mg/kg bis 5 mg/kg Körpergewicht. Während die Dosierung bei topischer Anwendung eher im oberen Bereich liegt, können bei intravenöser, intratumoraler oder intraarterieller Verabreichung bevorzugt Mengen von 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht zum Einsatz kommen.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann als therapeutisches oder/und diagnostisches Mittel eingesetzt werden. Besonders bevorzugt dient es zur Verwendung in der photodynamischen Therapie. Indikationen, die durch photodynamische Therapie behandelt werden können sind insbesondere Tumorerkrankungen wie etwa Glioblastoma multiforme, Hirntumore, Kopf-Hals-Tumore, Hauttumore, Basalzellkarzinome, Melanome, Tumore des Oesophagus und des Gastro-Intestinaltraktes, Lungentumore, Prostatakarzinome, Prostatadysplasien, Cervixkarzinome, Cervixdysplasien, Blasentumore und Brustkrebs. Darüber hinaus kann die photodynamische Therapie auch bei den folgenden Indikationen erfolgreich eingesetzt werden: Photoangioplastie der Artherioseklose, Psoriasis, Immunmodulation, z. B. rheumatische Arthritis, antimikrobielle Therapie in der Wunddesinfektion, Parodontosebehandlung, permanente Haarentfernung, aktinische Keratose, Akne, photodynamische Diagnostik, altersbedingte Makulardegeneration (AMD) und andere Erkrankungen des Sehapparates, choroidale Neovaskularisierung sowie Sterilisierung von Blut und Blutprodukten. Die Verbindungen können sowohl zur Prophylaxe und/oder Behandlung als auch zur Diagnose der genannten Erkrankungen eingesetzt werden. Zur Behandlung und/oder Prophylaxe werden dabei bevorzugt Verbindungen der Formel (I) eingesetzt, während zur Diagnose bevorzugt Verbindungen der Formel (II) eingesetzt werden, insbesondere Verbindungen mit fluoreszierenden Eigenschaften, welche beispielsweise durch das Zentralatom Al verstärkt werden können. Als diagnostisches Mittel werden die Verbindungen insbesondere zur Diagnose von Krebs sowie von stark proliferierenden Gewebe eingesetzt.
Die phototoxischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen können darüber hinaus zur in vitro Abtötung von Mikroorganismen eingesetzt werden. Eine solch ein vitro Abtötung ist beispielsweise bei der Blutreinigung oder zur Keimfrei-Machung von Blutkonserven sowie als Desinfektionsmittel von Interesse.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können weiterhin auch zur in vivo Abtötung von Mikroorganismen eingesetzt werden, beispielsweise zur Unterstützung der Wundheilung.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Fig. 1 zeigt die Umsetzung eines pyro-Bakteriopheophorbids mit einem primären Amin zum pyro-Bakteriopheophorbidiminderivat. Beispielhaft ist die Derivatisierung an Position 13-1 gezeigt. Die Derivatisierung kann aber auch an Position 3a oder an beiden Positionen 3a und 13-1 erfolgen.
Fig. 2 zeigt den Syntheseweg zur Herstellung von pyro- Bakteriopheophorbid a ausgehend von Bakteriochlorophyll a.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Stabilitäten von Bakteriochlorphyll a und dem erfindungsgemäßen Hexylaminderivat von pyro- Bakteriopheophorbid a.
Fig. 4 zeigt die Toxizitätswerte (d. h. die toxische Wirkung auf Gewebe ohne Bestrahlung mit Licht) sowie Phototoxizitätswerte (d. h. die toxische Wirkung auf Gewebe mit Bestrahlung mit Licht) von vier erfindungsgemäßen Verbindungen, nämlich vom n-Hexylaminderivat des pyro-Bakteriopheophorbids, vom Ethanolaminderivat des pyro- Bakteriopheophorbids, vom Pentanolaminderivat des pyro- Bakteriopheophorbids sowie vom Aminohexansäurederivat des pyro- Bakteriopheophorbids. Weiterhin ist in Fig. 4 die geringe benötigte Menge an Wirkstoff zum Erzielen der phototoxischen Wirkung dargestellt.

Beispiele

Allgemeine Vorschriften

HPLC-Analysen

Agilent 1100-System bestehend aus: quarternäre Pumpe mit Laufmittelentgasung G1354A, Autosampler G1327A, Säulenofen G1316A, PDA-Detektor G1315B
250 mm × 4 mm Nucleosil 100-C18 (5 µm) mit 8 × 4 mm Vorsäule thermostatisiert auf 20°C, Eluent A: Methanol, Eluent B: Ethanol/n- Hexan 1 : 1, Eluent C: 10 mM wässriger K-PO4-Puffer pH 6,8, Detektion bei λ = 254 und 750 nm.

Beispiel 1

Herstellung von pyro-Bakteriopheophorbid a

Eine Lösung von 905 mg (1 mmol) Bakteriochlorophyll-a_gg (BChI-a_gg; der Geranylgeraniol-Ester an Position 17 von Bakteriochlorophyll-a) in 500 ml Methanol wird unter Argon innerhalb von 15 Minuten unter Rühren mit 25 ml 1 N-Salzsäure versetzt. Im Anschluss werden 30 g Celite 503 (Merck 1.026921) zugegeben, 15 min gerührt und die Feststoffe abfiltriert. Der Filterkuchen wird dreimal mit je 150 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen werden über MgSO₄ getrocknet, filtriert und im Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedamft. Nach Umkristallisation aus Aceton/Methanol (1 : 2) (Walter et al., Helvetica Chimica Acta 62 Fasc. 3 (1979), 899-920) erhält man 592 mg (67% der Theorie) Bakteriopheophytin-a_gg (Bphe-a_gg).
883 mg (1 mmol) Bakteriopheophytin-a_gg (Bphe-a_gg) werden in 25 ml 80 %-iger wässriger Trifluoressigsäure gelöst und unter Argon für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend in 400 ml Wasser gegeben, zusammen mit 10 g Celite für 20 min gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird über MgSO₄ getrocknet und im Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 30 ml Chloroform/Hexan (1 : 2) aufgenommen und für 24 h auf -80°C gekühlt. Die ausgefallenen Kristalle werden in der Kälte abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 430 mg (70% der Theorie) Bakteriopheophorbid-a (Bpheida). Das Verhältnis der an C13-2 diastereomeren Produkte beträgt nach HPLC-Analyse 95 : 5 (Methode A: t_R (I_s1) = 5,59 min, t_R (I_s2) = 6,00 min).
611 mg (1 mmol) Bpheida werden unter Argon in 40 ml Collidin gelöst und unter Argon 90 min auf 200°C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung auf 250 ml n-Hexan gegossen und der gebildete Niederschlag abfiltriert. Das so erhaltene Collididiumsalz des pyro-Bakteriopheophorbid a wird sechsmal mit je 15 ml n-Hexan gewaschen. Nach Trocknen im Hochvakuum erhält man 494 mg (73% der Theorie) pBpheida-Collidiniumsalz als blauschwarze, mikrokristalline Substanz.

Beispiel 2

Synthese von pyro-Bakteriopheophorbid-a-Methylester (p-BPheid-a-Me)

Unter Argon werden 674 mg (1 mmol) p-BPheid-a Collidiniumsalz in 140 ml Methanol/Chloroform 3 : 5 gelöst und mit 0,6 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Nach 8 h Rühren bei Raumtemperatur ist die Reaktion beendet. Die Reaktionskontrolle erfolgt durch HPLC-Analyse eines in Methanol gelösten Aliquots mit der Methode A, t_R(Edukt): 6,3 min, t_R(Produkt): 11,3 min, t_RNebenprodukt): 11,9 min. Zur Aufarbeitung wird auf 350 ml Chloroform gegossen und mit einer Lösung von 1,75 g Natriumhydrogencarbonat in 140 ml Wasser extrahiert, anschließend wird die organische Phase zweimal mit 80 ml Wasser gewaschen und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Abdestillieren des Lösungsmittels im Rotationsverdampfer werden zur trockenen Substanz 50 ml Methanol gegeben und 5 Minuten gerührt. Die Suspension wird über eine G-4 Glasfritte abgesaugt und der Filterrückstand mit 5 ml Methanol gewaschen, das Nebenprodukt befindet sich im Filtrat. Trocknung im Hochvakuum ergibt 380 mg (55%) des p-BPheid a Methylesters.

Beispiel 3

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorid-a mit Stickstoffbasen

Allgemeine Arbeitsvorschrift

135 mg (0,2 mmol) pyro-Bakteriopheophorbid a Collidiniumsalz werden in 40 ml Toluol suspendiert. Zu dieser Suspension wird dann ein primäres oder sekundäres Amin zugegeben.
Im Fall von flüssigen Aminen (Variante A) werden 40 mmol der Stickstoffbase direkt der Lösung von p-Bpheida zugegeben. Im Falle von festen Aminen (Variante B) werden zunächst 40 mmol der Stickstoffbase in 40 ml Toluol suspendiert und dieser Mischung 4 ml Pyridin zugesetzt. Die erhaltene klare Lösung wird dann der Lösung von p-Bpheida Collidiniumsalz zugegeben.
Die so erhaltene Reaktionsmischung wird unter Argon bis zum Rückfluss erhitzt und die Umsetzung dünnschichtchromatografisch an Kieselgel 60F254 (Merck), Laufmittel 85 : 15 Chloroform:Methanol (Vol : Vol) oder durch HPLC verfolgt. Rf des Eduktes: 0,76 (rot) Rf der Produkte: 0,1-0,5 (violett).
Die Reaktionszeiten und Bedingungen für ausgewählte Synthesen sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf 300 ml Chloroform gegossen, unter Eiskühlung 4 ml Eisessig zugetropft und einmal mit 400 ml Wasser extrahiert. Die abgetrennte organische Phase wird erneut mit 2 ml Eisessig versetzt und dreimal mit je 200 ml Wasser extrahiert. Nach Trocknung der organischen Phasen mit Natriumsulfat erfolgt die Reinigung des Produkts durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Säule 5 × 20) mit Chloroform/Methanol. Das Edukt wird zunächst mit Chloroform/Methanol (9 : 1) abgetrennt. Durch stufenweise Erhöhung des Methanolanteils werden dann die jeweiligen Produkte eluiert.
Das Eluat wird mit 5 g NaHCO₃ versetzt, 5 Minuten gerührt und das Lösungsmittel nach Filtration im Rotationsverdampfer abgezogen. Der feste Rückstand wird in 7 ml Methanol aufgenommen, über einen Membranfilter mit Porengröße 0,2 µm filtriert und im Rotationsverdampfer eingeengt. Trocknung im Hochvakuum ergibt die jeweiligen Natriumsalze als blauschwarze Feststoffe (Ausbeuten siehe Tabelle 1).

Beispiel 3.1

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorbid-a mit n- Pentylamin (p-BPheida-pen)

HPLC: t_R = 7,4 min (Methode B)
DC: R_f = 0,23
UV-Vis (CH₃OH): λ_max [nm] (A_rel): 362 (1), 380sh (0,061), 528 (0,22), 706sh (0,09), 756 (0,87)
MS (ESI): Massenfeinbestimmung von [M+H]⁺:
Summenformel C₃₈H₄₈N₅O₃:
berechnet: 622,376 g/mol,
gefunden: 622,376 g/mol, m/z (rel. Intensität): 622 (100)

Beispiel 3.1

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorbid-a mit n-Hexylamin (p-BPheida-hex)

HPLC: t_R = 7,4 min (Methode B)
DC: R_f = 0,24
UV-Vis (CH₃OH): λ_max [nm] (A_rel): 361 (1), 381sh (0,62), 528 (0,2), 685sh (0,1), 756 (0,75)
MS (ESI): Massenfeinbestimmung von [M+H]⁺:
Summenformel C₃₉H₅₀N₅O₃:
berechnet: 636,391 g/mol,
gefunden: 636,391 g/mol, m/z (rel. Intensität) 636 (100)

Beispiel 3.3

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorbid-a mit n-Octylamin (p-BPheida-oct)

HPLC: t_R = 7,6 min (Methode B)
DC: R_f = 0,26
UV-Vis (CH₃OH): λ_max [nm] (A_rel): 362 (1), 382sh (0,58), 528 (0,23), 696sh (0,08), 756 (0,93)
MS (ESI): Massenfeinbestimmung von [M+H]⁺:
Summenformel C₄₁H₅₄N₅O₃:
berechnet: 664,423 g/mol,
gefunden: 664,424 g/mol, m/z (rel. Intensität) 664 (100)

Beispiel 3.4

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorbid-a mit Ethanolamin (p-BPheida-et)

HPLC: t_R = 6,6 min (Methode B)
UV-Vis (CH₃OH): λ_max [nm] (A_rel): 362 (1), 384sh (0,53), 528 (0,2), 630 (0,03), 692sh (0,08), 756 (0,90)
MS (ESI): Massenfeinbestimmung von [M+H]⁺:
Summenformel C₃₅H₄₂N₅O₄:
berechnet: 596,3236 g/mol,
gefunden: 596,3234 g/mol, m/z (rel. Intensität) 596 (100)

Beispiel 3.5

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorbid-a mit 2- Aminoethoxyethanol (p-BPheida-etet)

HPLC: t_R = 6,7 min (Methode B)
UV-Vis (CH₃OH): λ_max [nm] (A_rel): 362 (1), 382sh (0,58), 528 (0,24), 630 (0,03), 694sh (0,08), 756 (0,92)

Beispiel 3.6

Umsetzung von pyro-Bakteriopheophorbid-a mit 5- Aminopentanol (p-BPheida-peo)

HPLC: t_R = 6,8 min (Methode B)
UV-Vis (CH₃OH): λ_max [nm] (A_rel): 362 (1), 384sh (0,61), 528 (0,26), 696 (0,08), 756 (1)

Beispiel 4

Stabilitätsassay am Beispiel von p-Bpheida-hex

p-Bpheida-hex (vgl. Beispiel 3.2) wurde bei einer Konzentration von 5 mg/ml in Tween-80 (Sigma, Ref. Nr. P8074) unter Rühren und durch die Verwendung von Ultraschall gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit 9 Volumen Hanks-Pufferlösung oder HBSS (Sigma, Ref.Nr. H6648) unter Rühren gemischt, bis das gesamte Material gelöst war. Verbleibende Feststoffe wurden durch einen 0,2 µm Filter entfernt. Um sicherzustellen, dass die Gesamtmenge des erfindungsgemäßen Photosensibilisators gelöst war, wurden Absorptionsspektrometriemessungen (Jasco, V550 UV-Vis-Absorptionsspektrometer) mit der Formulierung vor und nach dem Filtrationsschritt durchgeführt.
Die p-Bpheida-hex-Lösung wurde 1 : 200 in einer isotonischen Salzlösung (NaCl 0,9%; B. Braun, Ref Nr. 37730913) verdünnt. Das Absorptionsspektrum unmittelbar nach der Verdünnung mit NaCl bestand aus drei Hauptpeaks bei 362, 533 und 757 nm. Nach Lagerung bei -20 °C, +20°C bzw. 37°C wurden selbst nach 48 Stunden keine signifikanten Abnahmen der Intensität der Hauptabsorptionspeaks beobachtet.
Bei Bestrahlung der Lösung bei 600 bis 800 nm (rot gefilterte KL2500 LCD-Kaltlichtquelle, Schott) bei 1 bzw. 2 J/cm² wurde weder eine Verschiebung des Absorptionsspektrums noch eine wesentliche Modifikation (> 5%) der Absorptionsintensitäten beobachtet.
Die Ergebnisse der Stabilität gegenüber Bestrahlung sind in Fig. 3 dargestellt. Fig. 3b zeigt die Stabiltität des Hexylaminderivats von pyro- Bakteriopheophorbid-a, wobei deutlich zu sehen ist, dass keine merklichen Intensitätsunterschiede auftreten. Zum Vergleich dazu weist Bakteriochlorophyll a nach Bestrahlung deutlich abweichende Absorptionsspektren auf, welche einen Zerfall von Bakteriochlorophyll a bei Bestrahlung (Photobleaching) anzeigen.

Beispiel 5

Toxizitäts- und Phototoxizitätsuntersuchungen

HT-29-Zellen (Humancolorektaladenokarzinom, ECCAC-Nummer 91072201 (L. Morlet et al., J. Photochem. Photobiol. B, 39 (1997) 249-257 wurden auf einem RPMI 1640 Medium (Invitrogen, Referenznummer 32404-014) ergänzt mit L-Glutamin (2 mM), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und 10% fötalem Rinderserum oder FBS (Invitrogen, Referenznr. 10270-098) gezüchtet. 24 Stunden vor dem Experiment wurden die Zellen mit 10⁵ Zellen/ml in Vertiefungen von 96- Wellplatten eingesetzt. Nach mindestens 20 Stunden wurden die Zellen mit pBpheida-hex-Formulierung bei einer Konzentration von 0 bis 0,5 µg/ml für 1 Stunde inkubiert. Das Medium wurde dann abgespült und die Zellen bei 600 bis 800 nm bestrahlt. Die Bestrahlung erfolgte mit 20 mW/cm² und die Bestrahlungsdauer war eingestellt, um eine Energie von 10 bzw. 20 J/cm² zu erhalten.
Die Zelllebensfähigkeit wurde durch den MTT-colorimetrischen Assay gemessen. Zählungen wurden 24 Stunden nach dem Ende des Experiments durchgeführt. Die Zellen wurden dazu mit 100 µl Medium ohne FBS gewaschen und es wurde 15 µl Phosphat-gepufferte Salzlösung [(PBS)-MTT-Lösung (5 mg/ml PBS)] zugegeben. 4 Stunden später wurde angesäuertes Isopropanol (150 µl 0,04 N HCL in Isopropanol) zugegeben und die Zellen wurden beschallt (McHale et al., Cancer Letters, 41 (1988) 315-321. Mikroplatten wurden dann hinsichtlich der optischen Dichten bei 570 nm durch die Verwendung eines Plattenlesers (Photometer Sunrise RC, Tecan) ausgewertet. Standards, welche Medium und 15 µl der MTT-Lösung enthielten wurden verwendet, um die Leerwerte für die Absorptionsmessungen zu bestimmen.
Die Überlebensrate betrug zwischen 94 und 100%, wenn HT-29-Zellen mit pBpheida-hex in Abwesenheit von Licht inkubiert wurden. Die Überlebensrate der Zellen nahm bei Bestrahlung deutlich ab. Die Photosensibilisatordosis, welche 50% Zelltod verursachte (LD50) betrug 229 ng/ml bzw. 77 ng/ml bei einer Bestrahlung von 10 bzw. 20 J/cm².
Die Ergebnisse der Toxizitäts- bzw. Phototoxizitätsuntersuchungen sind auch in Fig. 4 dargestellt.
Entsprechende Versuche wurden auch mit dem Ethanolaminderivat des pyro-Bakteriopheophorbids, mit dem Pentanolaminderivat des pyro- Bakteriopheophorbids sowie mit dem Aminhexansäurederivat des pyro- Bakteriopheophorbids durchgeführt.
Die durchgeführten Versuche zeigen, dass das n-Hexylaminderivat des pyro-Bakteriopheophorbids in wässrigen Lösungen ausreichend löslich ist. Es kann somit ohne weiteres in eine für die photodynamische Therapie geeignete Darreichungsform gebracht werden. Weiterhin ist die Verbindung, selbst in Lösung, über einen hinreichend langen Zeitraum stabil, sodass sie ohne weiteres auch in der Praxis zum Einsatz kommen kann. Weiterhin zeigte sich, dass die Verbindung auch bei Bestrahlung sehr stabil ist, sodass die Bildung von unerwünschten Abbauprodukten bei Bestrahlung gering gehalten werden kann. Weiterhin zeigt sich, dass die Verbindung ohne Bestrahlung nur eine sehr geringe Toxizität aufweist, während sie eine hohe Phototoxizität besitzt. Dieser photodynamische Effekt war bei HT-29-Zellen sehr stark, wobei unter Dunkelheit praktisch überhaupt keine Toxizitätwirkungen beobachtet werden konnten. Dagegen zeigt sich eine sehr hohe Phototoxizität- Wirksamkeit bereits bei geringen Dosierungen von deutlich weniger als 1 µg/ml.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel

oder

worin
R¹ und R² jeweils unabhängig O, N-R⁶ oder C(R⁶)(R⁷) darstellen, worin R⁷ Wasserstoff oder R⁶ bedeutet und R⁵ jeweils unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen darstellt, mit der Maßgabe, dass wenigstens einer von den Resten R¹ und R² nicht Sauerstoff ist,
R³ und R⁴ jeweils unabhängig voneinander H oder OH darstellen,
R⁵ Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen darstellt und
M ein Metallatom ist sowie Salze davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer von den Resten R¹ und R² N-R⁶ darstellt.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R⁶ einen Kohlenwasserstoffrest mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R⁶ ein oder mehrfach substituiert ist mit O, S, OH, SH, NH₂, COOH, COOR⁸, CHO, SO₃ ^- oder/und PO₄ ^- oder unterbrochen ist durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, NH und S, wobei R⁸ ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist.

5. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das n-Hexylaminderivat von pyro- Bakteriopheophorin handelt.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder (II) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin mindestens einer von den Resten R¹ und R² N-R⁶ darstellt; dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) oder (IV)

oder

mit einem Amin der allgemeinen Focmel HN(R⁶)(R⁷) umsetzt, worin R⁷ und R⁶ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.

7. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), worin R³ = H, R⁴ = H und R⁵ = H, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem ersten Schritt eine Verbindung der Formel (VII)

mit Collidin zu einer Verbindung der Formel (VIII)

umsetzt und in einem zweiten Schritt die Verbindung der Formel (VIII) mit dem Amin der Formel HN(R⁶)(R⁷) umsetzt.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Forme) (I), worin mindestens einer von den Resten R¹ und R² C(R⁶)(R⁷) darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (III) oder (IV) mit einem Carbonion umsetzt.

9. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung der Formel (I) oder (II) nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

10. Arzneimittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es zur intravenösen, topischen, intratumoralen oder/und intraarteriellen Verabreichung vorgesehen ist.

11. Arzneimittel nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es eine zu verabreichende Menge an Wirkstoff von 0,1 bis 50 mg/kg Körpergewicht enthält.

12. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Verwendung in der photodynamischen Therapie.

13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung in der photodynamischen Therapie.

14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe, Therapie oder/und Diagnose von Tumorerkrankungen, Arteriossklerose, Psoriasis, altersbedingter Makuladegeneration (AMD), rheumatischer Arthritis, Herpes Simplex Infektionen oder/und Akne.

15. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung in der Photoangioplastie, zur Immunmodulation, zur antimikrobiellen Therapie in der Wunddesinfektion, zur Parodontose-Behandlung, zur permanenten Haarentfernung, zur Anwendung bei aktinischer Keratose für die photodynamische Diagnostik, zur choroidalen Neovaskularisierung oder/und zur Sterilisierung von Blut oder Blutprodukten.

16. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16 zur Behandlung, Prophylaxe oder/und Diagnose von Hirntumoren, Kopf-Hals- Tumoren, Hauttumoren, Basalzellkarzinomen, Melanomen, Tumoren des Oesophagus oder/und Gastro-lntestinaltraktes, Lungentumoren, Prostatakarzinomen oder/und -dysplasien, Cervixkarzinomen oder/und -dysplasien, Blasentumoren oder/und Brustkrebs.

17. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in vitro zur Abtötung von Mikroorganismen.

18. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo Abtötung von Mikroorganismen.