DE10131641A1

DE10131641A1 - Verbesserter und stabiler Extrakt aus Hypericum perforatum L., Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung als topisches Arzneimittel

Info

Publication number: DE10131641A1
Application number: DE10131641A
Authority: DE
Inventors: Egon Koch; Clemens Erdelmeier; Joachim Herrmann
Original assignee: Dr Willmar Schwabe GmbH and Co KG
Current assignee: Dr Willmar Schwabe GmbH and Co KG
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2002-06-27
Also published as: CN1264526C; DE50103262D1; WO2002051427A8; US7166310B2; ES2227318T3; ATE273017T1; CN1481250A; JP4177666B2; DK1345614T3; US20040137088A1; JP2004517101A; EP1345614A1; WO2002051427A1; MXPA03005657A; EP1345614B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten und stabilen Extrakt aus den oberirdischen Teilen von Hypericum perforatum L. sowie diesen Extrakt enthaltende topische Arzneimittel, insbesondere Gele, zur Behandlung von Haut- und Schleimhautkrankheiten wie z. B. Akne, atopische Dermatitis, Neurodermitis, Psoriasis, Stomatitis, Gürtelrose, Lippenherpes, Warzen, Wunden, Verbrennungen sowie anderen bakteriellen und viralen Haut- und Schleimhautinfektionen und Hauterkrankungen, die mit einer Zellproliferation und Entzündung einhergehen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten und sta bilen Extrakt aus den oberirdischen Teilen von Hypericum per foratum L. sowie diesen Extrakt enthaltende topische Arznei mittel, insbesondere Gele, zur Behandlung von Haut- und Schleimhautkrankheiten wie z. B. Akne, atopische Dermatitis, Neurodermitis, Psoriasis, Stomatitis, Gürtelrose, Lippenher pes, Warzen, Wunden, Verbrennungen sowie anderen bakteriellen und viralen Haut- und Schleimhautinfektionen und Hauterkran kungen die mit einer Zellproliferation und Entzündung einher gehen.

Hypericumextrakte werden seit vielen Jahren zur Behandlung von nervösen Störungen verwendet. Ihre Verwendung bei Depressionen und psychovegetativen Störungen hat in den vergangenen Jahren als Folge positiver klinischer Studienergebnisse stark zuge nommen [W. E. Müller, A. Singer, M. Wonnemann, DAZ 139 (17), 49-58 (1999)]. Die EP-A-0 599 307 beschreibt Primärextrakte aus Johanniskraut. Diese Primärextrakte werden durch einfache Ex traktion der Droge mit 96%igem bzw. 60%igem wässrigen Ethanol erhalten. In der DE-A-196 19 512 sowie DE-A-197 14 450 sind Extrakte beschrieben, die einen stabilen Gehalt des ansonsten sehr instabilen Johanniskrautinhaltsstoffs Hyperforin aufwei sen. Die WO 99/40905 beschreibt die Verwendung von Johannis krautextrakten zur Behandlung und Prophylaxe von Demenzerkran kungen. Schließlich werden in der DE-A-199 03 570 Hyperforin zubereitungen beschrieben, in denen das Hyperforin in Form eines Extraktes aus Johanniskraut vorliegt.

Die lokale Applikation von Hypericum-Extrakten - insbesondere in Form von Johanniskraut-Öl - zur Behandlung von Wunden, Ul zera, Verbrennungen, Myalgien, Prellungen etc. hat eine lange Tradition [P. Maisenbacher, Dissertation Uni Tübingen, 1991]. Diese erfahrungsmedizinischen Anwendungen erscheinen auf der Grundlage theoretischer Überlegungen und experimenteller Un tersuchungen rational begründet. So gibt es zahlreiche Hinwei se, dass Hypericum-Extrakte und einzelne Inhaltsstoffe über antivirale, antibakterielle, antiproliferative und entzün dungshemmende Eigenschaften verfügen.

Als maßgebliche Inhaltsstoffe mit antiviraler Aktivität in Hypericum-Extrakten wurden Hypericin und Pseudohypericin iden tifiziert [EP 0 256 452], Lavie, G.; Mazur, Y.; Lavie, D.; Meruelo, D. Med. Res. Rev. 15, (2), 111-119 (1995) [LAVIE, G.; VALENTINE, F.; LEVIN, B.; MAZUR, Y.; GALLO, G.; LAVIE, D.; WEINER, D.; MERUELO, D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, (15), 5963-5967 (1989)]. Außer gegenüber Retroviren besitzen diese Napthodianthrone antivirale Eigenschaften auch für andere mit einer Lipidhülle ausgestattete Viren, z. B. Herpesviren. Die antivirale Potenz von Hypericin ist vollständig von einer pho todynamischen Aktivierung abhängig bzw. wird unter dem Ein fluss von sichtbarem Licht entscheidend verstärkt. Diese Ei genschaft prädestiniert diese Inhaltsstoffe deshalb für die lokale Anwendung bei Virusinfektionen der Haut. Antivirale Wirkungen wurden auch für Aceton- und Wasserextrakte aus Hype ricum nachgewiesen., die vorwiegend Catechine und Flavon-Aglyka enthielten [Erdelmeier, C.; Koch, E.; Hörr, R. Hypericum perfora tum L.-St. John's Wort, Chemical, Pharmacological and Clini cal Aspects, in, Studies in Natural Products Chemistry', Vol. 22, Atta-Ur-Rahman (ed.), Elsevier, Amsterdam, 2000]. Auch von diesen Inhaltsstoffen ist eine therapeutisch relevante antivirale Wirkung in erster Linie bei einer topischen Anwen dung zu erwarten. In der Tat zeigte sich jetzt, dass erfin dungsgemäß hergestellte Extrakte über antivirale Wirkungen verfügen, die wesentlich stärker ausgeprägt sind, als die von reinem Hypericin (siehe Beispiel 3). Gleichzeitig verfügen solche Extrakte über einen großen therapeutischen Index, der den Unterschied zwischen den erwünschten antiviralen Eigen schaften und unspezifischen zytotoxischen Effekten kennzeich net.

Antibakterielle Wirkungen von. Hypericumextrakten sind sehr gut dokumentiert und werden vor allem auf den Gehalt an Hyperforin zurückgeführt. Hyperforin ist insbesondere wirksam gegenüber Gram-positiven Bakterien und besitzt antibakterielle Eigen schaften z. B. auch für Methicillin-resistente Staphylokokken, die wichtige Erreger von Hautinfektionen darstellen [Schempp, Ch. M.; Pelz, K.; Wittmer, A.; Schoepf, E.; Simon, J. C. Lancet 353, (9170), 2129-2129 (1999)]. Dies erscheint bedeutsam, da z. B. eine enge Korrelation zwischen Streptokokken und Staphylokokken-Infektionen und der Induktion oder dem Wieder aufflammen von Psoriasis besteht. Wie jetzt überraschend ge funden wurde, sind die antibakteriellen Effekte eines erfin dungsgemäßen Extraktes aber wesentlich stärker, als aufgrund des Gehaltes an Hyperforin zu erwarten wäre. Das bedeutet, dass die erfindungsgemäßen Extrakte andere wirksame antibakte rielle Inhaltsstoffe enthalten oder der Effekt von Hyperforin durch solche Extraktbestandteile verstärkt wird.

Hypericine verfügen neben antiviralen Wirkung auch über an tiproliferative Eigenschaften und werden deshalb gegenwärtig klinisch bei Tumorerkrankungen in Kombination mit einer photo dynamischen Therapie geprüft. Verantwortlich für die Unterdrü ckung der Zellproliferation ist höchstwahrscheinlich die Hem mung verschiedener an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligter Proteinkinasen. Da auch dieser Effekt lichtabhän gig ist, bietet sich für die therapeutische Nutzung dieser Wirkung ebenfalls eine topische Anwendung an. In erster Linie ist hierbei an die Behandlung der Schuppenflechte zu denken, die durch eine Hyperproliferation epidermaler Zellen charakte risiert ist.

Hyperforin besitzt außerdem ausgeprägte antiphlogistische Ei genschaften, indem es z. B. die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in entzündetes Gewebe unterdrückt. Über entzün dungshemmende Wirkungen verfügen auch die in den erfindungsge mäßen Hypericumextrakten enthaltenen Flavonoide. Flavonoide verfügen insbesondere über antioxidative Eigenschaften und sind dadurch z. B. in der Lage, die gewebeschädigenden Wirkun gen von reaktiven Sauerstoffradikalen, die von Leukozyten ge bildet werden, zu unterdrücken. Darüber hinaus ist bekannt, dass Flavonoide eine Vielzahl von Enzymsystemen beeinflussen können, die wichtige zelluläre Reaktionen steuern, die an der Pathogenese der Psoriasis beteiligt sind, wie z. B. Zellproli feration und Immunantwort.

Die Psoriasis ist eine chronische Hauterkrankung, die durch eine Hyperproliferation und abnormale Differenzierung von Ke ratinozyten sowie eine Entzündung der Epidermis und der Dermis gekennzeichnet ist. Mit den Standardbehandlungsmethoden ist zwar eine vorübergehende Verbesserung der Symptome und auch eine langfristige Kontrolle der Erkrankung zu erreichen, eine komplette Abheilung wird in der Regel aber nicht erzielt. Alle bisher bekannten Therapieansätze weisen außerdem mehr oder weniger schwerwiegende andere Nachteile (unangenehmer Geruch, Hautirritationen, erhöhtes Hautkrebsrisiko, Teratogenität etc.) auf. Es besteht deshalb weiterhin ein dringender Bedarf an wirksamen und nebenwirkungsarmen Methoden zur Behandlung der Psoriasis. Erfindungsgemäß wird dieses Bedürfnis durch die Verwendung von Extrakten aus oberirdischen Teilen von Johan niskraut (Hypericum perforatum L.) befriedigt, die wirksame Konzentrationen von Hypericin, Hyperforin und Flavonoiden ent halten.

Eine der meist verbreiteten Hauterkrankungen ist die Akne. Dabei handelt es sich um eine Entzündung der Talgdrüsen, die mit einem Untergang der Talgdrüsenfollikel einhergeht. Als auslösende Ursache der Akne werden androgene Hormone angese hen, die die Sekretproduktion in den Talgdrüsen stimulieren. Wenn gleichzeitig Abflussstörungen auftreten, kann es zu einer bakteriellen Besiedlung des Talgs mit nachfolgender perifolli kulärer Entzündung, Abszessbildung, Einschmelzung des Gewebes und einer Fremdkörperreaktion kommen. Es gibt Hinweise, dass in der Haut von Aknekranken das männliche Geschlechtshormon Testosteron unter Einfluss des Enzyms 5α-Reduktase verstärkt in die biologische stärkere Wirkform Dihydrotestosteron umge wandelt wird. Die Hemmung der 5α-Reduktase stellt deshalb eine Möglichkeit zur Behandlung der Akne dar. Es wurde nun überra schend gefunden, dass erfindungsgemäße Extrakte und verschie dene darin enthaltene Inhaltsstoffe eine ausgeprägte Hemmwir kung auf dieses Enzym ausüben und deshalb in Verbindung mit den vorstehend erwähnten antibakteriellen und entzündungshem menden Eigenschaften in hervorragender Weise zur Behandlung der Akne geeignet sind.

Aus der DE 198 54 446 A1 sowie aus der WO 00/30660 ist die Verwendung von Hyperforin und Hypericin sowie diese Komponen ten enthaltende Extrakte als Dermatika bekannt.

Diese Gesamtextrakte werden mit einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus Ethanol mit hohem Wasseranteil hergestellt. Er fahrungsgemäß enthalten solche Extrakte hohe Mengen an po lyphenolischen Gerbstoffen (Proanthocyanidine), die sich mit der Zeit immer stärker braun verfärben und letztlich die Zube reitung kosmetisch inakzeptabel werden lassen. Dies gilt eben so für die aus Pflanzenmaterialien in praktisch alle ethano lisch-wässrige Extrakte übergehenden grünen Pigmente (Chloro phylle). Diese Pigmente färben die Extrakte sehr stark und machen sie optisch unansehnlich. Solche Extrakte werden erfah rungsgemäß von Patienten nicht akzeptiert. Dies gilt insbeson dere für den Fall der Applikation auf unbedeckte Körperteile.

Die vorstehend beschriebenen Nachteile können mit dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Extrakt eliminiert werden. Überraschenderweise kann durch entsprechende Auswahl des Ex traktionsmittels die Extraktion polyphenolischer Gerbstoffe weitgehend unterdrückt werden. Die im resultierenden Primärex trakt vorhandenen grünen Pigmente können durch Filtration über ein Adsorptionsmittel, z. B. ein Adsorberharz nahezu vollstän dig entfernt werden. Der letztlich erhaltene erfindungsgemäße Extrakt ist kosmetisch-optisch akzeptabel und kann einfach in Salben, Cremes, Gele etc. für externe Zwecke eingearbeitet werden.

Bei den erfindungsgemäßen Zubereitungen mit Johanniskrautex trakt handelt es sich insbesondere um topisch zu applizieren de, hydrophile oder lipophile homogene, einphasige Zubereitun gen in Gelform (s. Beispiele 2a-2c). Diese Gele sind leicht auf die Haut aufzutragen und zu verreiben. Sie sind insbeson dere kosmetisch akzeptabel, d. h. auch bei nicht von Kleidung bedeckten Körperteilen ist nach dem Auftragen keine ungewöhn liche Verfärbung der Haut festzustellen.

Des Weiteren weist der erfindungsgemäße Extrakt den Vorteil auf, dass er die pharmakologisch relevanten Inhaltsstoffe Hy perforin, Hypericine und Flavone in idealer Kombination, auch mengenmäßig, enthält. So ist z. B. aufgrund der komplexen Pa thogenese der Psoriasis nicht zu erwarten, dass Substanzen mit einem einzelnen, selektiven Wirkmechanismus erfolgreich für die Therapie dieser Erkrankung eingesetzt werden können. Diese Einschätzung wird durch die klinischen Erfahrungen mit den etablierten Therapieverfahren bestätigt. Der erfindungsgemäße Extrakt aus Hypericum zeichnet sich deshalb dadurch aus, dass er verschiedene für die Behandlung der Psoriasis und anderer Hauterkrankungen wichtige Wirkmechanismen (z. B. antiviral, antibakteriell, antiphlogistisch, antiproliferativ) in sich vereinigt, wobei der Kombinationseffekt der einzelnen Kompo nenten über die Wirkung der Einzelstoffe deutlich hinausgeht (synergistischer Effekt).

Zur Stabilisierung des Extraktes bzw. der pharmazeutischen Zubereitung können dem Extrakt und/oder der pharmazeutischen Zubereitung (z. B. Gel) Stabilisatoren in einer zur Stabilisie rung des Hyperforins ausreichenden Menge zugesetzt werden. Bei den Stabilisatoren handelt es sich um die in der DE-A-196 19 512 beschriebenen Stabilisatoren, die vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01% bis 5%, insbesondere 0,2% bis 1%, bezogen auf den Extrakt, vorliegen. Des Weiteren kann es sich bei den Stabilisatoren um die in der DE-A-199 03 570 be schriebenen Komplexierungsmittel in einer zur Komplexierung des Hyperforins ausreichenden Menge handeln. Auf diese beiden Druckschriften wird im Zusammenhang mit der Stabilisierung des Hyperforins ausdrücklich Bezug genommen.

Beispiel 1 (Herstellung eines erfindungsgemäßen Extraktes)

3,1 kg Hypericum Droge wurden mit der 6,5-fachen Gewichtsmen ge Aceton 95 Gew.-% - EtOH 92 Gew.-% 8 : 2 als Extraktionsmit tel 1 min mit dem Ultraturrax homogenisiert (Lichtschutz). Die Lösung wurde danach im Laborextraktionsgefäß 1 h bei 50°C ext rahiert (N₂-Atmosphäre/Lichtschutz). Zur Extraktlösung wurden 5 g Ascorbinsäure zugegeben (1% auf die erwartete Extraktmen ge). Die Lösung wurde über eine Filternutsche (Seitz Supra 1500) abgesaugt. Der Drogenrückstand wurde noch zweimal mit der 6-fachen Gewichtsmenge Extraktionsmittel unter den glei chen Bedingungen extrahiert und filtriert.

Zu den vereinigten Filtraten wurden nochmals 5 g Ascorbinsäure zugegeben. Die Lösung wird schonend (max. 50°C Wärmebad/Licht schutz) zur Trockene eingeengt.
Ausbeute: 490,02 g = 15,8% (Hyperforingehalt: 5,75%/Hype ricingehalt: 0,45%).

Anschließend wurde die Probe in 92 Gew.-%-Ethanol gelöst und durch eine Fritte G2 filtriert. Auf der Fritte blieb ein ver nachlässigbarer Rückstand (ca. 2-3 g) zurück. 485 g des Extrak tes wurden dann auf eine mit Diaion HP-20 gepackte geschlosse ne Chromatographie-Säule aufgegeben.

Chromatographiebedingungen

Probe: 485 g mit 92 Gew.-% EtOH auf 15 l verdünnt.
Säulengröße: Füllhöhe 42 cm; Radius 10 cm
Säulenfüllung: Diaion HP-20, 0,3-0,8 mm Korngröße
Eluens:
1. EtOH 92 Gew.-% (100 l; →Fraktion 1)
2. EtOH 92 Gew.-% (40 l; →Fraktion 2)
2. Aceton 100% (45 l; Chlorophyllfraktion)
Fluss: Trennung ca. 1 l/min.

Ausbeute

Die Fraktion 1 enthielt den Hauptteil des Extraktes (412 g = 85%; Hyperforingehalt 6,3%; Hypericingehalt 0,50%; Ge samtflavone 6,4%). Diese Fraktion wurde in den Beispielen der Erfindung als erfindungsgemäßer Johanniskrautextrakt verwen det.

Beispiel 2a

Hypericumextrakt/Polyacrylat-Gel

Herstellung

Der Gelbildner (Polyacrylsäure, 1-3%, vorzugsweise 1,5%) wird in einer Mischung aus Wasser, Ethanol und Propylenglykol dispergiert. Der Extrakt (0,5-5%, vorzugsweise 2,5%) wird hinzugefügt und gemischt. Die Tromethaminlösung wird in klei nen Anteilen hinzugefügt und gemischt. Es bildet sich ein ho mogenes Gel. Zu dieser Basisrezeptur können Stabilisatoren wie z. B. Ascorbinsäure zugefügt werden.

Beispiel 2b

Hypericumextrakt-Tensidgel

Herstellung

Der Johanniskrautextrakt, das Tensid (Macrogol-Glycerol-Hydroxystearat), das Isopropylmyristat, das Neutralöl und das Propylenglykol werden homogen gemischt. Anschließend wird das Wasser unter Rühren zugefügt. Es bildet sich ein homogenes Gel. Zu dieser Basisrezeptur können Stabilisatoren wie z. B. Ascorbinsäure zugefügt werden.

Beispiel 2c

Hypericumextrakt-Kohlenwasserstoffgel

Herstellung

Die Vaseline wird durch Erwärmen geschmolzen, das Propylengly kol zugefügt und gemischt. Der Johanniskrautextrakt wird zuge geben, gemischt und kaltgerührt. Es bildet sich ein homogenes Gel.

Beispiel 3 Antivirale Wirkung

Für die Prüfung auf antivirale Eigenschaften des erfindungsge mäßen Extraktes und von Hypericin wurde der Herpes simplex-Virusstamm 1 (HSV-1), Stamm: McIntyre, (ATCC) verwendet.

Zur Beurteilung der "viruziden" Aktivität (Inaktivierungstest) wurden verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen in einem Volumen von 20 µl mit 980 µl Viruslösung gemischt und nach 1 h Inkubation auf eine Mikrotiterplatte mit 3 Tage al ten, konfluenten Verozellen (Affennierenzellen) aufgebracht. Nach Inkubation der Platten für 5 Tage im Brutschrank bei 37°C erfolgte die visuelle Ablesung der Zellkulturen nach HSV-1-spezifischen zytopathogenen Veränderungen (CPE).

Zur Bestimmung der "virostatischen" Aktivität (Inhibiti onstest) wurden der erfindungsgemäße Extrakt oder Hypericin in verschiedenen Konzentrationen zu einem geschlossenen Verband von Verozellen in Mikrotiterplatten zugegeben. Nach einer ein stündigen Inkubation wurden dann HSV-1 in einer Konzentration von 3000 TCID₅₀/ml zugegeben. Die Platten wurden, anschließend bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank inkubiert. Die Auswertung erfolgte nach 48-72 h unter Verwendung von monoklonalen Anti körpern und einer spezifischen Färbemethode.

Zur Beurteilung der zytotoxischen Wirkung wurden Verozellen für 7 Tage mit verschiedenen Konzentrationen von erfindungsge mäßem Extrakt und Hypericin im Brutschrank inkubiert. Die Be stimmung der Zytotoxizität erfolgte dann mit Hilfe des MTT- Tests nach einem publizierten Verfahren (Cinatl J. jr., Cinatl, J., Rabenau, H., Gümbel H.; Doerr, H. W. (1993); "In vi tro anti-human immunodeficiency virus activity of 2',3-dideoxynucleotides and their effect on clonal growth of hemopoietic cells from human bone marrow", Arzneimittel-Frsch./Drug Res. 43, 622-625).

Die Auswertung der zytotoxischen Konzentration (TC₅₀) und der virusinhibitorischen Konzentration (IC₅₀) erfolgten mittels linearer Regression. Zur Berechnung des therapeutischen Index wurde die Formel TC₅₀/IC₅₀ eingesetzt.

Ergebnisse der Untersuchungen im "Inaktivierungstest"

Die eingesetzte Virusmenge betrug 1,5 × 10⁷ TCID₅₀. Die "Virusin aktivierung" berechnet sich aus der Differenz der Ausgangsvi rusmenge und den oben angegebenen Virustitern, n.b. = nicht bestimmt aufgrund von Zytotoxizität oder der in Vorversuchen bestimmten "virusinaktivierenden" Wirkung.

Ergebnisse der Untersuchungen im "Inhibitionstest"

Wie aus den Untersuchungen ersichtlich ist, zeigte Hypericin wie erwartet eine deutliche "virusinaktivierende" Aktivität. Sie betrug bei 100 µg/ml ca. 4 log10-Stufen. Überraschend be wirkte der erfindungsgemäße Extrakt aber eine wesentlich stär kere Wirkung, indem er selbst bei einer Konzentration von 10 µg/ml noch einen ähnlichen starken inhibierenden Effekt aus übt, wie das als wesentlicher antivirale Inhaltsstoff von Jo hanniskrautextrakten beschriebene Hypericin, das im erfin dungsgemäßen Extrakt nur in einem Anteil von etwa 0,5% ent halten ist. Die potente antivirale Wirksamkeit des erfindungs gemäßen Extraktes wurde im "Inhibitionstest" bestätigt.

Beispiel 4 Antibakterielle Wirkung

Die antimikrobiellen Wirkungen gegenüber verschiedenen gram-positiven Bakterien wurde mit Hilfe der Mikrodilutionsmethode bestimmt. In der Tabelle angegeben sind jeweils die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzent ration (MBK)

Der erfindungsgemäße Extrakt zeigte an den getesteten gram-positiven Bakterien wesentlich stärkere antibakterielle Effek te, als aufgrund des Gehaltes an Hyperforin, das als wesentli cher Inhaltsstoff mit antibakteriellen Wirkungen angesehen wird, zu erwarten wäre.

Beispiel 5 Antiphlogistische Wirkung

Die antiphlogistischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Hypericumextraktes und von isolierten Inhaltsstoffen wurden im Crotonöl-Ohrödemmodell an männlichen NMRI-Mäusen geprüft. Nach Einleitung einer Narkose durch intraperitoneale Injektion von 60 mg/kg Natrium-Pentobarbital wurden die Testsubstanzen in 10 µl Aceton auf das rechte Ohr aufgetragen, während das linke Ohr zur Kontrolle nur mit 10 µl Acteon behandelt wurde. 30 min später wurde durch Auftragen von 50 µg Crotonöl in 10 µl Ace ton auf das linke Ohr eine lokale Entzündung ausgelöst. Nach 6 h wurden die Tiere euthanasiert und die Hemmung der Entzün dungsreaktion wurde durch Wiegen eines ausgestanzten Gewebe stücks aus beiden Ohren nach folgender Formel quantifiziert: [1- (G_T/G_L)] × 100, dabei handelt es sich bei G_T bzw. G_L um die Gewichtsdifferenz zwischen dem rechten und linken Ohr von Tieren die mit Testsubstanz (G_T) bzw. nur dem Lösungsmittel (G_L) behandelt wurden.

Die Hemmung der Akkumulation neutrophiler Granulozyten im ent zündeten Gewebe wurde durch die Bestimmung von Myeloperoxidase (MPO) in den Ohrhomogenaten ermittelt. Dazu wurden die Biop sieproben in 1 ml Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB)-Puffer aufgenommen, mit einem Glashomogenisator bei 4°C homo genisiert und anschließend für 10 sec in einem Sonicator be schallt. Nach einer Zentrifugation bei 4°C mit 3000 g für 10 min wurde der Überstand abgenommen und bis zur Analyse bei -70°C aufbewahrt. Die MPO-Bestimmung erfolgte in Mikroti terplatten nach Zugabe von H₂O₂ und dem Indikator O-Dianisidin- Dihydrocholorid als kinetische Messung über einen Zeitraum von 5 min bei 450 nm. Die Auswertung erfolgte gegenüber einer Standardkurve mit Meerrettich-Peroxidase und wurde ermittelt als mU Enzymaktivität pro mg Gewebe.

Die Ergebnisse der Untersuchungen nach Applikation von jeweils 250 µg Testsubstanz bzw. 1000 µg des erfindungsgemäßen Extrak tes auf das linke Ohr sind in der nachfolgenden Tabelle zusam mengestellt.

Der erfindungsgemäße Extrakt wurde bei der vorstehend be schriebenen Untersuchung in einer Menge von 1000 µg einge setzt. Wie sich aus Beispiel 1 ergibt, enthält der verwendete erfindungsgemäße Extrakt nach Beispiel 1 (Fraktion 1) 6,3% Hyperforin als Wirkstoff mit dem mengenmäßig größten Anteil im Extrakt. 1000 µg Extrakt entsprechen somit 63 µg Hyperforin. Die Vergleichstestsubstanzen wiederum wurden in einer Menge von 250 µg verabreicht. Dies bedeutet, dass diese Testsubstan zen in etwa der vierfachen Menge in Bezug auf Hyperforin im Extrakt verabreicht wurden. Trotz dieser Tatsache zeigt der erfindungsgemäße Extrakt im Vergleich zu Hyperforin als Test substanz eine deutlich bessere Hemmung. Hierin zeigt sich wie derum der synergistische Effekt zwischen Hyperforin und ande ren wirksamkeitsrelevanten Inhaltsstoffen im erfindungsgemäßen Extrakt. Damit wird deutlich, dass für die positiven pharmako logischen Eigenschaften die Summe der Einzelverbindungen wich tig ist, wobei ganz offensichtlich bestimmten Flavonoiden (z. B. Amentoflavon, Biapigenin, Kämpferol, Luteolin, Querce tin) eine besondere Bedeutung zukommt.

Beispiel 6 Proliferation von humanen Keratinozyten (HaCaT-Zellen)

Der Einfluss des erfindungsgemäßen Extraktes und verschiedener Inhaltsstoffe auf die Proliferation von humanen Keratinozyten wurde unter Verwendung der Zellinie HaCaT ermittelt. Die Zel len (10.000-15.000) wurden in 200 µl DMEM mit 5% fötalem Kälberserum in 96-Well F-Form Mikrotiterplatten ausgesät und für 24 h in Anwesenheit der Testsubstanzen bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert. Die Zellproliferation wurde durch Mes sung des Einbaus von ³H-Methyl-Thymidin (0,5 µCi/Well) während der letzten 6 h in Kultur bestimmt.

Wie aus den dargestellten Ergebnissen deutlich wird, beruhen die antiproliferativen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Extrakts ganz offensichtlich auf der Kombinationswirkung von Hypericin und Hyperforin sowie bestimmter Flavonverbindungen, z. B. Isoquercitrin und Luteolin.

Beispiel 7 Hemmung der 5α-Reduktase

Untersuchungen zur Hemmung der 5α-Reduktase wurden an Zellen der humanen Prostatakarzinom-Zellinie DU 145 durchgeführt. Die Zellen (250.000) wurden in 5 ml RPMI 1640-Medium mit 10% fö talem Kälberserum (FKS) in 6-Well Zellkulturplatten ausgesät und bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert. Nach 4 Tage wür de das Medium gegen RPMI 1640 mit Zusatz von 10% Charcoal stripped FKS ausgetauscht. Am folgenden Tag wurden die Test substanzen und ¹⁴C-Testosteron zugegeben und weitere 18 h spä ter die Zellüberstände abgenommen. Die Zellüberstände wurden mit 2,5 ml Ethylazetat gemischt und dann 10 min mit 500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die organische Phase wurde abge nommen und in ein Glasröhrchen überführt. Die Extraktion wurde anschließend durch erneute Zugabe von 2,5 ml Ethylazetat wie derholt. Die vereinigten organischen Phasen wurden bei 37°C unter N₂-Begasung zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 50 µl Ethylazetat aufgenommen und dann auf einer Kieselgel 60 TLC-Platte zweimal mit Ethylazetat/Cyclohexan (1 : 1) als Lauf mittel aufgetrennt. Die gebildeten Testosteron-Metaboliten wurden mit Hilfe eines Linear-Analysers lokalisiert und die Hemmung der 5α-Reduktase anhand des Dihydrotestosteron-Peaks im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle ermittelt.

Der erfindungsgemäße Extrakt zeigt eine ausgeprägte Hemmwir kung auf die 5α-Reduktase. Die verwendete Konzentration an Testsubstanzen von 30 µg/ml entspricht der Konzentration an Hyperforin, dem mengenmäßig wichtigsten Inhaltsstoff im erfin dungsgemäßen Extrakt gemäß Beispiel 1, Fraktion 1.

Im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Extrakt (500 µg/ml) erwies sich Hyperforin bei der seinem Anteil am Gesamtextrakt ent sprechenden Konzentration von etwa 30 µg/ml als zytotoxisch und wurde deshalb nur bei einer Konzentration von 5 µg/ml ge prüft. Aus den Ergebnissen ist zu erkennen, dass selbst bei den geprüften hohen Konzentrationen der Einzelstoffe, die deutlich über ihren jeweiligen Anteil am erfindungsgemäßen Extrakt hinausgehen, keine dieser Verbindungen eine Wirkung entfaltete, die der des Gesamtextraktes überlegen war. Die Gesamtwirkung des erfindungsgemäßen Extraktes ist deshalb nur mit der Kombinationswirkung der enthaltenen Inhaltsstoffe er klärbar.

Beispiel 8 (Stabilität der Wirkstoffe, insbesondere Hyperforin in den erfindungsgemäßen Zubereitungen)

Auch das bekanntermaßen chemisch instabile Hyperforin ist in einem erfindungsgemäßen Gel gemäß Beispiel 2a vollständig ent halten, wie durch quantitative Bestimmung des enthaltenen Hy perforins gezeigt werden kann, d. h. bei der Herstellung des Gels gibt es keine Zersetzung.

Claims

1. Extrakt aus Hypericum perforatum L. mit abgereichertem Chlorophyllgehalt und mit abgereichertem Gehalt an Pro anthocyanidinen.

2. Extrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für Chlorophylle typischen Absorptionsbanden im VIS-Spektrum dieses Extraktes zwischen 600 und 700 nm stark vermindert sind oder fehlen, und dadurch gekennzeichnet, dass HPLC-analytisch keine Signale oder nur sehr stark ver minderte Signale sichtbar sind, die auf Proanthocyanidine und Chlorophylle hinweisen.

3. Extrakt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Hyperforingehalt von mindestens 2%, einen Ge samthypericingehalt von mindestens 0,2%, und einen Ge samtflavongehalt von mindestens 2% aufweist.

4. Extrakt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Hyperforingehalt von mindestens 4%, einen Ge samthypericingehalt von mindestens 0,4%, und einen Ge samtflavongehalt von mindestens 4% aufweist.

5. Extrakt nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeich net, dass er einen Hyperforingehalt von 4-8%, einen Ge samthypericingehalt von 0,4-1,0%, und einen Gesamtflavonge halt von 4-8% aufweist.

6. Extrakt nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeich net, dass der Extrakt des Weiteren einen Stabilisator in einer zur Stabilisierung des Hyperforingehalts ausreichen den Menge enthält.

7. Extrakt nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ascorbinsäureester, organischen Thiolverbindungen, wie Cystein und Glutathion und Komplexierungsmitteln, wie cyc lischen Oligosacchariden, Cyclodextrinen, Kieselsäuren, Zitronensäure, Zuckeralkoholen, Zellulosederivaten, Polyvi nylpyrrolidonen oder Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolyme ren oder Gemischen davon.

8. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass getrocknete Jo hanniskrautdroge mit einem Lösungsmittelgemisch aus Aceton und Ethanol extrahiert wird und anschließend grüne Pigmente durch Filtration über ein geeignetes Adsorptionsmittel ab getrennt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittelgemisch 95 Gew.-% Aceton und 92 Gew.-% Ethanol umfasst.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittelgemisch 95 Gew.-% Aceton und 92 Gew.-% Ethanol in einem Verhältnis von 8 : 2 umfasst.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch ge kennzeichnet, dass als Adsorptionsmittel ein Adsorberharz verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, dass dem Extrakt ein Stabilisator zugesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivaten, wie Ascorbinsäu reester, organischen Thiolverbindungen, wie Cystein und Glutathion und Komplexierungsmitteln, wie cyclischen Oligo sacchariden, Cyclodextrinen, Kieselsäuren, Zitronensäure, Zuckeralkoholen, Zellulosederivaten, Polyvinylpyrrolidonen oder Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymeren oder Gemischen davon.

14. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen Extrakt nach einem der Ansprüche 1-7 und pharmazeutisch übliche Hilfs stoffe zur topischen Applikation.

15. Gel, enthaltend einen Extrakt nach einem der Ansprüche 1-7 sowie eine Gelgrundlage.

16. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zuberei tung nach Anspruch 14 bzw. eines Gels nach Anspruch 15, da durch gekennzeichnet, dass der Extrakt und die pharmazeu tisch üblichen Hilfsstoffe und/oder die Gelgrundlage zusam men mit einem Stabilisator für Hyperforin vermischt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivaten, wie Ascorbinsäu reester, organischen Thiolverbindungen, wie Cystein und Glutathion und Komplexierungsmitteln, wie cyclischen Oligo sacchariden, Cyclodextrinen, Kieselsäuren, Zitronensäure, Zuckeralkoholen, Zellulosederivaten, Polyvinylpyrrolidonen oder Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymeren oder Gemischen davon.

18. Verwendung eines Extraktes nach einem der Ansprüche 1-7 oder einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 14 oder eines Gels nach Anspruch 15 zur topischen Behandlung von Schleimhautirritationen, wie Stomatitis, von Akne, von viralen Infektionen, wie Lippenherpes, Gürtelrose, Warzen, Windpocken sowie Psoriasis.