DE10131426A1 - Verfahren zur Pasteurisierung von Dotterverdünnungen und gereinigtem IgY - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren/Methode zur Pasteurisierung von IgY durch Hitzebehandlung, dadurch gekennzeichnet, dass IgY auf Temperaturen bis einschließlich 65 DEG C erhitzt wird, die Pasteurisierungszeit 10-24 h und keine stabilisierenden Additive verwendet werden.

Description

Einleitung

Immunglobuline aus Eidottern stellen eine alternative Quelle für die Gewinnung von diagnostisch und pharmazeutisch wertvollen Immunglobulinen dar. Eine wesentliche Erweiterung der Nutzung von Immunglobulinen aus Dottern, z. B. im pharmazeutischen Bereich, ergibt sich durch die Einführung von Verfahren, die die biologische Sicherheit des Immunglobulins oder des immunglobulinhaltigen Produkts erhöhen. Essentiell ist der Einsatz solcher Verfahren z. B. zur Virusinaktivierung oder Virusabreicherung bei Blutprodukten (Williamson and Allain, 1995). Ein wichtiges Verfahren hierzu ist die Pasteurisierung von Immunglobulinen oder immunglobulinhaltiger Produkte (Nowak et al., 1993).

Die hier vorgestellte Erfindung beschreibt die thermische Behandlung (Pasteurisierung) von Immunglobulinen aus Dottern (IgY) unter Erhalt ihrer Funktionalität/Aktivität. Diese Art der Pasteurisierung kann dann als ein Prozessschritt bei der Herstellung von IgY-enthaltenden Produkten eingesetzt werden kann.

Stand der Technik Für Pasteurisierung von IgY

Aviäre Antikörper (IgY) unterscheiden sich in wesentlichen physiko-chemischen und strukturellen Eigenschaften von den entsprechenden Säugetier-IgGs. IgY enthält u. a. nicht die bei Säugetier-IgGs übliche flexible "Hinge"-Region und deren Disulfidbrückenmuster und hat gegenüber IgGs einen verlängerten Fc-Teil (Warr et al., 1995). Der höhere Kohlenhydrat- Anteil von IgY und die Existenz von einheitlichen Oligosaccharidketten, die mit dem Fc-Teil von IgY verknüpft sind, können zusätzlich die molekularen Eigenschaften des Proteins beeinflussen (Ohta et al., 1991). Eine einfache Gleichsetzung der Eigenschaften mit denen von Säugetier-IgGs, bei denen Pasteurisierungsverfahren bei der Herstellung pharmazeutischer Produkte angewandt werden (z. B. Pasteurisierung von Blutplasma zur Virusinaktivierung, Novak et al., 1993), ist daher nicht zu erwarten.

Mehrere Vergleichsstudien von IgY und Säugetier-IgG (Kaninchen) bestätigen dies. IgG ist stabiler gegenüber Säurebehandlung, Guanidin-HCl-Denaturierung und Hitzebehandlung als IgY (Otani et al., 1991; Shimizu et al., 1992; Hatta et al., 1993). In einer weiteren Studie wurden IgY (Huhn) und IgG von verschiedenen Säugetieren (Rind, Ziege, Schwein und Kaninchen) auf ihre Stabilität gegenüber Säure- und Guanidin-HCl-Denaturierung sowie gegenüber Hitze und Proteinaseeinwirkung untersucht (Shimizu, 1993). Es wurden eindeutige Stabilitätsunterschiede innerhalb der Gruppe der Säugetier-IgGs gefunden, aber insbesondere Unterschiede gegenüber IgY festgestellt. So wurde eine höhere Empfindlichkeit von IgY gegenüber Säure, Guanidin-HCl und Proteinaseeinwirkung festgestellt. Bei einer kurzzeitigen Hitzebehandlung (15 bzw. 30 min bei Temperaturen von 62,5°C bis 90°C) ist Kaninchen-IgG deutlich stabiler als alle anderen IgGs und IgY. Gleichwohl zeigt IgY von allen Immunglobulinen die größte Hitzeempfindlichkeit. Chang et al. (1999) haben die Hitzestabilität von IgY in Dotter und in angereichertem IgY verglichen. Die Inaktivierungsrate für IgY im Dotter und in Dotterextrakten war in beiden Fällen gleich hoch. Durch den Zusatz von Additiven wie Saccharose, Maltose, Glycerin oder 2% Glycin konnte hier eine Schutzwirkung gegen Hitzedenaturierung erreicht werden.

Überraschenderweise zeigten unsere Untersuchungen zur Hitzestabilität von IgY, dass die Antikörperaktivität des Proteins bei relativ kurzer Hitzebehandlungszeit (3 h bei 62°C), aber auch nach längerer Hitzeeinwirkung (z. B. 10-18 h bei 62°C) aufrecht erhalten bleibt. Dieser Funktionserhalt ist unabhängig von der eingesetzten Reinigungsstufe des Proteinas und des benutzen Puffersystems und kann sowohl mit als auch ohne den Einsatz von üblichen proteinstabilisierenden Additiven erreicht werden.

Ausführungsbeispiele

Beispiel für die Pasteurisierung von IgY anti human IgG, gewonnen aus Eiottern von Hühnern, die vorab mit humanem IgG immunisiert worden waren, ausgeführt mit einem wässrigen IgY-Extrakt und an einer reinen IgY-Lösung, die vorab durch Affinitätschromatographie gereinigt wurde.

Arbeitsschritt 1

Nach der Abtrennung von Eiweiß vom Dotter wird die Dottermasse mit deionisiertem Wasser (10-30°C) unter dem Einsatz von bakteriostatischen Mitteln (0,01% Na-Azid) unter Rühren zu einer 7,6%igen (w/v) Emulsion verdünnt.

Arbeitsschritt 2

Die Emulsion wird anschließend bei RT (10-30°C) für 12-24 h ruhen gelassen. In dieser Zeit fallen die Lipide und Lipoproteine aus, das IgY verbleibt im wässrigen Überstand. Danach wird der IgY-Überstand nach Passage eines 28 µm-Siebs in ein neues Gefäß überführt.

Arbeitsschritt 3

Der so erzeugte IgY-Überstand wird durch Zusatz einer konzentrierten PBS-Stammlösung auf PBS eingestellt und danach direkt für affinitätschromatographische Reinigungsmethode eingesetzt. Diese weitere Aufarbeitung durch Affinitätschromatographie erfolgt über eine spezifische Aufreinigung von IgY anti human IgG mit Hilfe einer Human-IgG-Affinitätsmatrix.

Arbeitsschritt 4

Sowohl IgY-Extrakt (wässriger Überstand einer 7,6%-igen (w/v) Dotteremulsion, eingestellt auf 1 × PBS), als auch das affinitätsgereinigte IgY anti human IgG wird durch Hitzeeinwirkung pasteurisiert.

Für IgY-Extrakt:
Pasteurisierungszeiten: 0-18 h
Pasteurisierungtemperatur: 62°C
Puffersyteme für die Pasteurisierung:
Puffer 1: PBS

Für affinitätsgereinigtes IgY anti human IgG:
Pasteurisierungszeiten: 0-18 h
Pasteurisierungtemperatur: 62°C

Puffersyteme für die Pasteurisierung:
Puffer 1: PBS
Puffer 2: PBS + 10% (v/v) Glycerin
Puffer 3: PBS + 0,36 M NaCl
Puffer 4: PBS + 30% (w/v) Saccharose
Puffer 5: 30 mM Na-Citrat, 50 mM NaPi, 10% (v/v) Glycerin pH 7,2 (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM NaPi, 1,8 mM KPi, pH 7,2)

Nach der entsprechenden Pasteurisierungszeit wird die IgY-Lösung sofort auf 2-8°C abgekühlt.

Arbeitsschritt 5

Die IgY-Antikörperaktivität (Antigenbindungsfähigkeit) von IgY anti human IgG wird mittels ELISA vor und nach Pasteurisierung bestimmt und mit der Aktivität einer Kontroll-Lösung verglichen, die bei RT inkubiert wird.

Ergebnisse Literatur

Chang HM, Ou-Yang RF, Chen YT, Chen CC. Productivity and soms properties of immunoglobulin specific against Streptococcus mutans serotype c in chicken egg-yolk (IgY). J Agric Food Chem 1999; 47: 61-66
Hatta H, Tsuda K, Akachi S, Kim M, Yamamoto T. Productivity and some properties of egg-yolk antibody (IgY) against human rotavirus compared with rabbit IgG. Biosci Biotechnol Biochem 1993 Mar; 57(3): 450-4
Nowak T, Niedrig M, Bernhardt D, Hilfenhaus J. Inactivation of HIV, HBV, HCV related viruses and other viruses in human plasma derivatives by pasteurisation. Dev Biol Stand 1993; 81: 169-76.
Ohta M, Hamako J, Yamamoto S, Hatta H, Kim M, Yamamoto T, Oka S, Mizuochi T, Matsuura F. Structures of asparagine-linked oligosaccharides from hen egg-yolk antibody (IgY). Occurrence of unusual glucosylated oligo-mannose type oligosaccharides in a mature glycoprotein. Glycoconj J 1991 Oct; 8(5): 400-13
Otani H, Matsumoto K, Saeki A, Hosono, A. Comparative studies on properties of hen egg-yolk IgY and rabbit serum IgG antibodies. Lebensm. Wiss. Technol. 1991; 24: 152-8
Shimizu M, Nagashima H, Sano K, Hashimoto K, Ozeki M, Tsuda K, Hatta H. Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G. Biosci Biotechnol Biochem 1992 Feb; 56(2): 270-4
Shimizu M, Nagashima H, Hashimoto K. Comparative studies in molecular stability of immunoglobulin G from different species. Comp Biochem Physiol B 1993 Oct; 106(2): 255-61
Warr GW, Magor KE, Higgins DA. IgY: clues to the origins of modern antibodies. Immunol Today 1995 Aug; 16(8): 392-8
Williamson LM, Allain JP. Virally inactivated fresh frozen plasma. Vox Sang. 1995; 69(3): 159-65.

Claims (3)

1. Ein Verfahren/Methode zur Pasteurisierung von IgY durch Hitzebehandlung, dadurch gekennzeichnet, dass IgY auf Temperaturen bis einschließlich 65°C erhitzt wird, die Pasteurisierungszeit 10-24 h beträgt und keine stabilisierenden Additive verwendet werden.

2. Ein Verfahren/Methode, wie unter 1. beschrieben, in dem IgY als gereinigtes IgY (IgY-Lösung) vorliegt oder in dem IgY in Dotter oder in einer Dotterverdünnung vorhanden ist.

3. Ein Verfahren/Methode, wie unter 1. und 2. beschrieben, in dem übliche stabilisierende Additive (wie Glycerin, NaCl, Saccharose) eingesetzt werden.