DE10127406A1

DE10127406A1 - Verfahren zur elektrophoretischen Trennung von Proben

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Publication number: DE10127406A1
Application number: DE10127406A
Authority: DE
Inventors: Kaat Kai Hendrik Te
Original assignee: Xzillion GmbH and Co KG
Current assignee: Xzillion GmbH and Co KG
Priority date: 2001-06-06
Filing date: 2001-06-06
Publication date: 2002-12-12
Also published as: EP1399734A2; AU2002312963A1; US20040154921A1; WO2002099404A2; WO2002099404A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrophoretischen Trennung von Peptiden und Proteinen, insbesondere durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer Mischung aus einer polaren Flüssigkeit und mindestens einer amphiphilen Substanz, die eine flüssigkristalline Phase bildet, als Separationsmatrix.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrophoretischen Trennung von Proben, insbesondere durch Isoelektrische Fokussierung, mittels einer geeigneten Seperationsmatrix. Besonders geeignet ist die Erfindung zur Auftrennung von lipophilen Peptid- und Proteinbestandteilen einer Probe.

Die Elektrophorese ist in den Biowissenschaften eine seit langem bekannte Standardtechnologie zur Auftrennung von geladenen Molekülen. Geladene Moleküle wandern dabei in einem elektrischen Feld in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenladung, ihrem Molekulargewicht, ihren räumlichen Abmessungen und in Abhängigkeit von der Viskosität des Trennmediums. Die Trennung erfolgt aufgrund unterschiedlicher Migrationsgeschwindigkeiten einzelner geladener Moleküle, die durch die eben genannten Abhängigkeiten hervorgerufen werden. Typischerweise wird die Elektrophorese von Biomolekülen in wässrigen Lösungen durchgeführt. Um eine Durchmischung der Probe aufgrund von Konvektion zu verhindern wird die Elektrophorese in der Regel in hochporösen Matrices, wie z. B. in Polyacrylamid- oder Agarosegelen durchgeführt. Hier erfolgt die Trennung der Probenbestandteilen in erster Näherung über die durchschnittliche Porengröße des Gels und des Molekulargewichts des Probenbestandteils. Dieses Prinzip wird z. B. bei der SDS- PAGE-Elektrophorese zur Trennung von Proteinen in einer Probe genutzt. Einen Überblick über die bereits existierenden Verfahren und die dazu verwendeten Trennmedien wird z. B. in Righetti, P. G. et al., J. Chromatogr. B 699 (1996) 63-75; Righetti, P. G. et al., J. Chromatogr. A 698 (1995) 3-17; Righetti, P. G. et al., Elektrophoresis 1995, 16, 1815-1829; Manabe, T., Electrophoresis, 21, 1116-1122 gegeben.

Ein alternatives Verfahren stellt die Auftrennung anhand eines pH-Gradienten dar (siehe z. B. Molloy, M. P. Analytical Biochemistry 280, 1-10 (2000); Righetti, P. G. et al., J. Chromatogr. B 699 (1997) 77-89), der zwischen den beiden Elektroden aufgebaut werden kann, um Moleküle aufgrund ihres isoelektrischen Punktes voneinander zu trennen. Amphotere Analyten tragen solange eine Netto- Oberflächenladung in einem pH-Gradienten bis der Analyt in eine Region des Gels gewandert ist in der der pH-Wert dem isoelektrischen Punkt des Analyten entspricht. Damit kommt die Wanderung des Analyten im elektrischen Feld am isoelektrischen Punkt zum erliegen, der Analyt wird in dieser Region fokussiert. Typischerweise werden für die isoelektrische Fokussierung antikonvektive Medien mit einer hohen durchschnittlichen Porengröße verwendet, die die Wanderung des Analyten möglichst wenig behindern. Zur isoelektrischen Trennung von Biomolekülen werden bevorzugt ebenfalls Agarosegele oder Polyacrylamidgele unter Niedrigsalzbedingungen eingesetzt.

Die Proteinbestandteile einer elektrophoretisch zu trennenden Probe lassen sich in gut trennbare wasserlösliche Proteine und in fettlösliche Proteine einteilen. So besitzen insbesondere die Zellmembranen durchspannenden Proteine ausgedehnte hydrophobe Bereiche innerhalb der Transmembrandomänen und hydrophile intrazelluläre und extrazelluläre Kopfdomänen. Solche Membranproteine sind in wässrigen Phasen nur sehr schlecht löslich und entziehen sich somit einer elektrophoretischen Trennung mit herkömmlichen Mitteln. Um Membranproteine in geeigneter Weise für die Elektrophorese zu solubilisieren werden in der Regel Detergenzien verwendet (Rabilloud, T., Electrophoresis 1996, 17, 813-829; Herbert, B. Electrophoresis 1999, 20, 660-663, Molloy, M. P. Analytical Biochemistry 280, 1- 10 (2000)). Insbesondere für die isoelektrische Fokussierung müssen entweder ungeladene oder zwitterionische Detergenzien benutzt werden, die nur eine beschränkte Kapazität zur Lösung von lipophilen Proteinen besitzen. Somit stehen zwar für die elektrophoretische Trennung wasserlöslicher Proteine sehr effiziente Verfahren zur Verfügung, während die Trennung von Proteinmischungen, die lipophile Proteine enthalten nach wie vor mit Problemen behaftet ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein Verfahren bereitzustellen, dass die Trennung von chemischen und biologischen Proben, insbesondere unter Einbeziehung der hydrophoben Probenbestandteile, ermöglicht.

Die Aufgabe konnte überraschender Weise durch die Verwendung eines Trennmediums, umfassend eine Mischung aus einer polaren Flüssigkeit und einer flüssig kristallinen Phase aus mindestens einer amphiphilen Substanz, gelöst werden, wobei die flüssig kristalline Phase als Seperationsmatrix dient.

Die amphiphilen Substanzen bilden dabei in polaren Flüssigkeiten ein dreidimensionales doppelmembranähnliches flüssig-kristallines Netzwerk, das mit Kanälen der flüssigen Phase durchzogen ist.

Die elektrophoretische Trennung erfolgt nach Auftragung der gelösten Probe auf dieses Trennmedium unter anlegen eines elektrischen Feldes. Im Falle einer isoelektrischen Fokussierung kann die Probe auch mit dem Trennmedium oder mit den amphiphilen Substanzen gemischt vorliegen.

Durch die amphiphile flüssig kristalline Seperationsmatrix können lipophile Stoffe, wie z. B. lipophile Peptide, Proteine oder Glycoproteine überraschend unter anlegen eines elektrischen Feldes direkt wandern, ohne in die polare Flüssigkeit zu diffundieren. Die flüssig kristallinen Phasen aus amphiphilen Substanzen sind zusätzlich in der Lage hydrophobe Peptide und Proteine ohne die Verwendung von Detergenzien zu solubilisieren und somit in einen elektrophoretisch auftrennbaren Zustand zu bringen. Darüber hinaus bilden solche Phasen in polaren Flüssigkeiten eine poröse Seperationsmatrix, die eine Trennung von in polaren Lösemitteln löslicher Stoffe zusätzlich gewährleistet, so dass auch eine Mischung aus hydrophoben und hydrophilen Peptiden und Proteinen effizient getrennt werden kann. Die Trennung mit den erfindungsgemäßen Verfahren ist folglich insbesondere für Mischungen geeignet, die neben Peptiden und Proteinen auch Glycolipide, ionische Lipide, Kohlenhydrate, Zucker, Aminosäuren, Nukleinsäuren oder Sekundärmetaboliten enthalten. Weiterhin verhindert die Seperationsmatrix Konvektionsströme und die damit verbundene ungewünschte Durchmischung des Trennmediums. Überraschenderweise zeigte sich die Seperationsmatrix unter den Elektrophoresebedingungen stabil.

Zur Erzeugung der Seperationsmatrix können alle ungeladenen amphiphilen Substanzen mit einer hydrophoben Moleküleinheit (Schwanz) und einer hydrophilen Moleküleinheit (Kopf) verwendet werden, die in der Lage sind in polaren Flüssigkeiten eine flüssigkristalline Phase auszubilden. Dazu gehören vor allem Alkohol-Fettsäureester, insbesondere aus kurzkettigen C₂-C₄-Alkoholen mit bis zu 4 Hydroxygruppen und C₈-C₃₀-Fettsäuren, wobei ein Teil der Hydroxygruppen in freier Form vorliegen kann, oder mit anderen chemischen Gruppen, wie z. B. Phosphorsäurederivaten, Aminoalkoholen oder Sacchariden unter Bildung von Phosphatiden, Glykolipiden oder Aminolipiden vorliegen kann.

Bevorzugt enthalten die verwendeten amphiphilen Ester als Acylgruppen ein- bis fünffach ungesättigte C₁₂-C₂₄-Fettsäuren oder gesättigte C₈-C₂₀-Fettsäuren, besonders bevorzugt enthalten die Ester einfach ungesättigte cis-C₁₄-C₂₂- Acylgruppen, wie z. B. 1-monooleoyl-rac-glycerol, 1-monomyristoyl-rac-glycerol oder 1-monopalmitoyl-rac-glycerol.

Besonders geeignete amphiphile Substanz sind Mono- oder Diacylglyceride, Acylglycerinphosphatide, Glycoacylglyceride, Aminoacylglyceride oder aus einer Mischung enthaltend solche Substanzen ausgewählt ist.

Die Herstellung und die Eigenschaften flüssig-kristalliner Phasen ausgehend von den beschriebenen amphiphilen Substanzen wird z. B. in WO 84/02076, WO 98/10281 beschrieben. Eine ausführliche Beschreibung flüssig-kristalliner kubischer Phasen findet sich darüber hinaus auch in Landau, E. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 93, pp. 14532-14535 Dez. (1996); Nollert, P. et al., FEBS Letters 457 (1999) 205-208; Caffrey M., Current Op. Structural Biol. 10, 486-497 (2000); Hong, Q. et al., Biomaterials 21, 223-234 (2000), die diese Phasen allerdings ausschließlich zur Proteinkristallaisation einsetzen.

Für den Zweck der elektrophoretischen Trennung von chemischen und biologischen Proben können unterschiedliche flüssig kristalline Phasen verwendet werden. Bevorzugt sind allerdings kubische Phasen, die ein einziges zusammenhängendes Netzwerk, durchzogen von miteinander verbundenen Kanälen, mit der polaren Flüssigkeit bilden. In solchen Phasen können z. B. die hydrophoben Peptide und Proteine in der doppelmembranähnlichen Seperationsmatrix wandern ohne die flüssigen Kanäle passieren zu müssen. Aber auch flüssig kristalline Phasen mit einer lamellaren, hexagonale oder invertiert hexagonalen Struktur sind für die elektrophoretische Trennung bevorzugt geeignet. Vorteilhaft ist es hierbei, wenn die membranartigen Lamellen in Längsrichtung zum elektrischen Feld ausgerichtet sind, um eine möglichst störungsfreie Wanderung innerhalb der Seperationsmatrix zu gewährleisten.

Kubische Phasen sind darüber hinaus aus den folgenden Gründen besonders geeignet für die elektrophoretische Trennung von Peptiden und Proteinen:

- Die Dicke der membranartigen kubischen Phase ist nahezu homogen, andere Phasen, wie lamellare bzw. hexagonale oder invertiert hexagonale Phasen haben unterschiedlich dicke hydrophobe Membranbereiche.
- Die flüssigkristalline kubische Phase ist eine isotrope Phase. Physikalische und chemische Eigenschaften dieser Phase sind in allen drei Dimensionen identisch, so dass eine Ausrichtung der Phase relativ zum angelegten elektrischen Feld nicht notwendig ist. Bei anisotropen Phasen ist es vorteilhaft die Membranebenen parallel zum Elektrischen Feld auszurichten, um eine Mobilität der Proteine in der Membranebene zu ermöglichen.
- Die flüssigkristalline kubische Phase ist in Gegenwart eines Überschusses an Wasser stabil. Bei der Elektrophorese können verschiedene Puffer eingesetzt werden, um die Stromleitung zwischen den Elektroden und den Enden der Matrix zu ermöglichen. Es ist daher nicht wünschenswert, dass die Matrix in einem Überschuss an Puffer langsam zerfällt.

Gemäß dem Phasendiagramm Mono-Olein-Wasser werden kubische Phasen über einen weiten Bereich von ca. 10 bis max 50% Wassergehalt bei Temperaturen von 5 bis ca. 95 Grad Celsius bei Atmosphärendruck gebildet. Bevorzugt ist eine Zusammensetzung wässrige Phase: MO von 25 : 75 bis 40 : 60 (v/v) bei einer Temperatur von 20 bis 40 Grad Celsius benutzt.

Verschiedene Hilfsstoff können mit einer Konzentration von 0,1% bis 15% (w/w), bevorzugt zwischen 1% bis 5% (w/w), zu den flüssigkristallinen Phasen beigemischt werden. Hier sind vor allem Lipide und Detergenzien zu berücksichtigen, da Zumischungen dieser Substanzen evtl. bei der Solubilisierung von schwierigen Membranproteinen wichtig sein können. Auch gibt es eine Reihe von Membranproteinen, die ein bestimmtes Lipid spezifisch gebunden haben, z. B. als biologischer Kofaktor.

Der amphiphilen Phase können z. B. synthetischen oder natürlich vorkommenden Lipide, wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, geladene oder ungeladene Phospholipide, Sphingolipide oder Glycolipide, fettlösliche biologische Kofaktoren, Chlorophyllen, Retinol, Steroide, Carotinoide, Chinone oder C₈-C₃₀-Fettsäuren, -Alkane, -Alkene, -Alkine oder Alkohole zugesetzt werden. Lipide oder Detergenzien mit ionischen oder zwitterionischen Kopfgruppen stellen bevorzugt zugesetzte Hilfsstoffe dar.

Als Hilfsstoffe können der polaren Flüssigkeit weitere kleine polare amphiphile Substanzen, polare Glycole, Zuckermonomere oder -multimere, Aminosäuren oder zwitterionische Substanzen zugesetzt werden. Je nach elektrophoretischer Methode kommen z. B. als Hilfsstoffe Glycerol, Ethylenglycol, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycin, Harnstoff oder Guanidin in Frage.

Der polaren Flüssigkeit können darüber hinaus Carrier-Ampholyte zugesetzt werden, mit deren Hilfe im Trennmedium ein pH-Gradient aufgebaut werden kann. Als Carrier-Ampholyt eignet sich z. B. Ampholine ® in einem Konzentrationsbereich von 0.1 bis 40 Vol-%, bevorzugt 2 bis 8 Vol-%. Die Elektrophorese in einem pH- Gradienten ermöglicht die Trennung von Proteinen anhand ihres isoelektrischen Punktes mittels isoelektrische Fokussierung.

In der Regel wird das Trennmedium gepuffert, bevorzugt werden Tris-Puffer verwendet. Bei der isoelektrischen Fokussierung wird als Anolyt eine Säure, bevorzugt verdünnte Phosphorsäure verwendet. Die elektrophoretischen Trennungen werden bevorzugt in einer Kapillare, bei einer Spannung von unter 8000 V, bevorzugt bei einer Spannung zwischen 100 V und 600 V, durchgeführt. Die Laufzeiten betragen in der Regel zwischen 0,5 h bis 10 h. Bevorzugt sind allerdings Spannungen und Laufzeiten die einen Vh-Wert von unter 4000 ergeben, um einer etwaige Veränderung des Trennmediums vorzubeugen.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der leichten Probenvorbereitung. So kann auf den Zusatz von Detergenzien zur Solubilisierung von lipophilen Peptiden und Proteinen verzichtet werden. Demgegenüber können z. B. eine abzentrifugierte Vesikelfraktion oder Membranfraktion direkt mit der, die flüssig kristalline Phase bildenden amphiphilen Substanzen, gemischt werden. Die in den Membranen enthaltenen Peptide und Proteine lösen sich problemlos in der amphiphilen Substanz, die Lösung kann direkt zur Trennung auf ein fertiges, eine amphiphile flüssig kristalline Phase enthaltendes, Trennmedium aufgetragen werden oder alternativ zur Herstellung des Trennmediums durch Mischung mit einer polaren Flüssigkeit verwendet werden. Letzteres eignet sich zur Vorbereitung des Trennmediums für die isoelektrische Fokussierung.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich ionische bzw. im elektrischen Feld ionisierbare Analyten trennen. Aber auch nicht ionische Substanzen können mit ionischen Gruppen modifiziert und damit einem elektrophoretischen Verfahren zugänglich gemacht werden. Die beschriebenen Verfahren sind insbesondere zur Trennung von ionische Lipide, hydrophobe Sekundärmetaboliten, Glycolipide, Glycoproteine, Peptide und Proteine enthaltenden Proben geeignet. Aber auch die gleichzeitige Trennung von Zuckern, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Aminosäuren etc. in der polaren flüssigen Phase des gleichen Trennmediums ist möglich. Aus diesem Grunde eignet sich das beschriebene Verfahren auch zur Untersuchung von Gesamtextrakten, wie sie in der Proteomanalyse untersucht werden. Dabei erscheint eine Kombination mit einer zweiten Trennmethode in einem 2D-Verfahren vorteilhaft, wobei eine Trennung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt als erster Trennungsschritt vorgenommen wird.

Analyten sowie Hilfstoffe werden der polaren Flüssigkeit bzw. der amphiphilen Substanz bevorzugt in einer Konzentration zugesetzt, die die Ausbildung einer kubisch flüssig kristallinen amphiphilen Phase nicht entgegenstehen.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung von flüssig kristallinen amphiphilen Phasen zur elektropheretischen Trennung gemäß dem beschriebenen Verfahren liegt in der Einstellbarkeit der Fluidität der Phase durch deren Zusammensetzung. So kann z. B. die vermehrte Verwendung von Glyciden oder Phosphatiden mit gesättigten Acylgruppen die Fluidität der flüssig-kristallinen Phase gesenkt werden. Ungesättigte Acylgruppen insbesondere in cis-Konfiguration erhöhen die Fluidität. Somit kann die Wanderungsgeschwindigkeit der zu trennenden Probenbestandteile, neben der Temperatur oder der angelegten Spannung, auch über die Zusammensetzung der kubisch-kristallinen Phase eingestellt werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Elektrophorese von polaren Molekülen in einem Trennmedium aus einer kubisch flüssigkristallinen Phase aus Seperationsmatrix und einer wässrigen Phase.

Fig. 2 zeigt die Trennung zweier Farbstoffe Bromphenolblau und Orange G mit einem Tris-Glycin-SDS-Puffersystem.

Fig. 3 zeigen die Etablierung eines pH-Gradienten im Trennmedium anhand von Bromphenolblau als Indikator, Fig. 3a zeigt einen einheitlichen pH-Wert im Trennmedium bei leicht basischem pH, Fig. 3b zeigt einen durch Carrier-Ampholyte aufgebauten pH-Gradienten von leicht basischem pH bis zu einem pH-Wert von deutlich unter 3,0.

Fig. 4 zeigt die Auftrennung einer heterogenen Mischung eines fluoreszenzmarkierten Proteins durch isoelektrische Fokussierung unter Variation der Trennbedingungen.

Fig. 5 zeigt die elektrophoretische Wanderung eines fluoreszenzmarkierten Phosphatidyl-Ethanolamins unter Variation der Elektrophoresebedingungen.

Fig. 6 zeigt die elektrophoretische Trennung eines Fluorescein-isothiocyanat (FITC)- markierten Peptids an einer LCP-Seperationsmatrix bei unterschiedlichen Laufzeiten.

Fig. 7 zeigt die elektrophoretische Mobilität eines FITC-markierten Peptids anhand der in Fig. 6 gezeigten Versuchsergebnisse in graphischer Darstellung.

Zur Verdeutlichung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im folgenden einige Ausführungsbeispiele gegeben.

Allgemeines

Die flüssig kristalline kubische Phase (LCP) wird hergestellt durch Mischen einer wäßrigen Phase mit geschmolzenem Mono-olein (MO, 1-Monooleoyl-rac-glycerol) im Volumenverhältnis von 30 : 70.

100-150?g festes MO wird in ein Eppendorfgefäß eingewogen und mit N₂ überschichtet. Das eingewogene MO wird im Ofen bei ca. 60 Grad C, 5 min geschmolzen. Das geschmolzene MO wird anschließend im Ultraschallbad ca. 5 min entgast. 70?l flüssiges MO werden dann luftblasenfrei in eine vorgewärmte Hamilton-Spritze aufgesaugt.

Für die isoelektrische Fokussierung wird eine wässrige Phase mit der folgenden Zusammensetzung verwendet:
10?l des Carrier-Ampholyten Ampholine® (Amersham-Pharmacia) (Endkonzentration bis ca. 8% in der wässrigen Phase) und H₂O qsp 50?l.
Die wässrige Phase wird gemischt und per Ultraschall entgast, anschließend werden 30?l der wässrigen Phase in eine zweite Hamilton-Spritze gefüllt.

Die Spritzen der beiden Spritzen werden Kopf-an-Kopf gekoppelt, und die beiden Phasen durch ca. 100-200 maliges Durchdrücken von einer Spritze in die andere gemischt.

Die LCP entsteht spontan bei homogener Durchmischung der wässrigen Phase mit dem geschnolzenen MO und ist dadurch erkennbar, dass die Phase komplett klar und durchsichtig erscheint.

Als Probe werden z. B. aufgereinigtes Protein, ein Proteingemisch, eine Vesikel- Präparation oder Farbstoffe verwendet.

Die Trennung erfolgt in den folgenden Ausführungsbeispielen bei einer Temperatur von 30 Grad Celsius.

Allgemeine Elektrophorese-Bedingungen, sofern in den expliziten Ausführungsbeispielen nicht anderweitig angegeben sind:

- Kathodenpuffer: 0.1 M TRIS-SO₄ pH 9.3
- Anodenpuffer: 0.08 M H₃PO₄
- Feldstärken (SI ist V/m, hier V/Säulenlänge) und Elektrophoresedauer:
1 h bei ca. 100 V/60 mm
1 h bei ca. 240 V/60 mm
4-24 h bei 600 V/60 mm

Beispiel 1 Elektrophorese von polaren Molekülen in einer flüssigkristallinen kubische Phase (LCP)

35?l einer LCP werden mit 100 mM Tris-HCl pH 7.4; Tris: Mono-olein 30 : 70 (v/v) vermischt, so dass sich eine LCP ausbildet. Als Elektrophoresepuffer an Anode und Kathode wird ein 100 mM Tris HCl pH 7.4 Puffer verwendet. Als Analyt wird ein anionischer Farbstoff Orange G (1 mg/ml) eingesetzt. 5?l des Analyten wurden an der Kathode auf der Oberfläche der LCP auf der Gewinde-Seite der Spritze deponiert und für ca. 15 min einer Spannung von 300 V ausgesetzt. Orange G ist in die klare LCP hineingewandert. Eine scharfe Wanderungsfront ist erkennbar (siehe dazu Fig. 1). Elektrophorese von geladenen Molekülen in LCP ist demnach möglich.

Beispiel 2 Trennung zweier Farbstoffe mit einem Tris-Glycin-SDS-Puffersystem

In 100?l einer LCP bestehend aus Elektrophoresepuffer: Mono-Olein in einem Verhältnis von 30 : 70 (v/v), wobei der Elektrophoresepuffer aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0.1% (w/v) Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS) besteht, werden 5?l eines Analyten aus einer Mischung aus Bromphenolblau und Orange G, beides anionische Farbstoffe, in der Konzentration von ca. 1 mg/ml auf der Oberfläche der LCP an der Kathode deponiert. Die Elektrophorese wird 1 h bei 100 V, 1 h bei 240 V und 6 h bei 600 V durchgeführt.

Die elektrophoretische Mobilität der beiden Farbstoffe ist unterschiedlich, was zu deren Trennung in der LCP führt (Fig. 2).

Längere Elektrophorese kann zu einer Veränderung der Matrix führen (milchig-weiße Bereiche in der Matrix am rechten Ende nahe der Anode).

Beispiel 3 Etablierung eines pH-Gradienten

Dazu wird die LCP bestehend aus einer wässrigen Phase und Mono-Olein im Verhältnis von 30 : 70 (v/v) verwendet. Die wässrige Phase ist zusammengesetzt aus 5% Ampholine ® 3.5-9.5 (Amersham-Pharmacia) in Wasser mit Bromophenolblau als pH-Indikator. Als Anolyt wird eine 0.08 M H3PO4-Lösung, als Katholyten eine 0.1 M Tris-SO4 pH 9.3-Lösung verwendet. Die Elektrophorese wird 1 h bei 100 V, 1 h bei 240 V, 4.1 h bei 600 V durchgeführt.

Ein pH-Gradient, erkennbar an unterschiedlicher Farbe des pH-Indikators, konnte etabliert werden.

Der pH-Gradient wird durch Carrier-Ampholyte etabliert. Die LCP ist mit Bromphenolblau eingefärbt. Im basischen ist Bromphenolblau blau gefärbt, der pH Umschlagsbereich liegt bei pH 4.6-3.0 über grün zu gelb ab pH 3.0. Fig. 3a zeigt die homogen gemischte LCP vor der Elektrophorese. Fig. 3b zeigt den aufgebauten pH-Gradienten nach der Elektrophorese.

Beispiel 4 Auftrennung einer heterogenen Mischung von fluoreszenzmarkiertem Protein

Mit einem Cy3 Fluoreszenzfarbstoff-markierten heterogen gelabelten Lysozym konnte in der LCP per Fluoreszenz-Scan nachgewiesen und in verschiedenen Banden fokussiert werden. Die Elektrophorese-Bedingungen wurden wie in Beispiel 3 gewählt.

Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung von Cy3-gelabelten Lysozym in einer LCP. Fig. 4 zeigt von oben nach unten:

1. Homogen gemischte LCP mit Cy3-Lysozym,
2. nach 1.5 h isoelektrischer Fokussierung bei 100 V (150 Vh)
3. nach 1 h isoelektrischer Fokussierung bei 600 V (750 Vh)
4. nach 2,5 h isoelektrischer Fokussierung bei 600 V (1650 Vh)
5. nach 3.5 h isoelelktrischer Fokussierung bei 600 V (2250 Vh)
6. nach 4.7 h isoelektrischer Fokussierung bei 600 V (2970 Vh)
7. Nach 6.5 h isoelektrischer Fokussierung bei 600 V (4050 Vh)
8. Nach 8 h isoelektrischer Fokussierung bei 600 V (4950 Vh)

Erkennbar ist, das die verschiedenen Proteine in Banden fokussiert werden, und dann zur Kathode driften.

Beispiel 5 Direkte Solubilisierung von Membranproteinen, Solubilisierung von Membranproteinen in einer LCP

Dazu werden als Modellsystem Chromatophoren verwendet. Die Chromatophoren sind Cytoplasma-Membranvesikel eines Prokaryonten mit photosynthetischen Membranproteinen die Farbpigmente, wie z. B. Chlorophylle, Cytochrome, usw. gebunden haben. Nach Mischung der Vesikel mit MO in einem Verhältnis von 30 : 70 (v/v) zu einer homogen grünlich gefärbten LCP, die auch nach 10 h Zentrifugation bei 55.000 g kein sichtbares Pellet zeigt, werden insgesamt 150?g totales Protein in 100?g LCP gelöst. Eine detergenzfreie, direkte Solubilisierung eines Membranproteingemisches ist demnach möglich.

Beispiel 6 Elektrophoretische Trennung eines fluoreszenzmarkierten Phosphatidyl- Ethanolamins an einer LCP-Seperationsmatrix

Ein monofunktionaler Fluoreszenzfarbstoff Cy5-Dye (Amersham, Nr.: PA25001) wurde nach Angaben des Herstellers mit Phosphatidyl-Ethanolamin (PE) zu einem Cy5-PE-Konjugat gekoppelt (Lösungsmittel: 50 mM HEPES pH 9.0 in 90% MeOH) und per DC aufgereinigt (Silica 60 HPTLC Platten, Merck 1.05631; Laufmittel 60 : 35 : 8 v : v : v CHCl3 : MeOH : H2O).

Das Reaktionsprodukt zeigte die erwartete Massenverteilung in MALDI-TOF-MS.

Zur isoelektrischen Fokussierung wird eine LCP mit einer Zusammensetzung aus 70 ?l flüssigem, entgasten Mono-olein (MO) 30?l wässrige Phase aus 1 : 5 verdünntem Ampholine® 9.5-3.5 (Amersham-Pharmacia) in H₂O mit Cy5-PE als Analyt eingesetzt. Als Anolyt wird eine 0.08 M H₃PO₄-Lösung, als Katholyt eine 0.1 M TRIS- SO₄ pH 9.3-Lösung verwendet.

Die Ergebnisse der isoelektrischen Fokussierung unter Variation der Fokussierungsbedingungen sind in Fig. 5 abgebildet. Fig. 5 zeigt von oben nach unten die Ergebnisse folgender Experimente:

1. links ist in der wässrigen Phase mit Ampholine ® 9.5-3.5 das fluoreszierende Cy5-PE-Konjugat als schwarzes Präzipitat erkennbar, die Spritze rechts enthält geschmolzenenes MO.
2. zeigt eine noch inhomogene Verteilung des Analyten im Trennmedium und damit eine noch inhomogene Verteilung der LCP in der wässrigen Phase nach ca. 100 Vermischungsschritten,
3. zeigt eine homogene Verteilung des Analyten im Trennmedium nach ca. 200 Vermischungen
4. zeigt das Ergebnis der Elektrophorese bei 100 V nach 1 h (100 Vh)
5. zeigt das Ergebnis der Elektrophorese bei 100 V nach 3 h (300 Vh),
6. zeigt das Ergebnis der Elektrophorese bei 600 V nach 1,5 h (900 Vh),
7. zeigt das Ergebnis der Elektrophorese bei 600 V nach 2,5 h (1500 Vh),
8. zeigt das Ergebnis der Elektrophorese bei 600 V nach 3,75 h (2250 Vh),
9. zeigt das Ergebnis der Elektrophorese bei 600 V nach 4,85 h (2910 Vh).

Cy5-PE ist nicht im Anolyten detektierbar (100?l Ende der Spritze).

Beispiel 7 Elektrophorese eines Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-gelabelten Peptids an einer LCP-Seperationsmatrix

Als Analyt wird ein Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-gelabeltes Peptid mit der Sequenz YVAD verwendet.

Als Trennmedium wird eine Mischung aus einer LCP bestehend aus 70?l flüssigem, entgastes Mono-Olein (MO) und 30?l einer wässrigen Phase aus 50 mM HEPES pH 8.0 enthaltend den Analyten mit einer Konzentration von 0.125 mg/ml FITC-YVAD.

Die Elektrophorese wird mit 50 mM HEPES als Anolyt und Katholyt bei konstant 150 V durchgeführt. Das verwendete Peptid ist aufgrund der stark hydrophoben Aminosäuren YVA nur zu geringen Teilen in Wasser löslich und trägt negative Ladungen am Fluoreszein und in der Aspartat-Seitenkette. Während der Elektrophorese kann die Wanderung des markierten Proteins zur Anode beobachtet werden (Fig. 6, links 100?l Ende der Spritze). Entsprechend der begrenzten Wasserlöslichkeit ist das Peptid auch im Anolyten zu finden, wodurch gezeigt wird, dass die wässrigen Domäne der LCP mit dem umgebenden Puffer kontinuierlich v erbund ist (siehe dazu auch Beispiel 6).

Fig. 6 zeigt das Ergebnis der elektrophoretischen Wanderung (Anode links, Kathode rechts) des peptidischen Analyten bei einer Elektrophoresespannung von konst. 150 V:

1. nach 0 Vh
2. nach 182.5 Vh
3. nach 402.5 Vh
4. nach 535 Vh
5. nach 702 Vh

Da ein einheitliches Puffersystem verwendet wurde, kann die elektrophoretische Mobilität des Analyten abgeleitet werden: Die Wanderungsdistanz der Front wird bei der Auswertung in Pixeln gemessen, bei einer Auflösung des Fluoreszenzscanners von 100?m/Pixel entspricht ein Pixel einer Wanenderungsdistanz von 100?m:
Tabelle 1 zeigt die elektrophoretische Mobilität von FITC-YVAD ermittelt gemäß Beispiel 7.

Tabelle 1

Die graphische Darstellung der elektrophoretischen Mobilität ist in Fig. 7 dargestellt.

Claims

1. Verfahren zur elektrophoretischen Trennung einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass als Trennmedium eine Mischung aus einer polaren Flüssigkeit und einer Seperationsmatrix aus mindestens einer amphiphilen Substanz, die eine flüssigkristalline Phase bildet, eingesetzt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Trennmedium ein Verhältnis an polarer Flüssigkeit zu flüssig-kristalliner Phase zwischen 10 : 90 und 50 : 50 (v/v) besitzt.

3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als polare Flüssigkeit Wasser eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten amphiphilen Substanzen eine lamellare, hexagonale, invertiert hexagonale oder kubisch kristalline Phase bildet.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten amphiphilen Substanzen ungeladen sind.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten amphiphilen Substanzen Alkohol-Fettsäureester sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten amphiphilen Substanzen einen C₂-C₄-Alkohol mit 1 bis 4 teilweise oder vollständig veresterten Hydroxygruppen enthält.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte amphiphile Substanz aus der Gruppe der Mono- oder Diacylglyceride, der Acylglycerinphosphatide, der Glycoacylglyceride, der Aminoacylglyceride oder aus einer Mischung enthaltend solche Substanzen ausgewählt ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte amphiphilen Substanzen C₈-C₃₀-Acylgruppen enthalten.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten amphiphilen Substanzen als Acylgruppen ein- bis fünffach ungesättigte veresterte C₁₂-C₂₄-Fettsäuren oder gesättigte veresterte C₈-C₂₀- Fettsäuren enthalten.

11. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten amphiphilen Substanzen als Acylgruppen veresterte einfach ungesättigte cis-C₁₄-C₂₂-Fettsäuren enthalten.

12. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als amphiphile Substanz 1-Monooleoyl-rac-glycerol, 1-Monomyristoyl-rac-glycerol oder 1- Monopalmitoyl-rac-glycerol eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der flüssig kristallinen Phase weitere Hilfsstoffe aus der Gruppe der Detergenzien, der synthetischen oder natürlich vorkommenden Lipide, der fettlöslichen biologischen Kofaktoren, Fettsäuren oder der C₈-C₃₀-Alkane, -Alkene, -Alkine oder Alkohole zugesetzt werden.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsstoffe der amphiphilen Phase Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, geladene oder ungeladene Phospholipide, Sphingolipide oder Glycolipide, Chlorophyllen, Retinol, Steroide, Carotinoide oder Chinone zugesetzt werden.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Lipide oder Detergenzien mit ionischen oder zwitterionischen Kopfgruppen zugesetzt werden.

16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der polaren Flüssigkeit Carrier-Ampholyte zugesetzt werden.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Carrier- Ampholyt Ampholine ® in einem Konzentrationsbereich von 0.1 bis 40 Vol-% eingesetzt wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Carrier- Ampholyt Ampholine ® in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 8 Vol-% eingesetzt wird.

19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsstoffe der polaren Flüssigkeit kleine polare amphiphile Substanzen, polare Glycole, Zuckermonomere oder -multimere, Aminosäuren oder zwitterionische Substanzen zugesetzt werden.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zugesetzten Hilfsstoffe aus der Gruppe Glycerol, Ethylenglycol, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycin, Harnstoff und Guanidin ausgewählt sind.

21. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte polare Flüssigkeit gepuffert ist.

22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Trennmedium ein pH-Gradient aufgebaut wird.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrophoretische Trennverfahren eine isoelektrische Fokussierung ist.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten in dem Trennmedium vor Beginn der Trennung gelöst werden.

25. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophoben Analyten in der flüssigkristallinen Phase vor Beginn der Trennung gelöst werden.

26. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die elektrophoretische Trennung bei einer Temperatur von 20 bis 40°C durchgeführt wird.

27. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrophoretische Trennung bei einer Spannung zwischen 100 V und 8000 V durchgeführt wird.

28. Verwendung von, in polaren Flüssigkeiten, flüssig kristalline Phasen bildenden amphiphilen Substanzen zur elektrophoretischen Trennung von ionischen oder ionisierten Lipiden, Metaboliten, Kohlenhydraten, Zuckern, Glycolipden, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Glycoproteinen, Peptiden und Proteinen.

29. Verwendung von, in polaren Flüssigkeiten, flüssig kristalline Phasen bildenden amphiphilen Substanzen zur elektrophoretischen Trennung von ionischen oder ionisierten Lipiden, Metaboliten, Kohlenhydraten, Zuckern, Gylcolipiden, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Glycoproteinen, Peptiden und Proteinen mittels isoelektrischer Fokussierung.

30. Verwendung von, in polaren Flüssigkeiten, flüssig kristalline Phasen bildenden amphiphilen Substanzen zur elektrophoretischen Trennung von peptid- und proteinehaltigen Proben enthaltend lipophile und hydrophile Bestandteile.

31. Verwendung von, in polaren Flüssigkeiten, flüssig kristalline Phasen bildenden amphiphilen Substanzen zur elektrophoretischen Trennung von lipophilen Bestandteilen peptid- und proteinhaltiger Proben.