DE10104558C1

DE10104558C1 - Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien und Viren

Info

Publication number: DE10104558C1
Application number: DE2001104558
Authority: DE
Inventors: Axel Stemberger; Guenther Portenlaenger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2001-02-01
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2021-02-02
Also published as: WO2002064173A1

Abstract

Um in menschlichen sowie tierischen Blutplasmen, Seren bzw. wässrigen Lösungen von Blut- bzw. Serenbestandteilen Bakterien und Viren zu inaktivieren, werden diese Lösungen mit niederfrequentem Ultraschall unter einem Schutzgas bestrahlt. Als Schutzgas hat sich bei Bakerien und Viren insbesondere Kohlendioxid bewährt, mit dem auch die Lösung durchspült wird. Die Ultraschallfrequenz liegt im Bereich zwischen 40 und 500 kHz, bevorzugt um 300 kHz.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien und Viren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Mit der Transfusion von Blut oder von daraus gewonnenen Blutprodukten besteht das Risiko der Übertragung von Infektionskrankheiten. Blut- oder zelluläre Komponenten können Bakterien, Parasiten, Pilze und Viren enthalten, die dann bei der Transfusion übertragen werden. Bei Blutplasma und den hieraus gewonnenen Produkten in flüssigen Medien sind in der Regel nur Viren an transfusionsrelevanten Erkrankungen beteiligt. Für die Übertragung von Infektionskrankheiten relevante Bakterien bzw. Viren müssen daher in dem Blutprodukt zerstört werden.

Durch die heute per Gesetz vorgeschriebenen Maßnahmen wird für Vollblut und/oder die zellulären Komponenten eine hohe Sicherheit erreicht. Für die von der Industrie hergestellten Blutprodukte wurden zwischenzeitlich umfangreiche Qualitätssicherungsmaßnahmen etabliert und effektive Verfahren zur Virusreduktion entwickelt; vgl. hierzu etwa F. Auer "Gesetzgeberische Maßnahmen zur Arzneimittelsicherheit von Blut und Blutprodukten", Hämostaseologie 15, 179-181 (1995) Bundesamt und Paul Ehrlich Institut: "Anforderungen an Validierungsstudien zum Nachweis von Virussicherheit von Arzneimitteln aus menschlichem Blut oder Plasma, Bundesanzeiger vom 4. Mai 1994, S. 4742, W. A. Fricke "Viral Safety of Clotting Factor Concentrates", Thromb. Haemost. 19, 54-61 (1993) oder P. M. Manucci "Clinical Evaluation of Viral Safety of Coagulation Factor Concentrates", Hemophilia World, 8, 1-5 (1993).

Um die notwendige Virussicherheit von Blutprodukten, wie z. B. "frisch gefrorenes Plasma (Fresh Frozen Plasma)", von Gerinnungspräparaten oder entsprechenden Lösungen zu gewährleisten, sind neben der Auswahl der Spender und der umfangreichen Testverfahren vor allem validierte Inaktivierungsverfahren notwendig; vgl. M. Chudy, C. M. Nübling, M. Scheiblauer, H. Willkommen, R. Kurth, J. Löwer "Virusübertragung durch Blutprodukte: Mögliche Ursachen und Konsequenzen", Hämastaseologie 15, 215-219 (1995).

Die derzeit gebräuchlichen Verfahren beruhen auf komplexen physikalischen und/oder chemischen Technologien, die aufwendige Anlagen benötigen und in der Regel mit der Reduzierung der Aktivität der hergestellten Plasmaprodukte verbunden sind. Viruzide Verfahren zur Herstellung von Blutprodukten beruhen auf der Erhitzung gefriergetrockneter Zwischenprodukte (Dry Heating) mit gespanntem Wasserdampf bei etwa 80°C, Erhitzen in Lösung bei etwa 60°C unter Zusatz von Stabilisatoren wie Zucker usw., Erhitzen mit organischen Lösungsmitteln, wie n-Heptan, Behandlung mittels des sogenannten "solvent detergent"-Verfahrens (SD-Verfahren), Inkubation mit Methylenblau oder Nanofiltration, um nur einige Verfahren zu nennen. Eine Beschreibung der bekannten Verfahren findet sich bei M. Doll et al. "Oxidative Alteration of Blood Coagulation in Methylene Blue-Treated Therapeutic Plasma", Ann. Hematol 76. (SuppII) A64, (1998). Einige Techniken wie das SD-Verfahren erfassen nur lipophile Viren: es werden daher bei der industriellen Herstellung von Blutderivaten einige der aufgezählten Verfahren kombiniert.

Problematisch ist die Entfernung der zugesetzten Chemikalien und Schutzstoffe, die Abtrennung inaktivierter Proteine sowie deren Aufkonzentrierung in aufwendigen Produktionsschritten. In der Regel sind zudem diese Verfahren mit einem hohen Aktivitäts- und Ausbeuteverlust verbunden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien oder Viren in flüssigen Medien, insbesondere in menschlichen oder tierischen Blutplasmen, Seren bzw. wässrigen Lösungen von Blut- bzw. Serumbestandteilen anzugeben, welches relativ einfach durchzuführen ist und keine komplexen Aufbereitungs- und Reinigungsschritte benötigt.

Diese Aufgabe ist gemäß der Erfindung durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst.

Demgemäß wird das flüssige Medium, das die zu inaktivierenden Bakterien und Viren enthält, mit niederfrequentem Ultraschall unter einem Schutzgas bestrahlt. Vorzugsweise ist das Medium hierbei mit dem Schutzgas gesättigt und wird bei der Ultraschallbestrahlung von dem Schutzgas durchspült.

Als Schutzgas hat sich für die Inaktivierung von Bakterien und Viren besonders Kohlendioxid, d. h. CO₂ bewährt; es sind jedoch auch inerte Gase wie Stickstoff oder Edelgase und hier bevorzugt wegen des großen Molekulargewichtes Argon zu verwenden.

Die Ultraschallstrahlung liegt im niederfrequenten Bereich zwischen etwa 40 und 500 KHz, bevorzugt zwischen 200 und 400 KHz, wobei die gesamte eingebrachte Ultraschalldosis pro Kilogramm des Mediums im Bereich zwischen 0,5 und 2 kJkg^-1, bevorzugt bei etwa 0,8 kJkg^-1 liegt. Die Leistung liegt hierbei im Bereich zwischen 0,2 bis 1,0 kJkg^-1h^-1, vorzugsweise um 0,5 kJkg^-1h^-1.

Die Bestrahlungsdauer liegt je nach der Belastung mit Bakterien oder Viren zwischen etwa einer Stunde und 24 Stunden.

Die Temperatur des mit Ultraschallbehandelten Mediums ist im wesentlichen unkritisch und kann zwischen 1°C und 50°C, bevorzugt zwischen 5°C und etwa Zimmertemperatur, d. h. 20°C liegen.

Ebenso ist bei einer wässrigen Lösung der pH-Wert relativ unkritisch, er kann auf Werte zwischen 3 bis 8 eingestellt werden.

Wesentlich bei dem Verfahren gemäß der Erfindung ist die Kombination von Ultraschallbestrahlung und das Einbringen des Mediums in eine Schutzatmosphäre bzw. ein Schutzgas. Durch diese Kombination findet eine mechanische Zerstörung der Bakterien und Viren in Blutplasma, in Lösungen von Gerinnungsfaktoren oder Gewebekulturflüssigkeiten statt. Es ist hiermit möglich, Bakterien sowie umhüllte und nicht umhüllte Viren unter Erhalt der Funktion der Plasmaproteine zu aktivieren. Die Behandlung von Blutplasma oder isolierten Blutprodukten mit Ultraschall ist in einem geschlossenen System relativ einfach durchzuführen und kann mit relativ geringem apparativen Aufwand auf rein physikalischem Weg ohne Zusatz von Chemikalien erfolgen.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung entfallen zudem aufwendige Abtrennschritte und die komplexe Reinigung von Resten etwaig eingesetzter Chemikalien sowie die Entsorgung von problematischen Reststoffen und Abwässern, sodass auch aus Umweltgründen dieses Verfahren positiv zu bewerten ist. Das Verfahren ist kostengünstig und eine umweltverträgliche Alternative zu herkömmlichen Verfahren.

Mit dem durch die Erfindung vorgeschlagenen Kombinationsverfahren können Makrostrukturen, wie Bakterien und Viren gezielt abgebaut werden, ohne dass die anderen Wirkstoffe im Medium, das sind Blutbestandteile des Plasmas, das Blutserum oder Proteinlösungen, zerstört oder verändert werden. Die Verwendung von Ultraschall in Kombination mit einem Schutzgas führt somit zu einer selektiven mechanischen Beschädigung der Bakterien bzw. Virenbestandteile wie Hülle und/oder der DAN/RNA. Der mechanisch induzierte Ultraschallabbau von Makromolekülen ist ohne störende radikalinduzierte Reaktionen des Ultraschalles durch Einsatz von insbesondere Kohlendioxid als Schutzgas möglich. Durch das Schutzgas und insbesondere Kohlendioxid wird die Bildung von Radikalen verringert oder sogar ausgeschlossen. Die konnte im Labormaßstab bereits nachgewiesen werden.

Das bedeutet, dass mit dem Verfahren gemäß der Erfindung eine rein mechanisch induzierte Schädigung der Molekülstruktur der Bakterien bzw. Viren ermöglicht wird. In einem Multikomponenten-System, wie z. B. Blutplasma, werden somit durch Ultraschall nur Strukturen mit großen Molmassen angegriffen, wobei die niedermolekularen Bestandteile nicht von diesem mechanischen Abbau betroffen sind, wie gerinnungsanalytische Untersuchungen der mit Ultraschall behandelten humanen Plasmen belegen.

Die Erfindung ist in einem Beispiel erläutert:
So genanntes "Fresh Frozen Plasma" (FFP) wurde aufgetaut, in einer entsprechenden Vorrichtung mit Kohlendioxid begast und durchspült und über einen Ultraschallschwinger mit 260 kHz in einem Wasserbad, in dem der Schwinger plaziert ist, bei etwa 20°C beschallt.

Die Aktivität der Gerinnungsfaktoren nach der Beschallung von humanem Plasma wird mittels einer in der Gerinnungsanalytik etablierten Methode, z. B. der Thrombelastographie mit einem Koagulometer bestimmt. Zur Bestimmung des negativen Thrombelastographen werden 300 Mikroliter Plasma mit 0,4 Mikroliter Kaolin versetzt und mit 20 Mikroliter einer 0,2 molaren Kalziumchlorid-Lösung rekalzifiziert, wonach anschließend die Analyse gestartet und die Daten über ein Computerprogramm ausgedruckt werden. In der folgenden Tabelle sind jeweils unterschiedliche Proben aufgelistet, die etwa die gleiche Zusammensetzung hatten und zwischen 0,5 Stunden und 13 Stunden unter Kohlendioxid-Atmosphäre mit Ultraschall bestrahlt wurden, nämlich jeweils in der Spalte a) die Werte für Proben unter Schutzgas und Durchspülung mit Kohlendioxid und in der Spalte b) Proben, die lediglich mit Ultraschall ohne Schutzgas bestrahlt wurden. Aufgelistet ist einmal die r-Zeit in Sekunden, die für eine Kontrollprobe 595 Sekunden betrug und die maximale Amplitude MA in Millimeter, die für die Kontrollprobe 22,2 Millimeter betrug. Die r-Zeit ist hierbei die Zeit bis zum Anfang der Blutgerinnung, die Amplitude MA ein Maß für die Stabilität der Probe. Beide Werte werden mit dem Koagulometer simultan bestimmt.

Man sieht, dass die r-Zeit für die Proben, die lediglich mit Ultraschall bestrahlt werden, im Laufe der Zeit ihre Gerinnungsaktivität, die durch die r-Zeit ausgedrückt wird, verlieren; in der Tabelle sind die Proben in der Spalte b) nach 6 Stunden bzw. 13 Stunden nicht mehr gerinnungsfähig ("kein Clot"). Im Gegensatz hierzu sind die in der Spalte a) aufgelisteten und mit Ultraschall unter Schutzgas bestrahlen Proben in ihrer Gerinnungsaktivität praktisch nicht beeinflußt. Das gleiche zeigt sich für die maximale Amplitude, die sich bei den Proben in der Spalte a) zumindest bis zu 6 Stunden nur geringfügig, bei den Proben in der Spalte b) jedoch rapide absinkt.

Claims

1. Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien und Viren in flüssigen Medien, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium mit niederfrequentem Ultraschall unter einem Schutzgas bestrahlt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium mit dem Schutzgas gesättigt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium bei der Ultraschallbestrahlung von dem Schutzgas durchspült wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraschallfrequenz zwischen 40 und 500 kHz liegt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraschallfrequenz zwischen 250 und 400 kHz liegt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte in das Medium eingestrahlte Ultraschalldosis pro Kilogramm des Mediums im Bereich zwischen 0,5 und 2 kJkg^-1 liegt, bevorzugt bei etwa 0,8 kJkg^-1.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraschall- Dosisleistung im Bereich zwischen 0,2 bis 1,0 kJkg^-1h^-1, vorzugsweise um 0,5 kJkg^-1h^-1 liegt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des mit Ultraschall bestrahlten Mediums zwischen +1°C und +50°C, bevorzugt zwischen 5°C und 20°C gehalten wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer wässrigen Lösung deren pH-Wert auf Werte zwischen 3 bis 8 eingestellt wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schutzgas ein inertes, Gas, ein Edelgas, bevorzugt Argon, oder Kohlendioxid ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dauer der Ultraschallbestrahlung zwischen einer Stunde und 24 Stunden liegt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als flüssige Medien menschliche oder tierische Blutplasmen, Seren bzw. wässrige Lösungen in Blut- bzw. Serumbestandteilen eingesetzt werden.