DE10103304A1 - Verfahren zur fluoreszenzspektroskopischen, insbesondere fluoreszenzkorrelationsspektroskopischen Untersuchung einer Messprobe sowie Einrichtung zur Durchführung desselben - Google Patents

Abstract

Bei einem Verfahren zur fluoreszenzspektroskopischen, insbesondere fluoreszenzkorrelationsspektroskopischen Untersuchung einer Messprobe wird diese in eine in einem Probenträger (10) vertieft ausgebildete Probenaufnahmekammer (12) eingebracht. Sodann werden in der Messprobe enthaltene, elektrisch geladene Analyten elektrisch in einem innerhalb des Probenvolumens liegenden Messvolumen (26) konzentriert, woraufhin das Messvolumen (26) untersucht wird. Erfindungsgemäß werden zur Konzentrierung der Analyten in dem Messvolumen (26) die Begrenzungswände (28) der Probenaufnahmekammer (12) im Wesentlichen ganzflächig auf ein zur Ladung der Analyten gleichsinniges elektrostatisches Potential gebracht. Eine so gebildete elektrische Molekülfalle lässt sich sehr einfach realisieren und eignet sich besonders für Reihenuntersuchungen von Messproben, die in großer Vielzahl eng nebeneinander in Vertiefungen (12) des Probenträgers (10) angeordnet sind.

Description

Die Erfindung befasst sich mit der fluoreszenzspektroskopischen, ins­ besondere fluoreszenzkorrelationsspektroskopischen Untersuchung einer Messprobe.

Mittels Fluoreszenzspektroskopie kann das Vorhandensein bestimmter Analyten in einer Messprobe, beispielsweise einer biologischen Probe, z. B. einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel etc., oder einem molekularbiologischen Reaktionsansatz, z. B. einem Sequen­ zierungsansatz, nachgewiesen werden. Bei den Analyten kann es sich um niedermolekulare Substanzen, wie Arzneimittel, Hormone, Nukleotide, Metaboliken etc., oder hochmolekulare Substanzen, wie Proteine, Zucker, Nukleinsäuren etc., Viren oder Zellen, wie Bakterienzellen, und sonstige Substanzen handeln. Um die gesuchten Analyten identifizieren zu kön­ nen, werden sie mit fluorophor-tragenden Reagenzien markiert, die bei Licht-, insbesondere Laserbestrahlung Fluoreszenzsignale aussenden, welche detektiert und ausgewertet werden. In der Fluoreszenzkorrela­ tionsspektroskopie werden hierbei Auto- oder/und Kreuzkorrelationen der detektierten Fluoreszenzsignale ausgewertet. Nähere Informationen zur Fluoreszenzspektroskopie und insbesondere zur Fluoreszenzkorrelations­ spektroskopie können beispielsweise der EP 0 679 251 B1 entnommen werden.

Im Fokus des zur Untersuchung verwendeten Mikroskops liegt regelmä­ ßig nur ein kleines Teilvolumen der Probe - das Messvolumen. Damit die fluoreszierenden Moleküle nicht durch zu intensive und lange Lichtbe­ strahlung ausbleichen und die Messungen verfälschen, ist man bestrebt, dieses Messvolumen ultraklein zu machen, beispielsweise im Femtoliterbereich. Wenn die zu identifizierenden Analyten jedoch nur in sehr gerin­ ger Konzentration in der Messprobe vorhanden sind, kann es bei derart kleinen Messvolumina vergleichsweise lange und für Reihenuntersuchun­ gen im Großmaßstab sogar unakzeptabel lange dauern, bis einer der gesuchten Analyten in das Messvolumen diffundiert und dadurch beob­ achtbar wird.

Zur Beschleunigung der Messung wurden deshalb in der einschlägigen Fachliteratur und unter anderem auch in der oben erwähnten europäi­ schen Druckschrift EP 0 679 251 B1 elektrische Molekülfallen vorge­ schlagen, mittels der die nachzuweisenden Analyten, sofern sie elektrisch geladen sind, unter dem Einfluss elektrischer Felder in das Messvolumen getrieben und dort konzentriert werden können. Aus der EP 0 679 251 B1 ist es beispielsweise bekannt, die gesuchten Analyten mittels eines rotierenden elektrischen Wechselfelds in dem Messvolumen zu halten. Quer zu diesem Wechselfeld werden sie durch zwei elektrisch gleichsin­ nig geladene Pole am Verlassen des Messvolumens gehindert. In der DE 195 08 366 C2 wird vorgeschlagen, zwischen einer Ringelektrode und einer mit ihrer Spitze im Zentrum der Ringelektrode angeordneten Kapil­ lare ein elektrisches Feld zu erzeugen, das die Konzentrierung der ge­ suchten Analyten um die Kapillarspitze herum bewirkt.

Solche Molekülfallen eignen sich allein schon aufgrund des Platzbedarfs der zur Erzeugung der elektrischen Felder benötigten Elektroden, aber auch aufgrund des häufig erforderlichen hohen Aufwands für die elek­ trische Steuerung der Elektroden vorwiegend für Einzeluntersuchungen. Sie erweisen sich aber als wenig geeignet, wenn im Rahmen von Reihen­ untersuchungen eine große Anzahl von Messproben, beispielsweise meh­ rere Tausend bis hin zu einigen Hunderttausend, die in eng benachbarten Vertiefungen eines gemeinsamen Probenträgers angeordnet sind (etwa . einer aus der EP 0 679 251 B1 bekannten Multi-Well-Folie), mit vertret­ barem Aufwand untersucht werden sollen.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, einen einfacheren Weg der elektri­ schen Konzentrierung von Analyten anzugeben.

Bei der Lösung dieser Aufgabe geht die Erfindung aus von einem Ver­ fahren zur fluoreszenzspektroskopischen, insbesondere fluoreszenzkorre­ lationsspektroskopischen Untersuchung einer Messprobe, bei welchem Verfahren die Messprobe in eine in einem Probenträger vertieft ausgebil­ dete Probenaufnahmekammer eingebracht wird, sodann in der Messprobe enthaltene, elektrisch geladene Analyten elektrisch in einem innerhalb des Probenvolumens liegenden Messvolumen konzentriert werden und das Messvolumen untersucht wird.

Erfindungsgemäß ist bei diesem Verfahren vorgesehen, dass zur Konzen­ trierung der Analyten in dem Messvolumen die Begrenzungswände der Probenaufnahmekammer im Wesentlichen ganzflächig auf ein zur Ladung der Analyten gleichsinniges elektrostatisches Potential gebracht werden. Infolge der auf die Begrenzungswände der Probenaufnahmekammer auf­ gebrachten elektrischen Ladung werden Abstoßungskräfte auf die gleich­ sinnig geladenen Analyten in der Messprobe ausgeübt. Bei geeigneter Gestaltung der Probenaufnahmekammer führt diese Abstoßung dazu, dass sich die Analyten gezielt zu dem Messvolumen hinbewegen und dort ansammeln. Es hat sich gezeigt, dass auf diese Weise Analyten, deren Konzentration in der Messprobe unterhalb des nM-Bereichs bis hinunter zum aM-Bereich liegt, im Messvolumen ohne weiteres auf Werte im nM-Bereich angereichert werden können, so dass das Vorhandensein dieser Analyten innerhalb vertretbarer Messzeiten (beispielsweise in weni­ ger als einer Sekunde) nachgewiesen werden kann.

Wenn hier von einem Ladungssinn der Analyten die Rede ist, zu dem das Wandpotential der Probenaufnahmekammer gleichsinnig sein soll, so ver­ steht es sich, dass hierunter der Ladungssinn der fluorophor-markierten Analyten verstanden wird, da es diese sind, die im Messvolumen konzen­ triert werden sollen.

Bei der erfindungsgemäßen Lösung ist keine komplizierte und platzrau­ bende Elektrodenanordnung erforderlich. Vielmehr dienen die Wände der Probenaufnahmekammer selbst als Elektrode. Um diese Wände elektro­ statisch zu laden, kann eine einmalige Ladungsaufbringung genügen; zumindest für die Messzeit werden die Kammerwände die Ladung im Regelfall ohne besondere Zusatzmaßnahmen halten können. Es ist aber auch denkbar, dass die Kammerwände während der gesamten Messzeit ständig mit einer Potentialquelle verbunden sind. Es ist auch keine Steue­ rung des Potentials der Kammerwände erforderlich. Das erfindungsge­ mäße Verfahren erlaubt es, die Analyten zuverlässig im Messvolumen einzufangen, ohne dabei rückgekoppelt das Potential der Kammerwände dynamisch verändern zu müssen. Es ist noch nicht einmal ein zeitlich konstantes Wandpotential erforderlich. Dieses muss lediglich so hoch sein, dass hinreichend starke Abstoßungskräfte erzeugt werden, um die gewünschte Konzentrierung der Analyten zu erreichen. Ein eventueller Ladungsabfluß von den Kammerwänden kann deshalb tolerierbar sein, solange das Grundniveau des Wandpotentials ausreichend hoch ist. Nach einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Einrich­ tung zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens. Diese Einrichtung umfasst einen Probenträger mit mindestens einer vertieft in diesem aus­ gebildeten Probenaufnahmekammer sowie Mittel zur im Wesentlichen ganzflächigen elektrostatischen Aufladung der Begrenzungswände der Probenaufnahmekammer.

Die Probenaufnahmekammer kann hinterschnitten ausgebildet sein. Dies kann helfen, um innerhalb des Volumens der Messprobe einen Punkt des Coulomb'schen Kräftegleichgewichts zu erhalten. Es ist jedoch nicht grundsätzlich notwendig, einen solchen Gleichgewichtspunkt innerhalb des Volumens der Messprobe zu haben. Es ist denkbar, dass ein Punkt des Kraftgleichgewichts erst oberhalb des Füllniveaus liegt, bis zu dem die Messprobe die Probenaufnahmekammer ausfüllt. Es ist sogar vorstell­ bar, dass die Probenaufnahmekammer so gestaltet ist, dass überhaupt kein Punkt des Coulomb'schen Kräftegleichgewichts existiert. Da die Abstoßungskräfte die Analyten in Richtung zu niedrigeren elektrostati­ schen Potentialen treiben, sollte lediglich sichergestellt sein, dass das Messvolumen in einem Bereich niedrigsten elektrostatischen Potentials innerhalb des Gesamtvolumens der Messprobe liegt. Aus diesem Grund kann auch eine hinterschneidungsfreie Probenaufnahmekammer verwen­ det werden.

Um bei Reihenuntersuchungen die Prozedur zur elektrostatischen Aufla­ dung der Kammerwände möglichst ökonomisch zu gestalten, kann der Probenträger eine Vielzahl vorzugsweise matrixförmig angeordneter Pro­ benaufnahmekammern aufweisen, deren Begrenzungswände gemeinsam elektrostatisch aufladbar sind. Es versteht sich jedoch, dass auch ein Probenträger mit einer Vielzahl von Probenaufnahmekammern verwendet werden kann, deren Kammerwände wenigstens zum Teil individuell elek­ trostatisch aufladbar sind.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachfolgend anhand der bei­ gefügten Zeichnungen näher erläutert. Es stellen dar:

Fig. 1 schematisch eine Draufsicht auf einen Probenträger und

Fig. 2 schematisch eine Messanordnung zur Untersuchung einer Mess­ probe, die sich in einer Probenaufnahmekammer des Probenträgers befindet.

Der in Fig. 1 gezeigte und dort mit 10 bezeichnete flächige Probenträger weist in einer Matrixanordnung eine Vielzahl durch schwarze Punkte angedeuteter Probenaufnahmekammern 12 auf, in die Blutproben oder Proben anderer Lösungen eingefüllt werden können, welche auf das Vorhandensein bestimmter Viren, DNA-Fragmente oder anderer Analyten untersucht werden sollen. Die Probenaufnahmekammern 12 sind von Vertiefungen oder Aushöhlungen in dem Probenträger 10 gebildet.

Die Größe der Probenaufnahmekammern 12 wird man abhängig von der beabsichtigten Anwendung des betreffenden Probenträgers 10 wählen. So kann das Volumen jeder Probenaufnahmekammer 12 beispielsweise zwischen 100 fl und 100 µl liegen. Entsprechend groß ist der Bereich der pro Flächeneinheit des Probenträgers 10 unterzubringenden Probenauf­ nahmekammern 12. Pro cm² des Probenträgers 10 können dabei ohne weiteres zwischen 100 und 100 000 Probenaufnahmekammern 12 unter­ gebracht sein. Der Probenträger 10 kann beispielsweise aus einem Folien­ material hergestellt sein. Er kann aber auch als Plattenteil ausgebildet sein.

Im Rahmen einer Reihenuntersuchung von Messproben verschiedener Patienten kann beispielsweise für jeden Patienten je eine Spalte der Ma­ trix von Probenaufnahmekammern 12 reserviert werden. Die in die Pro­ benaufnahmekammern 12 eingefüllten Messproben werden dann zeilen­ weise mit unterschiedlichen Testlösungen gemischt. Jede Testlösung enthält dabei unterschiedliche analytspezifische Reagenzien, die mit fluo­ reszierenden Farbstoffen markiert sind. Von Zeile zu Zeile können so unterschiedliche Analyten nachgewiesen werden.

Zur fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung der Messproben dient die in Fig. 2 gezeigte Messanordnung. Diese Umfasst eine allgemein mit 14 bezeichnete Mikroskopanordnung mit einer Laserquelle 16, einer Optik 18, einem dichroitischen Spiegel 20, einem Photonendetektor 22 und einer Auswerteeinheit 24. Der von der Laserquelle 16 bereitgestellte Laserstrahl wird über den Spiegel 20 in die Optik 18 eingespeist und von dieser auf ein bei 26 angedeutetes kleines Volumenelement innerhalb des Volumens der in die betreffende Probenaufnahmekammer 12 eingefüllten Messprobe fokussiert. Über die Optik 18 und ggf. eine nicht näher darge­ stellte Lochblende wird dieses Volumenelement 26 konfokal auf den Detektor 22 abgebildet. Der Laserstrahl regt die in dem Volumenelement 26 befindlichen (freien oder an die gesuchten Analyten gebundenen) Fluorophore zu Fluoreszenz an. Die dabei erzeugten Lichtimpulse werden vom Detektor 22 registriert und in der Auswerteeinheit 24 ausgewertet. Der Nachweis der gesuchten Analyten geschieht dabei bevorzugt über Auto- oder/und Kreuzkorrelationen der vom Detektor 22 gelieferten Fluo­ reszenzsignale.

Konfokale Mikroskopanordnungen dieser Art sind an sich bekannt. Bei­ spielhaft wird auf die EP 0 679 251 B1 verwiesen, der Einzelheiten eines solchen Mikroskops entnommen werden können. Es versteht sich, dass die Mikroskopanordnung 14 zur Erfassung verschiedener Fluoreszenzwel­ lenlängen auch zwei oder mehr Detektoren 22 aufweisen kann. Sie kann auch als Doppelmikroskop mit zwei beidseits des Probenträgers 10 an­ geordneten Optiken 18 ausgebildet sein, sofern der Probenträger 10 aus einem lichtdurchlässigen Material besteht. Ein solches Doppelmikroskop kann ebenfalls der EP 0 679 251 B1 entnommen werden.

Um die Konzentration der nachzuweisenden Analyten in dem Volumen­ element 26 zu erhöhen und dadurch die Messzeit zu verkürzen, wird die mit 28 bezeichnete Innenwand der betreffenden Probenaufnahmekammer 12 ganzflächig auf ein elektrostatisches Potential aufgeladen, das gleich­ sinnig (positiv oder negativ) zur elektrischen Ladung der gesuchten Ana­ lyten ist. DNA-Stränge beispielsweise sind im Regelfall negativ geladen; die Kammerinnenwand 28 wird in diesem Fall daher negativ geladen. Die infolge der Aufladung an die Kammerinnenwand 28 gebrachten elektri­ schen Ladungsträger üben Coulomb'sche Abstoßungskräfte auf alle gleichsinnig geladenen Moleküle und sonstigen Teilchen in der Messprobe und somit auch auf die gesuchten Analyten aus. Diese Abstoßungskräfte treiben die Analyten längs des in der Probenaufnahmekammer 12 herr­ schenden Potentialgradienten zu Bereichen niedrigeren elektrostatischen Potentials hin. In dem Bereich, der innerhalb des Messprobenvolumens das geringste elektrostatische Potential aufweist, sammeln sich die Ana­ lyten schließlich an. Einen besonders steilen Potentialgradienten und damit einen besonders effektiven und raschen Konzentrierungsvorgang erhält man, wenn sich an dem Ort, dessen elektrostatisches Potential innerhalb des Messprobenvolumens am geringsten ist, zugleich die vekto­ riell addierten Abstoßungskräfte, die von den über die Kammerinnenwand 28 verteilten Ladungsträgern ausgeübt werden, gegenseitig aufheben, an diesem Ort also ein Gleichgewicht der Coulomb'schen Kraft existiert.

Um zu erreichen, dass ein Punkt solchen Kraftgleichgewichts innerhalb der Probenaufnahmekammer 12 und vorzugsweise sogar innerhalb des Messprobenvolumens existiert, können die Probenaufnahmekammern 12 mit Hinterschnitt ausgeführt sein. Bei dieser Ausbildung werden die Pro­ benaufnahmekammern 12 von den mit 30 bezeichneten Randbereichen ihrer Öffnungen teilweise überragt oder überlappt, wie in Fig. 2 gut er­ kennbar ist. In diesen Randbereichen 30 gehen bei elektrostatischer Auf­ ladung der Kammerinnenwand 28 Abstoßungskräfte mit einer zum Boden der Probenaufnahmekammer 12 gerichteten Komponente aus, die den aus der Probenaufnahmekammer 12 heraus gerichteten Abstoßungskräf­ ten entgegenwirkt und so die Etablierung eines Kraftgleichgewichts inner­ halb der Probenaufnahmekammer 12 ermöglicht.

Zum Kammerboden gerichtete Kraftkomponenten können beispielsweise auch durch elektrostatische Aufladung eines Abdeckelements 32, vor­ zugsweise einer Abdeckfolie, erzeugt werden, mittels welchem die Öff­ nungen der Probenaufnahmekammern 12 abgedeckt werden können.

Falls innerhalb des Messprobenvolumens kein Punkt des Kraftgleichge­ wichts existiert (entweder weil ein solcher Punkt nur außerhalb des Messprobenvolumens existiert oder weil er überhaupt nicht existiert), so werden die Abstoßungskräfte für eine Konzentration der nachzuweisen­ den Analyten in einem Bereich nahe der Oberfläche der Messprobe sor­ gen. Aus diesem Grund ist es durchaus möglich, hinterschneidungsfreie Probenaufnahmekammern 12a zu verwenden, wie beispielshaft in Fig. 3 gezeigt ist. Gleiche Elemente wie in Fig. 2 sind dort mit gleichen Bezugs­ zeichen versehen, jedoch ergänzt um einen Kleinbuchstaben.

Die elektrostatische Aufladung der Kammerinnenwände 28 der Proben­ aufnahmekammern 12 kann beispielsweise mittels einer an eine Gleich­ spannungsquelle 34 angeschlossenen Elektrode 36 erfolgen, die in Kon­ takt mit dem Probenträger 10 gebracht wird. Falls der Probenträger 10 aus einem elektrisch leitfähigen Material gefertigt ist, kann die Elektrode 36 an irgendeiner Stelle mit dem Probenträger 10 kontaktiert werden. In diesem Fall könnten alle Probenaufnahmekammern 12 gleichzeitig ge­ meinsam geladen werden. Vorstellbar ist aber auch, dass der Proben­ träger 10 aus einem nichtleitenden Grundmaterial besteht, die Probenauf­ nahmekammern 12 jedoch innenseitig mit einem leitenden Material be­ schichtet sind. Auf diese Weise könnten die Probenaufnahmekammern 12 einzeln aufladbar sein.

Das auf Erdpotential bezogene elektrische Potential zur Aufladung der Kammerinnenwände 28 hängt von den Abmessungen der Probenaufnah­ mekammern 12 und von der Höhe des gewünschten Konzentrationsgra­ dienten der betreffenden Analyten in den Probeaufnahmekammern 12 ab. Der Bereich der zur Anwendung kommenden Potentialdifferenzen kann durchaus zwischen 10 V und 10 000 V liegen.

Claims (5)

1. Verfahren zur fluoreszenzspektroskopischen, insbesondere fluo­ reszenzkorrelationsspektroskopischen Untersuchung einer Mess­ probe, bei welchem Verfahren die Messprobe in eine in einem Probenträger (10) vertieft ausgebildete Probenaufnahmekammer (12) eingebracht wird, in der Messprobe enthaltene, elektrisch geladene Analyten elektrisch in einem innerhalb des Probenvolu­ mens liegenden Messvolumen (26) konzentriert werden und das Messvolumen (26) untersucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass zur Konzentrierung der Analyten in dem Messvolumen (26) die Begrenzungswände (28) der Proben­ aufnahmekammer (12) im Wesentlichen ganzflächig auf ein zur Ladung der Analyten gleichsinniges elektrostatisches Potential gebracht werden.

2. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Probenträger (10) mit mindestens einer vertieft in diesem ausgebildeten Probenaufnahmekammer (12) sowie Mittel (34, 36) zur im Wesentlichen ganzflächigen elektrostatischen Aufladung der Begrenzungswände (28) der Pro­ benaufnahmekammer (12).

3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufnahmekammer (12) hinterschnitten ist.

4. Einrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufnahmekammer (12a) hinterschneidungsfrei ist.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, dass der Probenträger (10) eine Vielzahl vorzugsweise matrixförmig angeordneter Probenaufnahmekammern (12) aufweist, deren Begrenzungswände (28) gemeinsam elektrostatisch aufladbar sind.