DE10083676B4 - Rekombinantes Enzym mit ausgezeichneter D-Aminosäureoxidaseaktivität sowie dessen Herstellung - Google Patents

Rekombinantes Enzym mit ausgezeichneter D-Aminosäureoxidaseaktivität sowie dessen Herstellung Download PDF

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Abstract

Rekombinantes Fusionsenzym, das von einem aus einem ein Bakterienhämoglobin kodierenden Gen und einem eine D-Aminosäureoxidase kodierenden Gen bestehenden rekombinanten Fusionsgen exprimiert werden kann.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Enzym mit einer verbesserten D-Aminosäureoxidaseaktivität. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine D-Aminosäureoxidase, die mit einem Bakterienhämoglobin fusioniert ist und eine ausgezeichnete Wirksamkeit bei der Umwandlung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure (Glutaryl-7ACA) im Bioreaktor aufweist. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solch eines rekombinanten Enzyms.
  • Mit einem globalen Anteil von 40% des Marktes sind halbsynthetische Cephalosporinantibiotika sicherer als andere Antibiotika und sind gegen verschiedenste Bakterien antibakteriell wirksam. Üblicherweise wird bei der chemischen Synthese von halbsynthetischen Cephalosporinantibiotika von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) ausgegangen, welche konventionell durch chemische Spaltung des Aminoadipylrests in 7-Stellung in Cephalosporin C, welches aus einem mikrobiell hergestellten Produkt isoliert wird, hergestellt wird.
  • Die chemischen Verfahren, darunter die Spaltung des Aminoadipylrests in 7-Stellung, führen zwangsweise aufgrund giftiger chemischer Reagentien zu Umweltverschmutzung und erfordern aufgrund der Tatsache, daß sie bei extrem niedrigen Temperaturen reagieren, eine enorme Energiemenge. Außerdem besteht international der Trend, das im Endprodukt verbleibende organische Lösungsmittel stark zu reduzieren. Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an der Entwicklung von Verfahren, die die chemischen Verfahren ohne Umweltverschmutzung und ohne daß die giftigen Lösungsmittel im Endprodukt verbleiben, ersetzen können.
  • Diesbezüglich sind biologische Verfahren von großem Interesse. Insbesondere zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure wurden Enzyme von Mikroorganismen genützt. Solche biologischen Verfahren, bei denen Enzyme von Mikroorganismen genützt werden, werden üblicherweise in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur durchgeführt und es sind daher bestimmte energietechnische Einrichtungen sowie Einrichtungen zur Abwasserreinigung erforderlich, wobei der Vorteil darin besteht, daß die Herstellungskosten von 7-Aminocephalosporansäure massiv gesenkt werden.
  • Die mikrobielle Umwandlung von Cephalosporin C in 7-Aminocephalosporansäure wird in zwei enzymatischen Schritten durchgeführt: Cephalosporin C wird durch die D-Aminosäureoxidase zu Glutaryl-7ACA oxidiert, und Glutaryl-7ACA wird an der Bindung zwischen dem Glutarylrest und dem 7-ACA-Rest durch die Glutaryl-7ACA-Acylase gespalten.
  • Bis jetzt wurden für die mikrobielle Umwandlung von Cephalosporin C die von Eukaryonten, darunter Trigonopsis variabilis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula glutinis und Fusarium solani gewonnenen D-Aminosäureoxidasen verwendet. Die D-Aminosäureoxidasen solcher Eukaryonten verwenden FAD als Coenzym. Während ihrer katalytischen Oxidation von Cephalosporin C werden daher ständig Sauerstoffatome als Elektronenakzeptor benötigt. Da Sauerstoff in Wasser äußerst schlecht löslich ist, muß dem Bioreaktor ständig eine ausreichende Sauerstoffmenge zugeführt werden, damit die D-Aminosäureoxidase wirken kann.
  • Bei den meisten Enzymreaktoren werden Träger verwendet, in denen Enzyme wiederverwendbar immobilisiert sind.
  • Werden jedoch die D-Aminooxidasen in Trägern immobilisiert, so erzielt man sehr schlechte Umwandlungsraten von Cephalosporin C, da Sauerstoffmoleküle nicht leicht in die Träger diffundieren können. Um dieses Problem zu lösen, wird der Sauerstoffpartialdruck in dem Bioreaktor erhöht. Aufgrund des erhöhten Sauerstoffdrucks muß der Bioreaktor jedoch speziell konstruiert werden, und außerdem ist er aufgrund des Verlusts großer Sauerstoffmengen wirtschaftlich ungünstig.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Zur vorliegenden Erfindung führte nun die intensive, umfassende Forschungsarbeit auf dem Gebiet der Biokonversion von Cephalosporin C, die vom Erfinder mit dem Ziel, wirksam Sauerstoff für immobilisierte D-Aminosäureoxidase bereitzustellen, wiederholt durchgeführt wurde, was zu dem Ergebnis führte, daß, wenn ein sauerstoffübertragendes Molekül gemeinsam mit der D-Aminosäureoxidase immobilisiert wurde, das Enzym ohne Mangel an Sauerstoffversorgung katalysiert werden konnte und daß das Bakterienhämoglobin ein wirksames sauerstoffübertragendes Molekül darstellte.
    •
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein rekombinantes Enzym bereitzustellen, das bei Anwendung in einem Bioreaktor zur Umwandlung von Cephalosporin in 7-Aminocephalosporansäure eine stabile und ausgezeichnete Aminosäureoxidaseaktivität aufweist.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Produktion solch eines rekombinanten Enzyms bereitzustellen.
  • Aufgrund der vorliegenden Erfindung konnten die genannten Aufgaben dadurch gelöst werden, daß man mittels einer Polymerasekettenreaktion ein Bakterienhämoglobin (Vitroscilla-Hämoglobin)-Gen mit einem D-Aminosäureoxidasegen fusionierte, wodurch man ein Fusionsgen erhielt, das Fusionsgen in einen Expressionsvektor insertierte, das Fusionsgen in E. coli exprimierte, das Fusionsenzym isolierte und das Fusionsenzym in einem Polyacrylamidträger zur Umwandlung von Cephalosporin C immobilisierte.
  • BESTE AUSBILDUNGSFORMEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • In der vorliegenden Erfindung wird ein Bakterienhämoglobingen, zum Beispiel das Vitreoscilla-Hämoglobin (im folgenden mit „VHb" bezeichnet)-Gen, mittels PCR mit einer D-Aminosäureoxidase (im folgenden mit „D-AAO" bezeichnet) fusioniert. Diesbezüglich wird ein DNA-Abschnitt in der 5'-terminalen Region des VHb-Gens als sense-Primer konstruiert, während ein DNA-Abschnitt in der 3'-terminalen Region des VHb-Gens als antisense-Primer verwendet wird, der mit einem Teil eines DNA-Abschnitts in der 5'-terminalen Region des D-AAO-Gens überlappt. Ebenso wird ein sense-Primer für die Amplifikation des D-AAO-Gens so konstruiert, daß ein Teil davon mit einem DNA-Abschnitt in der 3'-terminalen Region des VHb-Gens überlappt. Das VHb-Gen und das D-AAO-Gen werden mit entsprechenden Primer-Sätzen amplifiziert. Zur Fusion werden diese PCR-Produkte vermischt und mittels eines Primer-Satzes, der aus dem zur Amplifikation des VHb-Gens verwendeten sense-Primer und dem zur Amplifikation des D-AAO-Gens verwendeten antisense-Primer besteht, reamplifiziert. Es können jedoch auch das VHb-Gen und das D-AAO-Gen vermischt und ohne Verwendung von Primern auf die Art und Weise, wie dies beim „DNA-Shuffling" geschieht, mittels PCR fusioniert werden.
  • Als nächstes wird das VHb-DAAO-Fusionsgen in einen Expressionsvektor eingeführt und exprimiert.
  • Die katalytische Aktivität des rekombinanten Enzyms läßt sich durch Nachweisen der H2O2-Menge, die während der Umwandlung von Cephalosporin C in 7-Aminocephalo sporansäure als Nebenprodukt anfällt, luminometrisch nachweisen.
  • In Weiterführung der Forschungsarbeit der vorliegenden Erfindung wurde der Vektor pUC8:16, der ein VHb-Gen trägt, von Professor Benjamin C. Stark, Illinois Institute of Technology, bezogen. Nach Entfernung seines eigenen Promoters wurde der Vektor an der VHb-Genregion unter Bezugnahme auf die angegebene Gensequenz amplifiziert (Khosla und Bailey, 1988, Mol. Gen. Genet, 214: 158–161; Dikshit und Webster, 1988; Gene 70: 377–386).
  • Das D-AAA-Gen, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, stammte aus Trigonopsis variabilis oder Rhodotorula gracilis. Diese Mikroorganismen stammten von der American Type Culture Collection; Trigonopsis variabilis ATCC10679 und Rhodotorula gracilis ATCC26217. Von jedem dieser Mikroorganismen wurde genomische DNA isoliert und als Substrat für die Amplifikation eines D-AAO-Gens verwendet (cDNA). Zur Klonierung und Expression des D-AAO-Gens verwendete man die im Handel erhältlichen Vektoren pALTER-EX2 (Promega, USA) und pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Schweden). Die PCR-Mischungen für die Amplifikation der interessierenden Gene sind in Tabelle 1 unten angegeben.
  • TABELLE 1 Zusammensetzung der PCR-Mischung
    Figure 00050001
  • Die PCR wurde in einem Thermocycler, wie zum Beispiel dem von EquiBio, Belgien, der unter der Bezeichnung „ThermoJet" bekannt ist, durchgeführt und zwar mit 35 Zyklen folgender Art: 1 Minute bei einer Denaturierungstemperatur von 94°C, 1 Minute bei einer Anlagerungstemperatur von 55°C sowie 1 Minute bei einer Elongationstemperatur von 72°C und schließlich weitere 4 Minuten Elongation bei 74°C.
  • Unter Ausnutzung des als Nebenprodukt während der Biokonversion von Cephalosporin C produzierten H2O2 beruht die in der vorliegenden Erfindung verwendete luminometrische Messung der D-AAO-Aktivität auf den folgenden chemischen Reaktionsformeln: D-AAO + Cephalosporin C + H2O2 + O2 → AKA-7ACA + NH3 + H2O2 H2O2 + 2OH– + Luminol + Peroxidase → 4-Aminophthalat + N2 + 2H2O + Licht
  • Mit dieser Analysemethode läßt sich die Aktivität des rekombinanten Enzyms der vorliegenden Erfindung sehr rasch und genau bestimmen.
  • Zur Analyse des rekombinanten Enzyms wird der erfindungsgemäße rekombinante Vektor in E. coli eingebracht, welches anschließend in LB-Bouillon gezüchtet wird. Die gezüchteten Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7) gewaschen und zu einer Lösung, die 20 mM Cephalosporin C, 2 mM Luminol, 1 Einheit Peroxidase sowie 5 μM FAD enthält, gegeben. Mit einem Luminometer (Tuner-Design, USA) wird die im Verlauf von 20 Sekunden emittierte Lichtmenge gemessen. Hieraus wird unter Verwendung einer Standardkurve die H2O2-Menge bestimmt.
    •
  • BEISPIEL 1
  • Fusion des VHb-Gens und des D-AAO-Gens mittels PCR
  • Zur Amplifikation eines VHb-Gens wurde ein DNA-Abschnitt in der 5'-terminalen Region des VHb-Gens als sense-Primer konstruiert, während ein DNA-Abschnitt in der 3'-terminalen Region des VHb-Gens als antisense-Primer verwendet wurde, der so konstruiert wurde, daß ein Teil mit einem DNA-Abschnitt in der 5'-terminalen Region des D-AAO-Gens überlappte. Auf ähnliche Weise wurde ein sense-Primer für die Amplifikation des D-AAO-Gens so konstruiert, daß ein Teil mit einem DNA-Abschnitt in der 3'-terminalen Region des VHb-Gens überlappte.
  • Die so amplifizierten DNA-Fragmente wurden gereinigt und miteinander vermischt. In Kombination mit dem zur Amplifikation des VHb-Gens verwendeten sense-Primer und dem zur Amplifikation des D-AAO-Gens verwendeten antisense-Primer wurde mit der amplifizierten Genmischung eine PCR mit 35 folgendermaßen lautenden Zyklen durchgeführt: 1 Minute bei einer Denaturierungstemperatur von 94°C, 1 Minute bei einer Anlagerungstemperatur von 55°C sowie 1 Minute bei einer Elongationstemperatur von 72°C, und schließlich weitere 4 Minuten Elongation bei 74°C. Die bei dieser Fusion verwendete PCR-Zusammensetzung ist in Tabelle 2 unten angegeben.
  • TABELLE 2 Zusammensetzung der PCR-Mischung für die VHb-DAAO-Genfusion
    Figure 00070001
  • BEISPIEL 2
  • Fusion des VHb-Gens und des D-AAO-Gens durch „DNA-Shuffling"
  • Die in Beispiel 1 amplifizierten VHb- und D-AAO-DNA-Fragmente wurden gereinigt und miteinander vermischt. Die Mischung wurde ohne Primer einer PCR unterzogen. Die PCR wurde mit 35 folgendermaßen lautenden Zyklen durchgeführt: 1 Minute bei einer Denaturierungstemperatur von 94°C, 1 Minute bei einer Anlagerungstemperatur von 55°C sowie 1 Minute bei einer Elongationstemperatur von 72°C, und schließlich weitere 4 Minuten Elongation bei 74°C. Die bei dieser Fusion verwendete PCR-Zusammensetzung ist in Tabelle 3 unten angegeben.
  • TABELLE 3 Zusammensetzung der PCR-Mischung für die VHb-DAAO-Genfusion
    Figure 00080001
  • BEISPIEL 3
  • Klonierung des VHb-DAAO-Fusionsgens
  • Zur Herstellung von stumpfen Enden wurden die in Beispiel 1 und 2 amplifizierten VHb-DAAO-Fusions-DNA-Fragmente 30 Minuten bei 25°C mit Klenow-Enzym behandelt, und zwar in einer Klenow-Mischung, die 4 Einheiten Klenow-Fragment, 3 μl dNTP (2,5 mM) sowie 3 μl 10x Puffer enthielt. Die stumpfendigen Fusions-DNA-Fragmente wurden durch Ethanolfällung gereinigt und jeweils in Expressionsvektoren subkloniert.
  • Zur Subklonierung wurden pALTER-Ex2 und pKK223-3 an der StuI- bzw. SmaI-Stelle linearisiert und mit alkalischer Phosphatase entphosphoryliert, worauf man 1 Stunde bei 16°C mit dem Fusionsgenfragment sowie T4-DNA-Ligase inkubierte.
  • BEISPIEL 4
  • Biokonversion von Cephalosporin C im Festbett-Bioreaktor
  • E. coli wurde mit den in Beispiel 3 konstruierten Vektoren transformiert und über Nacht in LB-Bouillon gezüchtet, wodurch man zu Zellextrakten gelangte. Diese Zellextrakte wurden mit Ammoniumsulfat gefällt und dialysiert, worauf man die Dialysate über Anionenaustauscherharze (DEAE- Sephadex FF) gab, um D-AAO und VHb-DAAO aufzureinigen. Diese auf gereinigten Enzyme wurden in Polyacrylamid-Trägern immobilisiert, welche anschließend in Würfel (1,5 × 1,5 × 1,5 mm) geschnitten und in Festbett-Bioreaktoren (Durchmesser 1,5 cm, Länge 15 cm) gegeben wurden.
  • 20 mM Cephalosporin C in Tris-HCl-Puffer (pH 8) wurde mit einer Schlauchquetschpumpe bei einer Durchflußrate von 1,5 ml/min durch Festbett-Bioreaktoren zirkulieren gelassen, während den Batch-Typ-Kesseln ständig Sauerstoff zugeführt wurde. In regelmäßigen Abständen wurden Proben aus den Fermentern gezogen, und das aufgrund der Biokonversion von Cephalosporin C produzierte H2O2 wurde quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt. Wie in Tabelle 4 angegeben, wurde in dem Fermenter mit immobilisierter D-AAO kaum H2O2 als Nebenprodukt produziert, da aufgrund des Widerstands des Trägers gegen die Diffusion von Sauerstoff ein Sauerstoffmangel vorlag, während der Fermenter mit dem immobilisierten VHb-DAAO-Fusionsenzym innerhalb von 45 Minuten die Produktion von H2O2 in der 12fachen Menge wie bei dem Fermenter mit immobilisierter D-AAO ermöglichte. Das erfindungsgemäße VHb-DAAO-Fusionsenzym konnte daher Cephalosporin C wirksam umwandeln, ohne den Sauerstoffpartialdruck im Fermenter zu erhöhen.
  • Das neue rekombinante E. coli, das mit einem das erfindungsgemäße VHb-DAAO-Fusionsgen tragenden rekombinanten Vektor pALTER-Ex2 transformiert worden war, wurde bei der Korean Collection for Type Culture am Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) am 18. Januar 1999 unter der Hinterlegungsnr. KCTC 8923P hinterlegt.
  • TABELLE 4 Konversionsfähigkeit von rekombinanten D-Aminosäureoxidasen in bezug auf die H2O2-Produktion
    Figure 00100001
  • GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
  • Wie in den Beispielen oben erläutert, läßt sich das rekombinante Enzym VHb-DAAO aus dem neuen rekombinanten E. coli erhalten, welches ein Fusionsgen aus einem Vitreoscilla-Hämoglobingen und einer D-Aminosäureoxidase birgt, und in einem Bioreaktor anwenden, der Cephalosporin C im Industriemaßstab in Glutaryl-7ACA umwandeln kann.
  • ANGABEN ZU DEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS UND ANDEREN BIOLOGISCHEN MATERIALIEN
    Figure 00110001

Claims (5)

  1. Rekombinantes Fusionsenzym, das von einem aus einem ein Bakterienhämoglobin kodierenden Gen und einem eine D-Aminosäureoxidase kodierenden Gen bestehenden rekombinanten Fusionsgen exprimiert werden kann.
  2. Rekombinantes Bakterienhämoglobin-D-Aminosäureoxidase-Fusionsenzym nach Anspruch 1, wobei das Bakterienhämoglobin eine Vitreoscilla-Hämoglobinpeptidsequenz in ihrer ganzen oder teilweisen Länge oder deren funktionell analoge Peptidsequenz enthält.
  3. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten VHb-DAAO-Fusionsenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man mittels einer Polymerasekettenreaktion ein Bakterienhämoglobingen und ein D-Aminosäureoxidasegen miteinander fusioniert, wodurch man ein Fusionsgen erhält, das Fusionsgen in einen Expressionsvektor insertiert, das Fusionsgen in E. coli exprimiert und das fusionierte VHb-DAAO-Enzym isoliert.
  4. Rekombinanter Vektor pALTER-EX2/VHb-DAAO, der durch Einführen eines aus einem Bakterienhämoglobingen und einem D-Aminosäureoxidasegen bestehenden Fusionsgens konstruiert wird.
  5. Rekombinantes E. coli (KCTC 8923P), welches mit dem rekombinanten Vektor pALTER-EX2/VHb-DAAO nach Anspruch 4 transformiert ist.
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