DE10063983A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von Zuckerkonzentrationen - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von ZuckerkonzentrationenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Zucker, wobei sich die Zuckermoleküle in Lösung befinden und durch eine Meßanordnung detektiert werden. Die Meßanordnung besteht aus einem zuckersensitiven Element, welches sich in direktem Kontakt mit der Lösung befindet, einem Element zur Signalübertragung vom Element zum Nachweissystem, welches wiederum eine Meßtechnik zur Anregung und Erfassung von Fluoreszenzsignalen, die mit den Zuckerkonzentrationen korrelieren, enthält.
Description
Die Beschreibung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von
Zuckerkonzentrationen gemäß dem Anspruch 1.
Die Erfindung bezieht sich auf eine Meßanordnung zum Nachweis von Zuckern basierend auf
einer zuckersensitiven Matrix und einer Fluoreszenzmeßtechnik. Die sensitive Matrix bildet
einen optochemischen Sensor zur Bestimmung einer Analytengruppe, insbesondere von
Zuckern. Darüber hinaus umfaßt die Erfindung eine Einheit zur Anregung und Detektion von
Fluoreszenzsignalen, die innerhalb der sensitiven Matrix induziert werden, sowie ein Über
tragersystem für die Anregungsstrahlung zur Matrix hin und die Signalstrahlung von der
Matrix zurück. Insbesondere kann das Übertragersystem durch eine Lichtleitfaser gebildet
werden. Ebenso kann die sensitive Matrix fest mit diesem Lichtwellenleiter verbunden sein.
Als wesentliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik sind insbesondere die
Zuckerdetektion ohne Verbrauch der gelösten Zuckermoleküle, ohne Probennahme und ohne
Bypaß selbst zu nennen sowie die hohe Empfindlichkeit und schnelle Ansprechzeit der
Methode.
Glucosekonzentrationen werden in der Biotechnologie und in der Lebensmitteltechnologie
meist in wäßrigen Medien bestimmt. Vor allem aber wird die Glucosebestimmung in der
Medizin zum Nachweis und der Kontrolle von Diabetes mellitus eingesetzt. Viele der zu
untersuchenden Medien sind optisch heterogen, d. h. daß eintretendes Licht gestreut wird.
Insbesondere in Zellkulturen sind lebende Zellen enthalten, an denen Primärstrahlung
mehrfach gestreut werden kann. Messungen für die Kontrolle von Zuckerkrankheiten werden
fast ausschließlich an Blut durchgeführt. Im Blut sind aber auch Partikel enthalten, an denen
Licht mehrfach gestreut werden kann. Bei der Bestimmungen von Glucose in der
Lebensmitteltechnologie sind in den Proben meist Schwebestoffe enthalten, so z. B. in der
Getränkeindustrie.
Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der relevanten Stoffgröße werden in der
Regel Reagenziensysteme der analytischen Chemie eingesetzt. Diese Verfahren müssen off-
line durchgeführt werden und erfordern deshalb oft eine aufwendige Probenahme und eine
aufwendige Probenvorbereitung.
Es sind nichtinvasive Verfahren bekannt, bei denen die Glucosekonzentration mittels NIR-
Spektroskopie ermittelt wird. Dies ist ein Verfahren, daß sich auf Absorptionsmessungen
stützt. Zuckermoleküle, wie auch viele andere organische Verbindungen, zeigen im nahen und
fernen Infrarotbereich charakteristische Absorptionsbanden aufgrund von Molekül
schwingungen und -rotationen. Die Proben werden durchstrahlt, oder aber es wird in
Rückstreu-Anordnung gemessen. Ein Empfänger detektiert und analysiert das gesamte
Signalspektrum in einem Wellenlängenbereich oder die Lichtintensität bei einigen diskreten
Wellenlängen. Aufgrund der relativ schwachen Absorptionsquerschnitte der Schwingungs
übergänge der Moleküle ist die Empfindlichkeit dieser Methode eingeschränkt. Die
Nachweisgrenzen in Bezug auf die Glukosedetektion liegt im Bereich von 1 bis 10 mM.
Hierzu sind einige Patente bekannt WO 9531930, WO 9522046 usw.
Weiterhin werden bei der Bestimmung von Blutzucker nichtinvasive Verfahren eingesetzt,
die auf der Änderung des Brechungsindexes beruhen (z. B. EP 726729). Auch hierfür gilt eine
ähnliche Empfindlichkeitsgrenze. An dieser Stelle sei angemerkt, daß für Messungen der
Blutzuckerkonzentration die erwähnten Empfindlichkeiten in de Regel ausreichend sind, da
im Blut hinreichend hohe Glucosekonzentrationen vorliegen.
Hinzugefügt sei, daß aufgrund der von Tag zu Tag variierenden Probenzusammensetzung die
Signalstärke stark schwanken kann und vor jeder Glucosebestimmung Referenzmessungen
durchgeführt werden sollten.
Sensitive Schichten, die Farbstoffe enthalten, deren Fluoreszenzspektrum sich bei Kontakt mit
einem Analyten (z. B. Gasen oder Metallionen) in charakteristischer Weise ändert, werden bei
optischen Sensoren vielfältig eingesetzt. Häufig werden sensitive Schichten in zwei Schritten
hergestellt. Im ersten Schritt wird der Indikatorfarbstoff an einem Träger immobilisiert und
im zweiten Schritte in einer zu einer Membran ausformbaren Matrix (z. B. Cellulose,
Polymere, Gläser) gebunden. Es ist jedoch auch möglich, beide Schritte zu kombinieren und
den Farbstoff direkt in der Matrix zu immobilisierten, wie es bei dem Sol-Gel-Verfahren der
Fall ist. Es sind Sensoren bekannt, die zur Bestimmung des pH-Wertes eingesetzt werden
[WO 93/07483]. Es sind Sensoren bekannt zum Nachweis von gasförmigem Ammoniak [DE 196 05 522 C2].
Es sind Sensoren bekannt für den Nachweis von Sauerstoff in flüssigen oder
gasförmigen Medien [4108808 A1].
Für den Nachweis von Glucose sind Sensoren bekannt, die darauf basieren, Enzyme, die
Glucose in einer chemischen Reaktion umsetzen, zu verwenden und die resultierenden
Reaktionseffekte als Meßgröße zu verwenden. [EP 0251475 A1] Als Enzym wird haupt
sächlich Glucoseoxidase eingesetzt. Denkbar sind auch Glucosedehydrogenasen. In diesen
Fällen wird der NADH Verbrauch gemessen. Bei den mikrobiellen Sensoren wird
hauptsächlich der Sauerstoffverbrauch gemessen.
In einem Spezialfall werden enzymchemisch modifizierte Elektroden und ionensensitive
Feldeffekttransistoren eingesetzt. Es ist eine Offenlegungsschrift (DE 39 23 950) bekannt, in
dem ein Sensor für den Glucosenachweis erwähnt ist. Hier besteht der Sensor aus einem
Lichtwellenleiter und einem Enzym, das in einer Membran immobilisiert ist.
Bei den entwickelten Sensoren für den enzymatischen Glucosenachweis altert das eingesetzte
Nachweismolekül, das glucosespezifische Enzym, d. h. es verschlechtert sich die Aktivität des
Enzyms. Daher haben alle enzymgestützten Sensoren die Gemeinsamkeit, daß die Enzyme
nur eine begrenzte Lebensdauer haben und bei den Messungen verbraucht werden. Die Stand
zeiten liegen für die enzymatisch basierenden Systeme bei wenigen Tagen. Zudem wird der
nachzuweisende Analyt, Zucker, verbraucht oder umgesetzt.
Um die Nachteile der erwähnten Sensorik auszuschließen, wird intensiv an zuckerspezi
fischen Lumineszenzfarbstoffen geforscht, welche die Enzyme im Glucosenachweis ablösen.
Diese Farbstoffe sind zum Teil in Patenten schutzrechtlich erfaßt. (US 5503770 und EP 729962).
In diesen Patenten werden ausschließlich die Farbstoffe als Substanz patentiert. Um Sensoren
herzustellen, sind darüber hinaus weitere Komponenten notwendig. Gegenstand der
Erfindung ein Verfahren zum Zuckernachweis unter Verwendung von zuckersensitiven
Farbstoffen als Nachweiskomponenten.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine sensitive Matrix und eine Meßanordnung
beschrieben, bei dem der zu untersuchende Analyt, in diesem Falle Zucker, nicht verbraucht
wird und mit dem kleinste Konzentrationsänderungen in einer Lösung detektiert werden
können.
Die sensitive Matrix beinhaltet eine Lumineszenzfarbstoff, der an einem Träger immobilisiert
ist. Der Lumineszenzfarbstoff dient als Rezeptor für die Erkennung von Zuckern, insbe
sondere von Glucose, und verändert seine Lumineszenzeigenschaften, insbesondere aber die
Lumineszenzintensität und/oder die Lumineszenzlebensdauer durch Wechselwirkung mit den
ihn umgebenden und in Lösung befindlichen Glukosemolekülen. Diese Veränderung seiner
Lumineszenzeigenschaften korreliert mit der Konzentration der Analytmoleküle. Da die
beschriebene Wechselwirkung reversibel ist, kann durch Detektion der Lumineszenz
änderungen eine Erfassung der Konzentration der Analytmoleküle ohne deren gleichzeitigen
Verbrauch erfolgen. Zu diesem Zwecke ist es erforderlich, die Lumineszenz der Matrix durch
Beleuchtung mit Licht geeigneter Wellenlänge anzuregen und mit einem geeigneten
Detektionssystem zu erfassen. Insbesondere soll das Detektionssystem in der Lage sein,
Änderungen der Lumineszenzlebensdauer zu erfassen, wenn dieser Parameter abhängig von
der Analytkonzentration ist. In diesem Fall kann die Selektivität der Korrelation des
Meßsignals mit der Analytkonzentration signifikant verbessert werden. Die
Lumineszenzdetektion kann im Gegensatz zu Absorptionsmessungen mit einer sehr viel
höheren Sensitivität erfolgen, so daß signifikant niedrigere Analytkonzentrationen detektiert
werden können.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels näher
dargestellt. Die zugehörigen Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 die schematische Darstellung eines konkreten Ausführungsbeispiels für die
Meßanordnung
Fig. 2 Fluoreszenzspektren des faseroptischen Glucosesensors in wäßrigem Medium
in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration
Fig. 3 Kalibrierkurve eines faseroptischen Glukosesensors
In dieser beispielhaften Ausführung der Erfindung besteht der Glucosesensor aus der
sensitiven Matrix, einem Lichtwellenleiter zur Übertragung von Anregungs- und
Lumineszenzstrahlung sowie einem zeitaufgelösten Lumineszenzdetektionssystem. Die
sensitive Matrix ist direkt auf dem Lichtwellenleiter aus Quarzglas immobilisiert. Sie kann in
anderen Ausführungsbeispielen aber auch von diesem abgesetzt sein. Der aktive
Lumineszenzfarbstoff muß zwingend eine Boronsäuregruppe enthalten und ist im
Ausführungsbeispiel N,N'-Dibenzyl-(o-borsäure)-N,N'dimethylpyrenyl-1,6-diaminohexan.
Als Träger wird eine Sol-Gel Matrix mit folgender Zusammensetzung verwendet:
200 µl TEMOS
200 µl oben benannter Lumineszenzfarbstoff Endkonzentration 1,5.10-5
200 µl oben benannter Lumineszenzfarbstoff Endkonzentration 1,5.10-5
mol/l
20 µl Wasser bidest.
50 µl Triton X-100
50 µl 0,1M Salzsäure
20 µl Wasser bidest.
50 µl Triton X-100
50 µl 0,1M Salzsäure
Zum Herstellen der sensitiven Schicht auf dem Lichtwellenleiter wird das Dip-coating
Verfahren eingesetzt. Die Ziehgeschwindigkeit der Faser wird zwischen 1 und 5 mm pro
Sekunde eingestellt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das gesintere Sol-Gel-Material fein zu zermahlen
und in Silikon mit USP-Klasse VI, das Zusätze von Toluol enthält, homogen zu vermischen.
Um kontrollierte Schichtdicken herzustellen, wird das erhaltene Silikongemisch gerakelt. Auf
diese Weise können Schichten mit einer Dickengenauigkeit von 20 µm hergestellt werden.
Aus den Schichten ausgestanzte Scheiben werden direkt auf den Lichtwellenleiter aufgeklebt.
Durch Wechselwirkung des boronsäurehaltigen Lumineszenzfarbstoffes mit den
Zuckermolekülen kommt es zu einer reversiblen Bindung der Zuckermoleküle an den
Farbstoff. Durch diese Bindung wird die Effizienz des intramolekularen Photoelektronen
transfers (PET) im Farbstoff, der nach Absorption von Lichtquanten geeigneter Wellenlänge
auftritt und die strahlungslose Deaktivierung der Anregungsenergie zur Folge hat,
herabgesetzt. Infolgedessen steigt die Lumineszenzintensität an. Dieser Effekt ist in
bestimmten Konzentrationsbereichen direkt der Analytkonzentation proportional.
Da der im Ausführungsbeispiel eingesetzte Lumineszenzfarbstoff im ultravioletten (uv)
Spektralbereich absorbiert, enthält die Meßanordnung einen gepulsten Stickstoff-Laser, der
bei 337,1 nm arbeitet. Die Laserimpulse, deren Impulsdauer je nach Lasermodell zwischen
0,3 und 5 ns variieren können, werden in die Lichtleitfaser, an welcher der
Lumineszenzfarbstoff immobilisiert ist, eingekoppelt und in der Matrix vom Farbstoff
absorbiert. Die induzierten Lumineszenzsignale werden partiell von derselben Lichtleitfaser
aufgenommen und zum Detektionssystem zurückgeführt. Das Detektionssystem besteht aus
einer Filteranordnung zur Selektion der Lumineszenzwellenlänge, einem schnellen
Photomultiplier als Detektor und einem getorten Integrator zur zeitaufgelösten
Signalerfassung. Durch diese Meßanordnung ist es möglich, zeitaufgelöste
Lumineszenzmessungen im Nanosekundenbereich durchzuführen. Außerdem entfällt die
Notwendigkeit, die zuckersensitive Matrix vor Raumlicht zu schützen, da Raumlichteinflüsse
als Gleichlichtsignale vom getorten Integrator nicht erfaßt werden und somit das Meßsignal
nicht beeinflussen. Das Ausgangssignal des getorten Integrators korreliert direkt mit der
Analytkonzentration und kann nach einer Digitalisierung von einem Computer verarbeitet
oder dargestellt werden.
1
Stickstoff-Laser
2
Sammellinse
3
Y-Faserkoppler
4
Lichtleitfaser
5
Probe
6
Glucosesensitive Matrix
7
Bandpaß/Kantenfilter
8
Photomultiplier
9
getorter Integrator
10
Computer mit Analog-Digital-Wandlung
Claims (23)
1. Verfahren zur Erfassung von Zuckerkonzentrationen in Lösungen oder
Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß eine zuckersensitive Matrix in direkten
Kontakt mit einer zuckerhaltigen Lösung gebracht wird, wobei in der Matrix ein
zuckersensitiver Lumineszenzfarbstoff immobilisiert ist, der als Rezeptor eine
Boronsäuregruppe enthält und an einen Träger gekoppelt sein kann, daß die Matrix mit
Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt wird und das von der Zuckerkonzentration
abhängige Lumineszenzsignal des Farbstoffes nach spektraler Filterung detektiert und
analysiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoff um N,N'-Dibenzyl-(o-borsäure)-
N,N'dimethylpyrenyl-1,6-diaminohexan handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoff um einen Vertreter aus der Gruppe der so
bezeichneten Farbstoffe handelt:
x = 1, 2 oder 3
R1 = Alkan und R2, R3 = identische Aromate, oder
R1 = Aromat und R2, R3 = identische Alkane.
x = 1, 2 oder 3
R1 = Alkan und R2, R3 = identische Aromate, oder
R1 = Aromat und R2, R3 = identische Alkane.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung des
zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes an dem Träger Cellulose erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung des
zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes an quaternären Ammoniumionen erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung des
zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes an planaren oder kugelförmigen Polymerträgern,
wie Polymethylmethacrylat, Polystyren oder Polyvinylchlorid erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung des
zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes an Glassubstraten erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kopplung oder Kopplung
und Immobilisierung nach dem Sol-Gel-Verfahren erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung des
gekoppelten zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes in einer Matrix aus Cellulose,
Nitrocellulose oder Celluloseacetat erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung des
gekoppelten zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes in einer Matrix aus Silikon oder
Silikongemischen erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung des
gekoppelten zuckersensitiven Lumineszenzfarbstoffes in einer Matrix aus Polymeren
erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die zuckersensitive Matrix
mit einer Antifouling-Schicht überzogen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die zuckersensitive Matrix
direkt auf einem Lichtwellenleiter aufgebracht ist oder in dem Behältnis des
zuckerhaltigen Mediums eingebracht ist und dort mit einem geeigneten Sensor detektiert
wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Lumineszenz
um Fluoreszenz handelt.
15. Verfahren nach Anspruch 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz mit einem
Laser, insbesondere mit einem Stickstofflaser bei 337,1 nm oder mit einer
Stickstofflaser/Farbstofflaser-Kombination angeregt und das induzierte Fluoreszenzsignal
bei einer festgelegten Wellenlänge mit einer getorten Integratorschaltung in einem kurzen
Nanosekunden-Zeittor mit einer festen Zeitverzögerung in Bezug auf den Laserimpuls
detektiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzsignal mit
zwei unterschiedlich positionierten Zeittoren detektiert wird und das Verhältnis der
Torintegrale ein Maß für eine mit der Analytkonzentration korrelierende
Fluoreszenzlebensdauer ist.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Lumineszenzfarbstoff
mindestens drei Fluoreszenzmaxima aufweist, wobei mindestens eine Bande einem
Excimer oder einem Exciplex zugeordnet werden kann und das Verhältnis der Intensitäten
der Banden, separat gemessen bei mindestens drei festen Emissionswellenlängen, mit der
Analytkonzentration korreliert.
18. Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß durch
Verwendung der zeitlich getorten Meßanordnung Gleichlichtanteile, etwa aus Raumlicht-
oder Tageslichtquellen, das Meßsignal nicht beeinflussen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der, die Analytlösung
enthaltende, Probenraum nicht abgedunkelt werden muß.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix nicht durch eine
lichtundurchlässige S4chicht gegen die Durchdringung durch Gleichlicht geschützt werden
muß.
21. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Anregungslichtquelle
andere gepulste oder nichtgepulste Laser im Spektralbereich von 266 bis 532 nm
eingesetzt werden.
22. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Anregungslichtquelle
LED, insbesondere LED mit Emissionsmaxima zwischen 370 und 550 nm, eingesetzt
werden.
23. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Anregungslichtquelle
spektral gefilterte Halogen, Quecksilber, Xenon oder Deuterium-Lampen eingesetzt
werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000163983 DE10063983A1 (de) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von Zuckerkonzentrationen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000163983 DE10063983A1 (de) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von Zuckerkonzentrationen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10063983A1 true DE10063983A1 (de) | 2002-07-04 |
Family
ID=7668276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000163983 Ceased DE10063983A1 (de) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von Zuckerkonzentrationen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10063983A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008019448A1 (en) * | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Macquarie University | Time gated fluorescent flow cytometer |
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|---|---|---|---|---|
| DE3923950A1 (de) * | 1989-07-19 | 1991-01-31 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Faseroptische sensoranordnung zur bestimmung eines analyts, insbesondere von glucose |
| US5503770A (en) * | 1993-11-07 | 1996-04-02 | Research Development Corporation Of Japan | Fluorescent compound suitable for use in the detection of saccharides |
| EP0729962A1 (de) * | 1995-03-03 | 1996-09-04 | Research Development Corporation Of Japan | Borsäure-Verbindungen mit einer Binaphthyl-Gruppe |
| WO1997019188A1 (en) * | 1995-11-22 | 1997-05-29 | Minimed, Inc. | Detection of biological molecules using chemical amplification and optical sensors |
| DE19605522A1 (de) * | 1996-02-15 | 1997-08-21 | Karlsruhe Forschzent | Sensitive Schicht für einen optochemischen Sensor |
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-
2000
- 2000-12-14 DE DE2000163983 patent/DE10063983A1/de not_active Ceased
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