DE10054351A1 - Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und Impedanzmessung - Google Patents

Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung von biomolekularen Wechselwirkungen mittels Oberflächenplasmonresonanz und Impedanzmessung

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Bindung des Analyten an eine Festphase durch unabhängige Auswertung der Signale aus einer Oberflächenplasmonresonanz- und Impedanzmessung bestimmt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, wobei man zum Nachweis einer Kombination von Oberflächenplasmonresonanz- und Impedanzmessungen durchführt, so wie je eine Vorrichtung welche zur Durchführung dieses Verfahrens geeignet ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können zum Beispiel biomolekulare Wechselwirkungen, Reaktionskinetiken und Adsorptionsvorgänge untersucht werden, aber auch Analyten qualitativ oder/und quantitativ bestimmt werden. Als Festphase wird für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt ein optisch durchlässiger Träger, der mit einer Metall oder Metall/Metalloxidschicht überzogen ist, verwendet.
Der optisch durchlässige Träger beispielsweise aus Glas oder Quarzglas, kann hierzu zum Beispiel mit einer relativ duennen Metall oder Metall/Metalloxidschicht bedampft werden. Die Metall/Metalloxidschicht besteht dabei bevorzugt aus einer Metallschicht welche zuerst auf dem optisch durchlässigen Träger aufgedampft wird und einer Metalloxidschicht, welche anschließend auf die Metallschicht aufgebracht wird. Die Dicke der Schicht beträgt bevorzugt zwischen 10 nm und 100 nm. Falls der Träger mit einer Metallschicht bedampft wird, verwendet man bevorzugt Aluminum, Gold und Silber. Auch eine simultane Messung von Oberflächenplasmonresonanz und Fluoreszenzdetekion ist bekannt (Patenanmeldung EP 0 872 733 A1).
Impedanzmessungen können auf Metallschichten für Oberflächenplasmon­ resonanzmessungen oder auf einer hiervon separaten Metallschicht durchgeführt werden; in diesem Fall wird die Metallschicht mittels Bedämpfung durch eine Maske auf die Oberfläche aufgetragen.
Durch die Verwendung entsprechender Vorrichtungen und Detektion über Scanner oder CCD-Kameras kann das Verfahren als Kombination von Oberflächemplasmonresonanzspektroskopie (Nature, 332 (1988) 615) und Impedanzmessungen mit Elektrodenarrays durchgeführt werden. Ein solches Verfahren ermöglicht auch die Analyse von Arraystrukturen, d. h. von mehreren nebeneinander angeordneten Reaktionsflächen auf der Festphase. Eine solche Arraystruktur kann zum simultanen Nachweis mehrerer Analyten in einer Probe oder/und zur simultanen Bestimmung mehrerer Proben eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Nachweis eines an eine Festphase gebundenen Analyten, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Mittel zur Messung der Oberflächenplasmonresonanz und der Elektrodenimpedanz und zur unabhängigen Auswertung der Signale aus der Oberflächenplasmonresonanz- und der Impedanzmessung umfasst. Bevorzugt umfasst eine solche Vorrichtung einen Laser als Lichtquelle, einen optisch durchlässigen Träger, der mit einer Metallschicht überzogen ist, als Festphase, eine Photodiode zur Detektion der Oberflächenplasmonresonanz und ein Impedanzanalysator, bevorzugt Generator und Lock-in-Verstärker zur Impedanzmessung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer solchen Vorrichtung zum Nachweis eines an einer Festphase gebundenen Analyten, zum Beispiel zur Durchführung von Immunoassays, Nukleinsäurehybridisierungsassays, Bindungsassays zum Hochdurchsatzscreening pharmakologisch wirksamer Substanzen und Einsatzzwecken in der Proteomik. Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen und die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Fig. 1 zeigt den experimentellen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2 zeigt die räumliche Struktur der Goldschicht zu gleichzeitigen Oberflächen­ plasmonresonanz- und Impedanzmessungen auf separaten Teilen der Schicht.
Fig. 3 zeigt die zeitabhängige Änderung der Kapazität (C) und des Oberflächen­ plasmonresonanzwinkels während des Bindungsvorgang des Rinder­ serumalbumin an die Goldoberfläche.
Der Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.
Der Teil der Vorrichtung für die SPR-Messungen besteht aus einer Laserdiode (λ = 670 nm) (1), einem Prisma (2), einem Goniometer (3), einer Photodiode (4), einem Generator (5), einem Stromverstärker (6), einem Lock-in-Verstärker (7), und einem durch einen Computer (12) gesteuerten Schrittmotor (8). Der Teil der Vorrichtung für Impedanzmessungen besteht aus einem Sinusgenerator (9), einem Spannungsgeber (8), einem Stromverstärker (10) und einem Lock-in-Verstärker (11). Die selektive Schicht auf dem goldbeschichtetem Prisma ist mit (13) bezeichnet. Für die Impedanzmessungen verwendet man eine Ag/AgCl-Elektrode (14). Entsprechende Hard- und Software (12) zur Steuerung und Auswertung der Messergebnisse ergänzen das Gerät. Der in Fig. 1 dargestellte Aufbau ermöglicht die simultane, zeitabhängige Messung der Resonanzwinkel und der Impedanz.
Fig. 2 zeigt die räumliche Struktur der Goldschicht zu gleichzeitigen Oberflächen­ plasmonresonanz- und Impedanzmessungen auf separaten Teilen der Schicht. Die Fläche (2) mit dem Anschluß (5) wird für die SPR-Messungen verwendet, die Flächen (3) mit Anschlüssen (4) für Impedanzmessungen. Der Anschluß (5) kann dafür hergenommen werden, um ein definiertes Potential auf der Goldoberfläche für die SPR-Messungen zu halten. Um die Impedanzmessungen nicht zu beeinflussen kann man Anschluß (5) durch einen großen Wiederstand mit Anschluß (4) verbinden.
Fig. 3 zeigt die zeitabhängige Änderung der Kapazität (C) und des Oberflächen­ plasmonresonanzwinkels während des Bindungsvorgang des Rinder-serumalbumin an die Goldoberfläche. Experimentelle Bedingungen: Referenzelektrode: Ag/AgCl, Elektrolyt 5 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7,4, 22°C. Konzentration der Protein: 200 µg/mL.
Beispiel 1 Herstellung der Reagenzträger
Ein Glasträger mit Brechungsindex 1,61, einer Fläche von 22 mm × 22 mm und einer Dicke von 1 mm wird in eine heiße 3 : 1 (v/v) Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30%iger Wasserstoffperoxidlösung für 5 Minuten eingetaucht, gründlich mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet.
Schließlich wird in einer Hochvakuum-Beschichtungsanlage eine 5 nm dicke Chromschicht und eine 45 nm dicke Goldschicht durch eine spezielle Maske (Fig. 2) aufgedampft. Die größere Fläche der Goldschicht (Fig. 2) wird für Oberflächen­ plasmonresonanzmessungen benutzt, die kleinere für Impedanzmessungen. Oberflächenplasmonresonanzmessungen werden mittels Oberflächenplasmon­ resonanzspektrometern BIOSUPLAR-2 (Firma Analytical µ-Systems, Regensburg) durchgeführt. Impedanzmessungen werden mit Lock-in-Verstärker (EG & G PAR, Model 5209, USA) und dessen Generator durchgeführt.
Beispiel 2 Messung der Adsorption des Rinberseralbumin
Die zeitabhängige Änderung der Kapazität (C) und des Oberflächenplasmonresonanzwinkels während des Bindungsvorgang des Rinderserumalbumin an die Goldoberfläche sind in Bild 3 dargestellt. Die Kurven wurden für maximale Werte normalisiert. Experimentelle Bedingungen: Referenzelektrode: Ag/AgCl, Elektrolyt 5 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7,4, 22°C. Konzentration der Protein: 200 µg/mL.

Claims (16)

1. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung des Analyten an eine Festphase durch unabhängige Auswertung der Signale aus einer Plasmonenresonanz- und einer Impedanzmessung erhält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen optisch durchlässigen Träger, der mit einer Metall- oder Metall/Metalloxidschicht überzogen ist, als Festphase verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger verwendet, der mit einer Metallschicht überzogen ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger verwendet, der mit einer Silber-, Aluminium- oder Goldschicht überzogen ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt über eine Festphasenbindematrix mit der Festphase verknüpft wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenbindematrix eine selbstassemblierende Monoschicht umfaßt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lichtquelle für die Oberflächenplasmonenresonanz einen Laser einsetzt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messzelle zwei oder mehr Elektroden für Impedanzmessungen besitzt. Das Messystem enthält elektronische Komponenten für die Impedanzanalyse.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung die Signale aus einer Plasmonenresonanzmikroskopie- und einer Impedanzmessung verwendet werden.
10. Vorrichtung zum Nachweis eines an eine Festphase gebundenen Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung Mittel zur Messung der Oberflächenplasmonenresonanz und der Impedanz und zur unabhängigen Auswertung der Signale aus der Plasmonenresonanz- und der Impedanzmessung umfaßt.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Laser als Lichtquelle, einen Polarisator, einen optisch durchlässigen Träger, der mit einer Metall- und Metall/Metalloxidschicht überzogen ist, als Festphase, eine Photodiode zur Detektion der Plasmonenresonanz und mindestens zwei Elektroden für die Messung der Impedanz umfasst.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel zur Durchführung einer Oberflächenplasmonenresonanzmikroskopie- und einer Impedanzmessung und zur unabhängigen Auswertung der Signale aus der Oberflächenplasmonenresonanzmikroskopie- und der Impedanzmessung umfaßt.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Messzelle auch eine oder mehrere der folgenden Komponenten umfasst:
Komponenten für Fluoreszenzmessungen
Elektroden für amperometrische Messungen
Elektroden für potenziometrische Messungen
Thermosensoren
ionenselektive Elektroden
Sensoren auf Basis oberflächenakkustischer Wellen
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase einen Träger umfaßt, welcher flächig mit einer Metall- oder Metall/Metalloxidschicht überzogen ist, auf der mehrere räumlich definierte Reagenzspots angeordnet sind, die unterschiedliche Festphasenreaktanten oder/und einen Festphasenreaktanten in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.
15. Anordnung welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einer Vielzahl eng bei einander liegender Vorrichtungen nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 14 besteht.
16. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 zum Nachweis eines oder mehreren an eine Festphase gebundenen Analyten.
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