DE10036159A1 - Mikrotiterplatten mit Begasung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen, welche eine Einrichtung mit mindestens einer Veriefung zur Aufnahme einer Kulturlösung umfaßt, sowie Mittel zum Zuführen von Gas in die Vertiefung. Das Mittel zum Zuführen von Gas ist derart ausgestaltet, daß es das Gas in der Nähe des Bodens der Vertiefung abgibt, so daß das Gas im wesentlichen die gesamte Lösung durchströmen kann. Die Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen ist vorzugsweise eine Mikrotiterplatte und das Mittel zum Zuführen von Gas ein Rohr mit der Vertiefung entsprechend angepaßten Abmessungen. Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zum Züchten der Zellen sowie die Verwendung der Vorrichtung zu dem angegebenen Zweck.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen, welche eine Einrichtung mit mindestens einer Vertiefung zur Aufnahme einer Kulturlösung umfaßt, sowie Mittel zum Zuführen von Gas in die Vertiefung. Das Mittel zum Zuführen von Gas ist derart ausgestaltet, daß es das Gas in der Nähe des Bodens der Vertiefung abgibt, so daß das Gas im wesentlichen die gesamte Lösung durchströmen kann. Die Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen ist vorzugsweise eine Mikrotiterplatte und das Mittel zum Zuführen von Gas ein Rohr mit der Vertiefung entsprechend angepaßten Abmessungen. Die Erfindung betrifft zu­ dem ein Verfahren zum Züchten der Zellen sowie die Verwendung der Vorrichtung zu dem an­ gegeben Zweck.

Zum Züchten von Zellen bzw. Mikroorganismen, wie Prokaryonten oder auch Eukaryonten, werden diese im Allgemeinen in einem Behälter inkubiert, der in einer eine kreisförmige Bewegung beschreibenden Vorrichtung (gewöhnlich als Kreisschüttler bezeichnet) eingespannt ist. Durch die Bewegung wird die Kulturlösung mit über der Kulturlösung befindlicher Luft vermischt, so daß das Wachstum der Zellen hinsichtlich der Versorgung mit Sauerstoff optimiert werden kann. In einigen Behältern sind zusätzlich Stege am Boden vorgesehen, die eine weitere Turbulenz in der Nährlösung und somit eine verbesserte Durchmischung mit der eingebrachten Luft bewirken. In einer anderen Ausgestaltung werden die Zellen in Rollbehältern inkubiert, wobei hier durch den Rollvorgang eine Vermischung der Nährlösung mit Umgebungsluft erreicht wird. Derartige Inkubationsvorrichtungen eignen sich jedoch nur für die Züchtung von Zellen/Mikroorganismen im großen Maßstab.

Bei Inkubation einer Vielzahl, ggf. verschiedener Zellen im kleinen Maßstab werden derzeit sogenannte Mikrotiterplatten eingesetzt. Mikrotiterplatten werden generell aus einem durch­ sichtigen Kunststoff hergestellt und weisen eine Vielzahl von Vertiefungen mit kleinen Volumina auf, so daß eine Züchtung von Zellen/Mikroorganismen auf kleinem Raum ermöglicht wird. Da bei einer Inkubation mittels Mikrotiterplatten die erreichbaren Zelldichten mit und ohne Schütteln nur geringfügig divergieren werden diese generell ohne Schüttelprozess inkubiert, so daß auch die durch die räumliche Nähe der jeweiligen Vertiefungen in den Mikrotiterplatten auftretenden Gefahr einer Vermischung bzw. Kontamination mit in benachbarten Vertiefungen befindlichem Zellmaterial vermieden wird.

Im wesentlichen kritische Punkte für die Erreichbarkeit bestimmter Zelldichten bei einer Inkubation in Mikrotiterplatten sind der Nährstoffgehalt des Kulturmediums, die Produktion Wachtsum-inhibitorischer Stoffwechselprodukte, die Sauerstoffzufuhr und der Packungsgrad der Zellen am Boden der Vertiefungen. Die größten dabei auftretenden Probleme sind die nur unzureichende Sauerstoffzufuhr für aerobe Organismen (die Zellen befinden sich größtenteils am Boden der einzelnen Vertiefungen) sowie der Packungsgrad der Zellen am Boden der Vertiefungen selbst, wodurch eine mögliche Ausnutzung freien Raums in der übrigen Nähr­ lösung entfällt.

Gegenwärtig werden auf dem Gebiet der pharmazeutischen Wirkstofforschung zunehmend in "Hochdurchsatz-Verfahren" Substanzen auf ihre Interaktion mit verschiedenen Stoffen, wie beispielsweise in Mikroorganismen rekombinant exprimierten Polypeptiden, untersucht. Dabei werden Zellen/Mikroorganismen, die beispielsweise ein bestimmtes Polypeptid überexprimieren, in Mikrotiterplatten gezüchtetet und die Zellen in den Mikrotiterplatten werden dann mit den verschiedenen Substanzen inkubiert um festzustellen, ob die jeweilige Substanz Auswirkung zeitigt. Ein Nachteil einer derartigen experimentellen Vorgehensweise besteht darin, daß die in den Mikrotiterplatten inkubierten Zellen nicht in ausreichender Menge gezüchtet werden konnten, um eine ggf. erfolgende Interaktion bestmöglich festzustellen, da mit geringer Menge an Zellen auch nur eine geringe Menge an dem jeweiligen zellulären Material von Interesse synthetisiert wurde.

Auch im Bereich der Genomanalyse, bei der DNA-Sequenzen einer stetig wachsenden Anzahl von Organismen aufgeklärt werden, kommen Mikrotiterplatten zum Einsatz. Die Genomanalyse erfordert eine Vervielfältigung und Aufreinigung von DNA-Bereichen (DNA-Präparation von subklonierter DNA) aus einer großen Anzahl verschiedener rekombinanter Bakterien, wobei in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte ein rekombinanter Mikroorganismus mit einem möglichst unterschiedlichen DNA-Bereich des zu untersuchenden Organismus gezüchtet (vervielfältigt) wird. Aufgrund des langsamen Wachstums der Mikroorganismen in den Vertiefungen bis zum Erreichen der stationären Phase, bei E. coli beispielsweise 18 Stunden und bei Hefen bis zu mehreren Tagen, zieht sich der Aufklärungsprozess nachteilig in die Länge. Darüber hinaus werden auch hier nicht die zellulären Ausbeuten erreicht, wie sie mit entsprechenden Volumina in Schüttelbehältern zu erzielen sind, was sich nachteilig auf die zu gewinnende Menge an DNA Ausbeute an DNA auswirkt, da deren Ausbeute direkt proportional zur Zellzahl in der entsprechenden Kultur des Mikroorganismus ist.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin die bekannten Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und ein verbessertes Wachstum von Zellen im kleinsten Maßstab, wie er in Mikrotiterplaten vorhanden ist, zu liefern.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung zum Züchten von Zellen, die eine Einrichtung mit mindestens einer Vertiefung zur Aufnahme einer die Zellen enthaltenden Lösung aufweist, sowie Mittel zum Zuführen von Gas in die Vertiefung der Aufnahmeeinrichtung. Das Mittel zum Einleiten ist derart ausgestaltet, daß das Gas im wesentlichen in der Nähe des Bodens der Vertiefung abgegeben wird, so daß das Gas auf dem Weg im Wesentlichen die gesamte Lösung durchströmt.

In den Figuren,

Fig. 1 zeigt schematisch eine Mikrotiterplatte mit mehreren Vertiefungen, wobei in eine Vertiefung eine Kanüle zur Begasung eingeführt ist;

Fig. 2 zeigt eine Mehrfachanordnung von Begasungsröhrchen, die über einen Hohlkörper gemeinsam mit Luft versorgt werden.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß in Mikrotiterplatten durch Einbringen von Gas Turbulenzen erzeugt werden, die einerseits eine homogene Zellsuspension der Zellen in der Nährlösung herbeiführt, andererseits auch eine bessere Gassättigung (Sauerstoffsättigung) der Nährlösung sicherstellt, so daß aerob wachsende Zellen/Mikroorganismen keine auf fehlendem Sauerstoff zurückzuführende Beschränkung in Ihrem Wachstum erleiden.

Es wurde nun gefunden, daß mit dem erfindungsgemäßen Aufbau mit geringem Aufwand im Vergleich zum bekannten Stand der Technik ca. 3-4 fache Ausbeuten an Zellmaterial und somit auch an DNA bzw. Proteinmaterial erreicht werden können. Dadurch können die bis dato zu geringe DNA-Ausbeuten bei der Präparation von Plasmid-DNA aus Mikroorganismen im automatisierten Maßstab unter Verwendung von Gebrauch von Mikrotiterplatten durch eine erhöhte Ausbeute an Zellmaterial verbessert werden.

Die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erreichte Zelldichte liegt um den Faktor 1,8 über der einer Rollerkultur. Gegenüber der Inkubation der Mikrotiterplatte im Kreisschüttler kann durch Verwendung der Erfindung sogar eine 3,6-fach höhere Zelldichte erreicht werden (siehe Tabelle 1).

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht somit, in beispielsweise Mikrotiterplatten das Züchten von Mikroorganismen zu Zelldichten, die bisher nur in größeren Kulturgefäßen erreicht wurden. Damit können für alle Anwendungsgebiete, bei der Mikroorganismen zur Produktion bzw. Amplifikation von Biomolekülen in Mikrotiterplatten eingesetzt werden, aufgrund der höheren Zelldichten auch höhere Produktausbeuten erwartet werden. Weiterhin ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung, daß Prozesse in Mikrotiterplatten Produkte in ausreichender Menge liefern, wodurch Mikrotiterplatten mit Vertiefungen geringeren Volumens eingesetzt werden können, was wiederum eine höhere Packungsdichte der Vertiefungen pro Platte erlaubt.

Weiterhin werden aufgrund einer verbesserten Ausnutzung der Nährmedien die Kosten dafür gesenkt sowie der Probendurchsatz im Bereich der Miniaturisierung und Automatisierung molekularbiologischer und biotechnologischer Prozesse optimiert. Zudem können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung Mikroorganismen bei kürzeren Inkubations­ zeiten zu Zelldichten wachsen, die gegenwärtig in Mikrotiterplatten entweder gar nicht oder nur bei äußerst langen Inkubationszeiten erreicht werden.

Die Einrichtung mit mindestens einer Vertiefung ist generell eine Einrichtung zum Züchten von Zellen in kleinem Maßstab, vorzugsweise eine Mikrotiterplatte oder eine "Square well" Platte, wie sie im Handel erhältlich ist. Diese kann aus jedem Material gefertigt sein, wobei durchsichtige Kunststoffmaterialien aufgrund der damit einhergehenden, dem fachmann bekannten Vorteile bevorzugt sind.

Das Gas wird im Allgemeinen über ein Mittel in die Vertiefung eingebracht, das hinsichtlich seiner Abmessungen an die Abmessungen der Vertiefung, in das es eingebracht wird, angepaßt ist. Als vorteilhaft haben sich dabei dünne Röhrchen erwiesen, wie beispielsweise Kanülen aus Glas, Kunststoff oder Metall. Das Röhrchen wird mit seinem stromabwärts gelegenen Ende in der Nähe des Bodens der Vertiefung derart angeordnet, daß die aus dem Röhrchen austretenden Gasblasen vorzugsweise den Boden berühren und bereits an dieser Stelle eine Verwirbelung der Lösung und der dort ggf. absedimentierten Zellen bewirkt. Da das Gas ausgehend vom Boden und aufsteigend zur Oberfläche der Lösung im Wesentlichen durch die gesamte Lösung strömt wird weiter in der gesamten Lösung eine Turbulenz erhalten. Die Röhrchen können jedoch auch an den seitlichen Wänden Öffnungen aufweisen, so daß das zugeführte Gas an mehreren Stellen in die Lösung übertritt. Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, daß diese seitlichen Öffnungen stromaufwärts kleiner werden, so daß über alle Öffnungen ein im wesentlichen konstanter Strom an Gas in die Lösung abgegeben wird.

Um die erfindungsgemäße Vorrichtung als bauliche Verwirklichung an die Bedürfnisse einer automatisierten Züchtung und Gewinnung der Mikroorganismen anzupassen, können mehrere Begasungsmittel derart zusammengefaßt sein, daß deren räumlich Anordnung der der Ver­ tiefungen auf einer Mikrotiterplatte entspricht, mit der es zum Einsatz kommen soll. Dabei ist es der Einfachheit halber bevorzugt die Vielzahl der Begasungsmittel mittels eines stromaufwärts angeordneten, gemeinsamen Hohlkörpers, in dem das zugeführte Gas auf die Begasungsmittel möglichst gleichmäßig verteilt wird, zusammenzuschalten, so daß das Gas pro vorgeschaltetem Hohkörper lediglich als eine Einheit zugeführt werden muß und sich dieses im Behälter dann auf die jeweiligen Begasungsmittel, bzw. Röhrchen verteilt (siehe Fig. 2). Gleichermaßen können, wenn mehrere Mikrotiterplatten inkubiert werden, die jeweils vorgeschalteten Hohlkörper modular mit einem weiteren Hohlkörper zusammegefaßt werden, so daß auch hier wieder eine Vereinfachung des Aufbaus eintritt. Das Zusammenschalten verschiedener, das Gas jeweils verteilender Hohlkörper ist dabei lediglich durch den konstruktiven Aufbau der automatisierten Anlage begrenzt.

Um eine sterile Umgebung sicherzustellen ist die Einrichtung zur Aufnahme der Lösung vor­ zugsweise mit einer luftdurchlässigen Abdeckung abgedichtet. Als Abdeckung kann jede Einrichtung dienen, mit der Maßgabe, daß die Begasungsmittel durch die Abdeckung durchgeführt werden können und daß die zugeführte Luft wieder aus dem Bereich über der Lösung in den Vertiefungen entweichen kann, so daß sich dort kein Überdruck aufbaut. Als Materialien für derartige Abdeckungen können Kunststoff, Glas oder Metall eingesetzt werden, wobei sich in diesem Fall eine mit dem Begasungsmittel einstückige Ausführungsform anbietet.

Dabei werden die Abdeckungen für die Mikrotiterplatten mit den Röhrchen/Kanülen einstückig hergestellt, was eine exakte Anordnung des stromabwärts gelegenen Endes der Röhrchen in den Vertiefungen unmittelbar über dem Boden der Vertiefung erleichtert. So können bei dieser Aus­ führungsform lediglich die Abdeckungen (Deckel), die die Röhrchen bereits als Bauteilkomponente enthalten und ggf. auch einen vorgeschalteten Hohlkörper, einfach auf die Mikrotiterplatten aufgesetzt und über eine Leitung mit einer Dosiervorrichtung für das Gas verbunden werden. Die der Mikrotiterplatte zugewandte Fläche der Abdeckung kann dabei über beispielsweise Stege von der Mikrotiterplatte beabstandet sein, so daß das zugeführte Gas leicht aus den Vertiefungen entweichen kann. Ein weiterer Vorteil einer derartigen Ausführungsform besteht darin, daß die Einheiten gleichzeitig zum Animpfen weiterer Kulturen in Mikrotiter­ platten verwendet werden können, da in diesem Fall die in das Kulturmedium eingetauchten Begasungsröhrchen als Transfermittel für das Inoculum dienen.

Weiterhin ist es möglich auch eine einfache Folie einzusetzen, die von den Röhrchen dann beim Einsatz durchstoßen wird.

Um keine Kontamination der Lösung in den Vertiefungen hervorzurufen, wird in die Zufuhr­ leitung für das Gas stromaufwärts der Mikrotiterplatten vorzugsweise ein Filter vorgeschaltet. Dies ergibt einen weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Aufbaus, da hier lediglich sterile luft in die Lösung eingebracht wird und somit eine Kontamination der Nährmedien durch andere Mikroorganismen weitestgehend verhindert wird.

Das in die Vertiefungen zugeführte Gas wird je nach Bedarf dosiert, was beispielsweise mittels einer einfachen Schlauchpumpe erfolgen kann. Dabei wird der Fachmann gemäß seinem allgemeinen Fachwissen und den vorherrschenden Bedingungen die erforderliche Gasmenge wählen.

In dem Verfahren zum Züchten von Zellen wird eine entsprechende Menge Nährmedium in die Vertiefungen überführt, was beispielsweise mittels Mehrfachpipetten erfolgen kann. Dieser Vorgang wird in den meisten Fällen automatisiert sein. Die Vertiefungen werden dann mit den jeweiligen Mikroorganismen angeimpft und das Begasungsmittel wird in den Vertiefungen angeordnet. Dabei wird das stromabwärts gelegene Ende des Begasungsmittel derart in die Vertiefung eingeführt, daß dieses Ende in der Nähe des Bodens der Vertiefung positionert ist, so daß das zugeführte Gas problemlos in die Lösung übertreten kann. Anschließend wird über das Begasungsmittel das Gas in einer gewünschten Menge zugeführt. Die Einrichtungen werden dann für eine Zeitspanne unter Begasung inkubiert, die für das gewünschte Wachstum der Zellen erforderlich ist.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung ohne diese einzuschränken.

Beispiel

Die erfindungsgemäße Vorrichtung wurde anhand eines einzelnen Begasungsröhrchens (Kanüle) in der Vertiefung einer sog. "Square-Well" Mikrotiterplatte (Vol_max: 2 ml) bei einem Kulturvolumen von 1,5 ml Nährlösung dargestellt (Fig. 1). Die Luftzufuhr erfolgte über ein Schlauchsystem, wobei der sterile und nicht sterile Teil des Systems durch einen Sterilfilter (Porengröße 0,2 µm) getrennt wurden. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden durch eine handelsübliche, selbstklebende Folie steril gegenüber der Umgebung abgegrenzt. Die in die Vertiefung eingebrachte Anzahl an Luftblasen wurde über eine Schlauchpumpe auf 1Blase/2Sekunden eingestellt. Die Spitze der Kanüle wurde in der Nähe des Bodens der Vertiefung derart angeordnet, daß die Blasen aus der Kanüle leicht heraustreten konnten.

Zur Durchführung des Experiments wurden folgende Parameter gewählt:
Nährmedium: 1,5 ml LB-Medium + 100 µg/ml Ampicillin;
Inkubationszeit: 16 Std.;
Temperatur: 37°C.

Als Mikroorganismus dienten 5 µl einer im Roller über Nacht dicht gewachsenen Kultur von Escherrichia coli DH10b (transformiert mit dem Plasmid pADGAL4 der Firma Stratagene). Für die folgenden Kulturen wurde nach Ablauf der Inkubationszeit im Photometer die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm als Maß für die erreichte Zelldichte bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Kultur

A: Mikrotiterplatte "Deepwell/square" im Kreisschüttler (Innova 4330, 210 U/min)
B: Mikrotiterplatte "Deepwell/square" mit erfindungsgemäßem Aufbau
C: Kulturröhrchen (∅ = 14 mm) im Kulturroller (ca. 60 U/min).

Tabelle 1

Wie ersichtlich, konnte mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Verbesserung gegenüber einer herkömmlichen Inkubation in Mikrotiterplatten um den Faktor 3,6 erzielt werden. Überraschenderweise war die erfindungsgemäße Vorrichtung auch einer Inkubation mit einer Rollerkultur überlegen.

Claims (11)

1. Vorrichtung zum Züchten von Zellen, umfassend
eine Einrichtung mit mindestens einer Vertiefung zur Aufnahme einer Lösung, und
Mittel zum Zuführen von Gas in die Vertiefung der Aufnahmeeinrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas im wesentlich in der Nähe des Bodens der Vertiefung in die Lösung abgegeben wird, so daß das Gas im wesentlichen die gesamte Lösung durchströmt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Einrichtung mit mindestens einer Vertiefung eine Mikrotiterplatte oder ein Square well Platte ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel zum Zuführen von Gas eine Röhre ist, die die in der Nähe des stomabwärts gelegenen Endes an den seitlichen Wandungen Öffnungen aufweist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die in der seitlichen Wandung der Röhre angebrachten Öffnungen stromaufwärts der stromabwärts gelegenen Endes kleiner werden.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Röhren aus Metall, Kunststoff oder Glas sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei mehrere Röhren in einer räumlichen Anordnung zusammengefasst sind, die der räumlichen Anordnung der Vertie­ fungen in der Einrichtung zur Aufnahme der Zellen enthaltenden Lösung entspricht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei das stromaufwärts gelegene Ende der mehreren Röhren in einem Hohlkörper enden, aus dem das Gas in die Röhren geleitet wird.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Einrichtung zur Aufnahme der Lösung gegenüber der Umgebung mit einer Luftdurchlässigen Abdeckung abgedichtet ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Abdeckung mit dem Mittel zum Zuführen von Gas einstückig ausgebildet ist.

10. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Züchten von Zellen.

11. Verfahren zum Züchten von Zellen, umfassend

• a) Animpfen der Organismen in mit Nährmedium gefüllten Vertiefungen einer Einrichtung zur Aufnahme von Lösung,
• b) Einbringen von Mittel zum Zuführen von Luft in die Vertiefung, so daß der Auslaß über dem Boden der Vertiefung angeordnet ist,
• c) Zuführen Gas über die Mittel zum Zuführen von Gas in die mit Lösung gefüllte Vertiefung, und
• d) Inkubieren der Organismen unter Begasung.