DE10021597A1

DE10021597A1 - Verfahren zur Optimierung der Parameter eines Trennungsverfahrens für Stoffgemische

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Publication number: DE10021597A1
Application number: DE2000121597
Authority: DE
Inventors: Arne Buchholz; Lasse Greiner; Christoph Hoh; Christian Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2000-05-04
Filing date: 2000-05-04
Publication date: 2001-11-15

Abstract

Durch den Einsatz genetischer Algorithmen (GA) werden optimierte Parameter und Vorschriften für effiziente, elektrophoretische Trennungen komplexer Substanzgemische durch chromatographische Verfahren wie insbesondere die Capillarelektrophorese (CE) bestimmt. Geeignetes Selektionskriterium ist eine aus Peakabstand und Bodenzahl berechnete Trenngüte. Als relevante Parameter der Optimierung erweisen sich insbesondere die Trennspannung, die Trenntemperatur und die Pufferkonzentration. Die Möglichkeit zur Etablierung einer neuen Trennmethode in der Capillarelektrophorese durch Anwendung eines genetischen Algorithmus konnte am Beispiel der effektiven Trennung von sechs Nucleotiden (ATP, ADP, AMP, cAMP, NAD und NADP) sowie der Trennung dreier Aminosäurederivate (2-Acetylamino-3-phenylacrylsäure, (R)- und (S)-2-Acetylamino-3-phenylpropionsäure) bestätigt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Optimierung der Parameter eines Trennungsverfahrens für Stoffgemische, insbesondere eines kapillarelektrophoretischen Verfahrens, in Hinblick auf ein vorgegebenes Bewertungskriterium.

Verfahren zur Auftrennung von Stoffgemischen spielen bei der quantitativen und qualitativen Analyse eine unverzichtbare Rolle. Zunehmend gewinnt dabei auch die Capillarelektrophorese (CE) gegenüber anderen analytischen Methoden wie zum Beispiel der Flüssigchromatographie (LC) und der Gaschromatographie (GC) an Bedeutung.

Bei chromatographischen Verfahren werden Stoffgemische anhand ihrer unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der mobilen und der flüssigen Phase in ihre Bestandteile aufgetrennt. Dabei besteht das Ziel, eine möglichst vollständige Trennung aller Bestandteile des zu analysierenden Stoffgemisches zu erreichen. Weiterhin muss das eingesetzte Verfahren den Anforderungen an die Reproduzierbarkeit und die Quantifizierbarkeit gerecht werden. Nicht zuletzt sind aus ökonomischen Gründen auch kurze Analysenzeiten und niedrige Nachweisgrenzen erwünscht. In der Analytik von Stoffgemischen kommt der Optimierung chromatographischer Verfahren daher eine hohe Bedeutung zu.

Bei der bisherigen Optimierung der Parameter von chromatographischen Verfahren wird im allgemeinen versucht, die verschiedenen Einflüsse der Parameter zu verstehen und entsprechend der rationalen Erklärung einen Trend für die Trennung zu erkennen. Dieser Ansatz geht davon aus, dass sich die Parameter kaum gegenseitig beeinflussen beziehungsweise dass die Beeinflussung zumindest vorhersagbar ist. In der Praxis zeigt sich jedoch, dass ein derartiger Ansatz oft versagt. So beschäftigt sich die US 4,941,101 zum Beispiel mit der nachträglichen Trennung von Peaks, die in der Gaschromato graphie nicht ausreichend aufgelöst wurden. Dazu benötigt man die Chromatogramme der beiden zu den Peaks gehörenden Substanzen in Reinform. Durch die Anwendung von Filtern zur Bestimmung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses und die numerische Ableitung der Chromatogramme können die Peaks nachträglich auseinander gerechnet werden.

Weiterhin sind für den Trennprozess physikochemische Modelle entworfen worden, die zum Beispiel für die Gaschromatographie und die Flüssig chromatographie auf der Ausbildung von Adsorptions- und Desorptions- Gleichgewichten beruhen. Diese Gleichgewichte und die zugrunde liegenden Aktivierungsenergien sind unabhängige, messbare Größen. Ein solcher Ansatz scheitert jedoch für die Capillarelektrophorese, da sich dort die verschiedenen Parameter in nicht vorhersagbarer Weise gegenseitig beeinflussen und das Trennprinzip nicht nur auf der Ausbildung von Adsorptionsgleichgewichten beruht. Die Trennung erfolgt vielmehr aufgrund der unterschiedlichen Mobilität der Teilchen im elektroosmotischen Fluss (EOF), der durch die angelegte Spannung hervorgerufen wird. Da sich die Auswirkungen der einzelnen Einflussgrößen nicht vorhersagen lassen, kommt es zu widersprüchlichen Aussagen darüber, wie eine Trennung zu erreichen ist. Zum Beispiel wird über den Einfluss der Temperatur ausgesagt, dass tiefere Temperaturen zu besseren Trennungen führen müssen, da sich dann die unterschiedlichen Aktivierungsenergien stärker auswirken würden. Die im Stand der Technik bekannten Empfehlungen zur Optimierung von Trennungen für gegebene Stoffgemische sind daher sehr allgemein gehalten und zum Teil auch widersprüchlich (vgl. Whatley, H. "Making CE Work - Points to consider", LC-GC (1999) 762-766). Oft wird der Trend für ein System auf andere Systeme übertragen, was den gegebenen Parameterraum unnötig einschränken kann.

Vor diesem Hintergrund war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Optimierung der Parameter eines Trennungsverfahrens für Stoffgemische und insbesondere eines kapillarefektrophoretischen Verfahrens anzugeben, welches in effizienter Weise das Auffinden optimaler Parameter ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Optimierung der Parameter eines Trennungsverfahrens für Stoffgemische im Hinblick auf ein vorgegebenes Bewertungskriterium gelöst, welches die folgenden Schritte enthält:

a) Es wird eine Menge von verschiedenen Parametersätzen erzeugt, was beispielsweise mit Hilfe eines Zufallsgenerators geschehen kann. Ein Parametersatz umfasst dabei die veränderbaren und zu optimierenden Parameter des Trennungsverfahrens.
b) Zu jedem Parametersatz der Menge von Parametersätzen wird experimentell der zugehörige Wert des Bewertungskriteriums bestimmt.
c) Durch Anwendung eines genetischen Algorithmus wird auf der Basis der in Schritt b) bestimmten Werte des Bewertungskriteriums aus den Parameter sätzen der ersten Menge eine neue Menge von Parametersätzen bestimmt.
d) Die Schritte b) und c) werden so oft wiederholt, bis ein Abbruchkriterium erfüllt ist. Das Abbruchkriterium kann zum Beispiel das Abarbeiten einer vorgegebenen Anzahl von Wiederholungen der Schritte b) und c) sein, oder der Abbruch kann erfolgen, wenn mindestens einer der Parametersätze eine vorgegebene Güte - ausgedrückt durch den Wert des Bewertungskriteriums - überschreitet.

Durch den Einsatz eines genetischen Algorithmus zur Bestimmung neuer Parametersätze ist es möglich, optimale Parameter zu finden, ohne dass ein analytisches Verständnis der funktionalen Zusammenhänge zwischen den Parametern und dem beobachteten Bewertungskriterium vorhanden sein müsste. Bei passender Wahl der Randparameter des genetischen Algorithmus kann dabei sichergestellt werden, dass der zur Verfügung stehende Parameterraum global nach einem Optimum abgesucht wird.

Bei dem Bewertungskriterium handelt es sich vorzugsweise um eine Funktion der Abstände zwischen den Peaks im Analysespektrum und/oder der Breite der Peaks, wobei die Breite der Peaks vorzugsweise durch die Halbwertsbreite und insbesondere durch die theoretische Bodenzahl der Peaks ausgedrückt wird. Insbesondere der Abstand benachbarter Peaks im Analysespektrum sollte hinreichend groß sein, damit die Peaks eindeutig voneinander getrennt werden können. Die theoretische Bodenzahl ist ein Maß für die Breite eines Peaks unter Berücksichtigung der Zeitdauer zwischen dem Aufgeben der Testsubstanz und dem Auftreten des Peaks (Retentionszeit). Hier ist eine möglichst große Bodenzahl anzustreben, um scharfe und gut erkennbare Peaks zu erhalten.

Ein Bewertungskriterium der oben genannten Art kann definiert werden als der Wert

wobei
n = Anzahl der beobachteten Peaks;
Δt_i = t_i+1 - t_i; die Zeitdifferenz Δt_n kann per definitionem der vorangegangenen Zeitdifferenz Δt_n-1 oder einem anderen geeigneten Wert, zum Beispiel dem Mittelwert aller Zeitdifferenzen, gleichgesetzt werden;
t_i = Retentionszeit des Peaks Nr. i;
w_i 50% = Breite des Peaks Nr. i auf 50% seiner maximalen Höhe;
α_i = Gewichtungsfaktor.

Über die Gewichtungsfaktoren α_i, die im einfachsten Falle alle gleich 1 gesetzt werden können, kann den unterschiedlichen Substanzen (Peaks) eine individuelle Gewichtung je nach ihrer Bedeutung für das Analyseergebnis zugeteilt werden.

Zu den im Rahmen eines chromatographischen und insbesondere kapillarelektro phoretischen Verfahrens optimierten Parametern können vornehmlich die Trennspannung, die Trenntemperatur und/oder die Pufferkonzentration des eingesetzten Puffermediums gehören. Weitere Parameter sind die Pufferzusammensetzung, die Konzentration von Lösungsvermittlern, die Konzentration (= Injektionsvolumen) von Selektoren wie insbesondere von chiralen Selektoren, die Injektionszeit, der pH-Wert des Puffers, der Wert des überlagerten Druckes, die Säulenmaterialien und/oder die Säulendimensionen wie insbesondere Säulenlänge und Säulendurchmesser.

Gemäß einer Weiterbildung des Verfahrens werden im Selektionsschritt des genetischen Algorithmus diejenigen Parametersätze aussortiert, die im Analysespektrum eine kleinere Anzahl an Peaks als andere Parametersätze aufweisen. Eine solche kleinere Anzahl von Peaks deutet nämlich darauf hin, dass mit dem entsprechenden Parametersatz nicht alle im Substanzgemisch enthaltenen Stoffe separiert werden konnten. Eine Weiterarbeit mit einem solchen Parametersatz sollte demnach unterbleiben, wenn bereits Parametersätze vorhanden sind, die die Trennung ermöglichen.

Bei dem erfindungsgemäßen iterativen Optimierungsverfahren werden vorzugsweise die Zwischenergebnisse einschließlich der gemessenen Bewertungskriterien beziehungsweise Analysespektren in einer Datenbank gespeichert.

Eine derartige Speicherung von Zwischenergebnissen in einer Datenbank erlaubt es zum Beispiel, durch die Auswertung der Datenbank die Relevanz von Parametern für das vorgegebene Bewertungskriterium nachträglich festzustellen. Wenn sich nämlich ein Parameter im Laufe des Optimierungsverfahrens nicht oder nur unwesentlich geändert hat, ist davon auszugehen, dass er eine nur geringe oder gar keine Auswirkung auf das Bewertungskriterium hat. Ein solcher Parameter kann daher bei zukünftigen Optimierungen außer Acht gelassen werden, da die Effizienz einer iterativen Suche nicht zuletzt davon abhängt, dass die Anzahl der variierten Parameter auf ein notwendiges Minimum beschränkt wird. Durch die Auswertung der Datenbank ist es natürlich umgekehrt auch möglich, Parameter mit hoher Relevanz für das Bewertungskriterium zu erkennen und ihrer Bedeutung entsprechend zu behandeln.

Weiterhin kann eine Datenbank dazu verwendet werden, durch eine entsprechende Auswertung einen optimalen Parametersatz in Hinblick auf ein zweites Bewertungskriterium zu ermitteln. Die im Rahmen des erfindungs gemäßen iterativen Optimierungsverfahrens durchgeführten Versuche enthalten wertvolle Informationen über den Einfluss verschiedener Parameter des Verfahrens auf das analytische Resultat. Diese Informationen werden in der Datenbank festgehalten. Wenn sich somit nachträglich ein Interesse an einer neuen Fragestellung ergibt, können die Informationen für eine zumindest vorläufige Beantwortung dieser Frage ausgenutzt werden. Zum Beispiel ist es denkbar, dass ein erhöhtes Interesse an der sicheren Trennung einer bestimmten Untergruppe der Substanzen eines Substanzgemisches besteht. In diesem Falle könnte ein geändertes zweites Bewertungskriterium formuliert werden, welches diesen Substanzen eine entsprechende Gewichtung beimisst. Durch die Auswahl desjenigen Parametersatzes aus der Datenbank, welcher in Hinblick auf das zweite Bewertungskriterium optimal ist, können somit unter Umständen schon ohne erneute Versuche ausreichend optimierte Parameter gefunden werden. Zumindest kann eine sehr gute Anfangsmenge von Parametersätzen für eine erneute iterative Optimierung bestimmt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit bekannten Verfahren zur Optimierung von Verfahrensparametern kombiniert werden. Dabei kann es insbesondere vor oder nach dem anderen Verfahren ausgeführt werden. Ferner können die von beiden Verfahren optimierten Parameter verschieden, teilweise identisch oder vollkommen identisch sein. Auf diese Weise kann jeder Parameter mit einem hierfür am besten geeigneten Verfahren optimiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner vollkommen automatisiert durchgeführt werden. Hierfür ist eine Datenverarbeitungseinheit (Computer) mit einem hiervon steuerbaren Gerät zur Durchführung der Analyse gekoppelt, wobei die Datenverarbeitungseinheit mit Hilfe des erfindungsgemäßen Algorithmus die Versuchsparameter bestimmt, die Versuche in dem Gerät ausführen lässt, die Versuchsergebnisse erfasst und zur Bildung neuer Parameter verwendet, und die geschilderte Prozedur so oft wiederholt, bis ein Abbruchkriterium erfüllt ist.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe der Figuren detailliert erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 schematisch das Prinzip des elektroendosmotischen Flusses (EOF);

Fig. 2 den schematischen Aufbau eines Capillarelektrophorese-Gerätes;

Fig. 3 ein Blockschaltbild der Optimierung mit einem genetischen Algorithmus;

Fig. 4 die Codierung der Parameter eines Individuums im Binärsystem;

Fig. 5 das Prinzip eines Selektionsvorganges;

Fig. 6 eine Veranschaulichung der Roulette-Methode und der Ball-Bearing- Methode;

Fig. 7 das Prinzip des Crossing-over und der Mutation;

Fig. 8 ein Flussdiagramm des Optimierungsverfahrens;

Fig. 9 die Definition des Bewertungskriteriums;

Fig. 10 den Parametersatz eines Versuches;

Fig. 11 den Verlauf des Bewertungskriteriums über vier Generationen für ein erstes Versuchsbeispiel;

Fig. 12 den Verlauf der Parameter Trennspannung und Temperatur für das erste Versuchsbeispiel;

Fig. 13 den Verlauf der Pufferkonzentration für das erste Versuchsbeispiel;

Fig. 14 den Verlauf der Injektionszeit, des pH-Wertes des Puffers und der Drucküberlagerung für das erste Versuchsbeispiel;

Fig. 15 den Verlauf des Bewertungskriteriums über vier Generationen für das zweite Versuchsbeispiel.

Die Capillarelektrophorese (CE) wurde in den späten 80er Jahren als eine Weiterentwicklung der Elektrophorese, per Definition die Migration geladener Teilchen in einem Elektrolyten bei Anlegen eines elektrischen Feldes, etabliert. Seitdem entwickelte sich diese Technik zu einer mittlerweile routinemäßigen Analysenmethode für eine Vielzahl verschiedener Substanzklassen und findet besonders in der pharmazeutischen Forschung breite Anwendung.

Die in Fig. 1 schematisch dargestellte Trennung der Analyten findet in einer (Silica-)Kapillare statt und beruht in erster Linie auf den unterschiedlichen elektrophoretischen Beweglichkeiten der Teilchen. Diese Größe ist proportional zum Verhältnis aus Masse zu Ladung der Analyten. Kleine, hoch geladene Teilchen werden im elektrischen Feld stärker beschleunigt als große, gering geladene Teilchen.

Der durch die Silica-Kapillarwände 5 hervorgerufene Elektroendoosmotische Flow (EOF) erlaubt auch die Trennung und den Nachweis nicht-ionisierter Teilchen 4 in der Kapillare. Ursache des EOF ist die vom pH-Wert der Lösung stark abhängige Ionisierung der Silicat-Oberfläche an den Kapillarwänden. Bei hohen pH-Werten sind die Silanolgruppen deprotoniert - die Kapillarwand 5 ist negativ aufgeladen. Um Elektroneutralität zu gewahren, bildet sich entlang der Kapillarwand eine Schicht positiv geladener Ionen 3 aus. Diese Ionen 3 sind solvatisiert und werden, in Abhängigkeit vom Abstand zur Kapillarwand, in Richtung der Kathode 2 bewegt. Es resultiert ein kontinuierlicher Analytenfluss von der Anode 1 in Richtung der Kathode 2 - der EOF. Die Größe des EOF hängt von mehreren Parametern ab und kann näherungsweise durch die folgende Gleichung beschrieben werden.

µ_EO = (εζ/4πηr)

µ_EO = EOF
ε = Dielektrizitätskonstante
z = sog. zeta-Potential der Kapillarwand
η = Viskosität der Lösung
r = Kapillarradius

Die Möglichkeit, mit Hilfe der CE sowohl geladene als auch ungeladene Teilchen analysieren zu können, macht diese Analytik in sehr vielen Bereichen sehr attraktiv. Ein weiterer Vorteil dieser Methode sind die oft nur sehr geringen Substanzmengen, die benötigt werden.

Verschiedene Variationen in der CE wie etwa das Isoelektrische Fokussieren in der Kapillare, die Micellare elektrokinetische Kapillar-Chromatography (MECC) oder auch der Einsatz chiraler Selektoren zur Enantiomerentrennung vergrößern noch das vorhandene Spektrum der analytischen Möglichkeiten dieser Methode.

CE-Geräte sind von diversen Anbietern kommerziell erhältlich. Den prinzipiellen Aufbau eines CE-Gerätes zeigt Fig. 2. Die Geräte bestehen prinzipiell aus einer mit Elektrolyt gefüllten, feinen Kapillare 11 (Silicat-Oberfläche, typische Größenordnung: Länge: ca. 50-75 cm; Radius: 25-100 µm), die mit ihren Enden in zwei Reservoire 9, 10 der Elektrolytlösung taucht. Zwei Elektroden 8, 12 sind ebenfalls in die beiden Reservoire getaucht, um den elektrischen Stromkreis zu schließen. Eine Hochspannungsquelle 6 liefert elektrische Spannungen im Bereich von etwa 10-40 kV. Die daraus resultierenden Ströme bewegen sich, in Abhängigkeit vom Elektrolyten, im µA-Bereich. Um ein Aufheizen der Kapillaren 11 zu verhindern, werden diese bei handelsüblichen Geräten mit einem Kühlmittel effizient temperiert. Die Elektroden sind aus inerten Materialien wie etwa Platin gefertigt. Die Kapillare durchläuft an einem Ende einen Detektor 7, meistens ein UV-Detektor. Es sind aber auch andere Detektionsarten wie etwa ein Fluoreszensdetektor oder auch ein angeschlossenes Massenspektrometer möglich. Die Meßwerte werden in einer Datenaufzeichnung 13 gespeichert.

Im Folgenden wird mit Hilfe der Fig. 3 bis 7 das Prinzip genetischer Algorithmen erläutert.

Die gesamte DNA eines Lebewesens, die Chromosomen, codieren alle vererbbaren Eigenschaften der Lebewesen. Die Evolution, die eine enorme Vielfalt nahezu ideal angepasster Lebewesen hervorgebracht hat, ist somit das Ergebnis einer ständigen Veränderung und Optimierung der das jeweilige Lebewesen codierenden Gene. Eine definierte genetische Struktur (Genotyp) ist Grundlage einer definierten äußeren Erscheinung (Phänotyp).

Genetische Algorithmen (GA) besitzen dieses natürliche Vorbild als Grundlage ihres Prinzips. Eine Optimierung mit einem GA kann gemäß Fig. 3 als die Suche nach bestimmten Kombinationen von Parametern verstanden werden, die eine Optimierung einer definierten, vorgegebenen Zielfunktion erwarten lassen. Die Zielfunktion ist dabei durch festgelegte Kriterien definiert, welche die Parameterkombinationen (Individuen) erfüllen sollen. Die Zielfunktion ist nicht die mathematische Beschreibung des Systems durch die gewählten Parameter. Diese ist dem GA nicht bekannt und stellt die zu optimierende "black box" dar. Ziel der Optimierung ist es, die Parameterkombinationen (input) zu finden, die in der "black box" die Kriterien der gesetzten Zielfunktion möglichst optimal erfüllen. Nur das Ergebnis (output) ist von Interesse. Wie dieses Ergebnis zustande kommt, d. h. die Funktionsweise der "black box", interessiert nicht. Der GA besitzt in diesem Bild lediglich das Instrumentarium zum Auffinden geeigneter Parameterkombinationen, indem er die gewonnenen Erkenntnisse über einmal generierte Kombinationen als Grundlage zum Auffinden neuer Individuen nutzt.

Die drei elementaren Prozesse (Operatoren) dieser Evolutionsstrategie sind:

Selektion: Nur Individuen, die den vorgegebenen Zielen gerecht werden, überleben.

Reproduktion: Sie sichert den Bestand der "guten" (im Sinne der Zielfunktion) Individuen. Mit jeder neuen Generation werden einmal erworbene gute Merkmale beibehalten und untereinander durch crossing-over vermischt.

Mutation: Zufällige Veränderung der Erbinformation (Chromosomen), die unmittelbar oder in späteren Generationen eine Veränderung des Phänotyps zur Folge haben kann.

Diese drei Operatoren sind die Grundlage für die Funktionsweise eines genetischen Algorithmus. Die Anwendung eines GA erfolgt dabei in folgenden Schritten:

1. Definition von Selektionskriterien/eines Bewertungskriteriums

Zu Beginn jeder Optimierung muss eindeutig geklärt sein, welche Eigenschaft eines Systems verbessert werden soll. Auch mehrere Eigenschaften können optimiert werden. Das Optimierungsziel wird durch die sogenannten Selektionskriterien festgelegt. Diese Kriterien definieren die zu optimierende Zielfunktion. Auf analytische Probleme übertragen ist ein Selektionskriterium etwa eine Maximierung des Signal/Rausch-Verhältnisses oder auch die Maximierung der Summe der relativen Retentionszeiten für die einzelnen Analysepeaks. Erst wenn die Selektionskriterien definiert sind, können Individuen in ihrer Qualität bewertet werden. Ein Individuum, das die Selektionskriterien gut erfüllt, wird mit einer hohen Wahrscheinlichkeit in seiner Umwelt überleben können.

Die unterschiedlichen Selektionskriterien können unterschiedlich stark gewichtet werden. Durch eine solche Gewichtung wird die Suche nach bestimmten Individuen im Lösungsraum intensiviert. Es werden bevorzugt Phänotypen gefunden, die dem Selektionskriterium mit der höchsten Gewichtung entsprechen. Die Gewichtung der Selektionskriterien kann beliebig sein. Nach einem Zufallsprinzip wird dafür gesorgt, dass im Generationsmittel die Aufteilung einer Population dem Verhältnis nahezu entspricht.

2. Festlegen der Variationsparameter und Anzahl der Individuen

Ist das Ziel einer Optimierung eindeutig geklärt, so müssen die Parameter bestimmt werden, deren Veränderung einen Einfluss auf die Qualität der einzelnen Individuen bezüglich der Zielfunktion haben. Sind diese Parameter gefunden, werden Grenzen für jeden einzelnen Parameter festgesetzt, so dass eine Optimierung des Systems innerhalb dieser Variationsbreiten als möglich erscheint. Jeder Variationsparameter wird also gerastert.

Eine CE-Analysemethode kann durch viele Parameter charakterisiert werden, aber in Abhängigkeit der gewählten Selektionskriterien sind mitunter nur einzelne Größen für eine Optimierung relevant. Die gewählten Parameter sind immer Eigenschaften, die den Phänotypen eines Individuums beschreiben. Bei der CE etwa kann eine Methode durch Parameter wie die Trennspannung, pH-Wert, Temperatur, Puffer-Konzentration oder auch die Proben-Injektionszeit charakterisiert werden.

Eine Anzahl an Individuen, die sich aus der Verdoppelung der Variations parameter ergibt, sollte die minimale Anzahl sein. Diese minimale Populationsgröße hat sich in der Regel als günstig erwiesen.

3. Codierung

Jedes Individuum wird durch einen Satz von Parametern ("Genom") beschrieben. Die Kombination dieser Parameter eines Individuums bestimmt seinen Phänotypen. Um die oben genannten Prozesse der Evolution sinnvoll auch auf beliebige Probleme anwenden zu können, bedarf es aber der Codierung dieser Phänotypen. Nur auf diese Weise sind Prozesse wie crossing-over oder Mutationen möglich, die elementar für eine zielgerichtete Evolution sind.

Anders als in der Natur, die einen Vier-Buchstaben-Code benutzt, werden die Individuen bei genetischen Algorithmen mit Hilfe des Binärsystems codiert.

Mit Hilfe des Binärsystem gelingt es, dezimale Zahlenwerte und damit Parametergrößen zu codieren. Die in Fig. 4 veranschaulichte Codierung eines ganzen Individuums ist demnach nichts anderes als eine Aneinanderreihung der einzelnen Bit-Folgen, die die jeweiligen Parameter des Individuums codieren. Ein Bit-Abschnitt, der einen bestimmten Parameter codiert, wird wie in der Natur als Gen bezeichnet. Je nach Variationsbreite eines Parameters besteht eine Bit-Folge aus einer definierten Anzahl von Bits. Soll etwa ein Parameter A in einem Bereich von 0 bis 31 Einheiten codiert werden, wobei die kleinstmögliche Veränderung eine Einheit beträgt, so muss die Codierung mindestens über eine 5-Bit-Folge erfolgen, da durch 5 Bits 2⁵ = 32 Parameterwerte dargestellt werden können. Anders ausgedrückt, besteht das den Parameter codierende Gen aus 5 Bits.

Der gesamte Genotyp eines Individuums bei einem GA wird als string bezeichnet und ist die Summe aller Gene. Jeder string codiert für einen bestimmten Phänotypen. Ein Individuum ist daher anhand seiner Gene eindeutig zu erkennen.

4. Erste Generation und Selektionsvorgang

Die weitere Vorgehensweise bei einem GA ist nun eine sich ständig wiederholende Ausführung der drei Operatoren Selektion, Reproduktion und Mutation. Zunächst muss allerdings eine erste Generation, eine Startpopulation, erzeugt werden.

Die ersten Individuen, die erste Generation, kann beispielsweise per Zufallsgenerator ermittelt werden. Die diesen Genotypen entsprechenden Phänotypen müssen sich nun in der durch die Selektionskriterien geschaffenen Umwelt beweisen. Individuen hoher Tauglichkeit überleben mit einer hohen Wahrscheinlichkeit, schlechte Individuen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit.

Dieser Selektionsvorgang entspricht anschaulich dem Drehen eines Rouletterades. Die Größe der einzelnen Segmente dieses Rades entspricht der Güte je eines Individuums bezüglich der Selektionskriterien. Da die Anzahl der Individuen einer Generation, die Population, konstant bleiben soll, wird das Rad so oft gedreht wie Individuen vorhanden sind. Dieser Selektionsvorgang wird in Fig. 5 veranschaulicht. Der Einfachheit halber besteht die dabei gezeigte Population aus nur vier Individuen.

Die Individuen, die sich in ihrer durch die Zielfunktion vorgegebenen Umwelt behaupten konnten, im Beispiel der Abb. 5 sind dies die Individuen 1 bis 3, können sich nun reproduzieren.

Bei dieser dargestellten Roulette-Methode ist es allerdings möglich, dass Individuen, die trotz ihrer großen relativen Güte eine hohe Überlebenschance besitzen, per Zufall nicht für die anschließende Reproduktion ausgewählt werden. Bei Populationen mit nur wenigen Individuen ist die Gefahr, dass gute Individuen nicht berücksichtigt werden, besonders groß. Im Beispiel von Fig. 5 wäre es auch durchaus denkbar, dass etwa das Individuum 2 dreimal und das Individuum 3 einmal überlebt. Diese Auswahl wäre aber bedeutend schlechter als die gezeigte.

Um derart ungünstige, per Zufall ermittelte Verteilungen zu verhindern, muss entweder die Population sehr groß gewählt werden, oder es müssen etwas modifizierte Selektionsmethoden gewählt werden. So ist es beispielsweise möglich, zu Beginn einer Optimierung festzulegen, dass das jeweils beste Individuum einer Generation garantiert in die nächste Generation übernommen wird.

Die oben dargestellte einfache Roulette-Methode der Selektion stellt die einfachste Möglichkeit dar. Eine sinnvolle alternative Methode ist die sog. "keep best, ball bearing"-Methode. Durch diese Methode wird sichergestellt, dass die besten Individuen bezüglich der Selektionskriterien garantiert in die nächste Generation übernommen werden. Es wird somit zwar verhindert, dass diese Individuen mutieren oder durch crossing-over verändert werden, die Methode stellt aber andererseits sicher, dass die besten Gene einer Generation nicht verlorengehen. Dies ist besonders dann relevant, wenn alle generierten Nachkommen und Mutanten schlechter als die besten Individuen der Elterngeneration sind. Zudem erlaubt dieses Verfahren die Überprüfung der (experimentellen) Reproduzierbarkeit.

Fig. 6 zeigt die beiden Selektionsarten schematisch im Vergleich. Anders als bei einem üblichen Rouletterad wird bei der ball bearing-Methode ein Kugellager um das Rouletterad gedreht, wobei das Kugellager aus soviel Kugeln besteht, wie Individuen in die nächste Generation übernommen werden sollen. Die Kugeln haben zu ihren Nachbarn alle den gleichen Abstand, das Rad wird nur einmal gedreht. Dadurch wird eine höhere Gleichverteilung als bei einem gewöhnlichen Rouletterad erreicht.

5. Reproduktion, Mutation und nächste Generationen

Die Mechanismen von crossing-over und Mutation sind in Fig. 7 schematisch dargestellt. Die oben ermittelten Individuen, die sich in ihrer Umgebung behaupten konnten, werden jetzt in der Weise miteinander gepaart, dass je zwei Bit-Ketten an beliebiger, aber gleicher Stelle auseinanderbrechen, die Bruchstücke vertauscht werden und jeweils mit dem fremden Bruchstück wieder verwachsen. Dieser Vorgang wird als crossing-over bezeichnet und ist dem Vorgang des crossing-over der Chromosomen von Ei und Samenzelle in der Natur analog. Um eine Evolution in nur eine Richtung zu verhindern, können die neuen Genotypen zusätzlich durch vereinzelte Punktmutationen verändert werden. Innerhalb eines string wird eine 1 gegen eine 0 ausgetauscht oder umgekehrt. Auf diese Weise können zwar gute Gene zerstört werden, es ermöglicht aber auch das Vordringen in neue Parameterbereiche, die bisher nicht untersucht wurden und unter Umständen das Auffinden neuer Optima überhaupt erst ermöglichen.

Mutationen dürfen nicht zu häufig auftreten. Finden sie zu oft statt, führt dies zu einer permanenten Auslöschung guter Gene innerhalb des Genpools. Treten sie zu selten auf, kann dies in einer sogenannten "Sackgassenevolution" enden, wo nur ein lokales Optimum der Zielfunktion gefunden wird.

Die Crossing-over-Rate gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit zwei Individuen, die per Zufallsgenerator als mögliche crossing-over Partner (Eltern) gewählt wurden, auch wirklich ihre Gene teilweise austauschen. Diese Rate kann prinzipiell jeden Wert annehmen, sinnvoll sind jedoch Werte im Bereich 0,9 bis 1,0.

Die Mutationsrate gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der ein Bit eines Gens mutiert, d. h. sein Wert von 0 auf 1 bzw. umgekehrt wechselt. Auch diese Rate kann prinzipiell jeden Wert annehmen; als sinnvoll haben sich Werte von 0,01 bis 0,1 erwiesen.

Die so erzeugte zweite Generation muss sich nun wieder in der Umgebung behaupten. Zur Generierung aller weiteren Generationen folgen anschließend beliebig viele Zyklen von Bewertung (Selektion), Reproduktion und Mutation.

Beispiel 1

Im Folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielhaft anhand der experimentellen Optimierung einer Trennmethode für sechs Nucleotide erläutert. Das Prinzip der Vorgehensweise ist in Fig. 8 in einem Blockdiagramm dargestellt.

Die Nucleotide ATP (Adenosintriphosphat), ADP (Adenosindiphosphat), AMP (Adenosinmonophosphat), cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat), NAD (Nicotinamidadenindinucleotid), NADP (Nicotinamidadenindinucleotidphosphat) sind chemische Verbindungen, die im Stoffwechsel aller lebenden Zellen entscheidende Funktionen übernehmen. Die Analyse dieser Verbindungen wird erschwert durch den z. T. sehr ähnlichen Molekülbau und die chemisch sehr ähnlichen Eigenschaften.

Vor Beginn der Optimierung müssen die Versuchsparameter, Parameterbereiche, Zielgröße und Bewertungskriterien festgelegt werden.

Aufgabe der Optimierung ist es, die 6 Analyten elektrophoretisch optimal aufzutrennen. Die Trenngüte ("Bewertungskriterium") wird in diesem Beispiel als Produkt aus Retentionszeitdifferenz Δt_i zwischen den Einzelpeaks und theoretischer Bodenzahl TP_i eines Einzelpeaks definiert. Für jeden Versuch (d. h. jedes Mitglied einer Generation) werden diese Faktoren der Einzelpeaks zu einer Gesamttrenngüte aufsummiert. Es wird ein Maximum dieser Gesamttrenngüte ("Zielgröße") angestrebt, d. h. also eine maximale Trennung der Peaks voneinander bei gleichbleibender theoretischer Bodenzahl (als Maß für die Qualität eines Peaks). Damit ergibt sich für die Trenngüte folgende Gleichung:

Fig. 9 zeigt beispielhaft an einem Analysespektrum die Definition der in der Formel vorkommenden Größen.

Es wurden 6 Parameter ausgesucht, welche einen Einfluss auf die elektrophoretische Trennung besitzen: Injektionszeit, Trennspannung der kapillarelektrophoretischen Methode, pH des Trennpuffers, Konzentration des Puffers, Temperatur während der kapillarelektrophoretischen Trennung und überlagerter Druck während der kapillarelektrophoretischen Trennmethode. Für diese Parameter wurden Variationsbereiche festgelegt, innerhalb welcher der Wert dieses Parameters während des Optimierungsprozesses schwanken darf (siehe Tabelle 1). Beispielsweise wird der Parameter Injektionszeit in einem Bereich von 5 bis 20 Sekunden variiert, und zwar in 4 Schritten, d. h. es sind zulässig die Werte: 5, 10, 15, 20 Sekunden. Diese Information belegt 2 bits auf dem "Chromosomenstrang" des genetischen Algorithmus. Das "Chromosom" des vollständigen Parametersatzes eines Versuches ist in Fig. 10 gezeigt.

Tabelle 1

Versuchparameter und Variationsbereiche

In Tabelle 2 sind beispielhaft die Parameter der ersten Versuchsgeneration aufgelistet. Die erste Spalte (Versuch) enthält den Namen des jeweiligen Versuchs, aufgeschlüsselt nach Generation (g) und Mitglieder der Generation (m).

Somit ist "g1m1" das erste Mitglied von Generation 1. In den folgenden Spalten sind die Parameter des jeweiligen Versuchs aufgelistet, in diesem Beispiel Injektionszeit, Trennspannung der kapillarelektrophoretischen Methode, pH des Trennpuffers, Konzentration des Puffers, Temperatur während der kapillar elektrophoretischen Trennung und überlagerter Druck während der kapillar elektrophoretischen Trennmethode. Letzterer Parameter geht als verschlüsselter Parameter in die Optimierungsmethode ein, d. h. nicht der wahre Wert des Parameters (in diesem Falle der Druck), sondern eine Variable, die einem bestimmten Parameterwert zugeordnet wird. In der folgenden Spalte ist diese Variable aufgeschlüsselt. Der Variablenwert 2 entspricht hier einem Druck von ca. 0,007 bar (0,1 psi). Auf diese Weise können nichtlineare Zuordnungen von Parametern getroffen werden, wie ja auch der pH-Wert ein nichtlinearer Parameter ist.

Mit den in Tabelle 2 angegebenen Versuchsparametern wurden die ersten 16 Experimente durchgeführt (Fig. 8), d. h. es werden die Trennpuffer in den jeweils angegebenen Konzentration und mit dem jeweils angegebenen pH-Wert angesetzt und die kapillarelektrophoretische Trennmethode mit den Parametern Injektionszeit, Trennspannung, Temperatur und Druck programmiert. Die 16 Versuche werden in Mehrfachansätzen durchgeführt und die Resultate, d. h. die Elektropherogramme ausgewertet.

Tabelle 2 (0,1 psi = 0,007 bar)

Die Elektropherogramme wurden ausgewertet nach Anzahl der Peaks und Retentionszeit, bzw. theoretische Bodenzahl der einzelnen Peaks. In diesem Beispiel wurden alle Versuche verworfen ("ausselektioniert"), welche weniger als die erwarteten 6 Peaks (entsprechend der 6 eingesetzten Analyten) enthielten. Somit findet eine erste Selektion statt, indem zu den "überlebenden" Mitglieder einer Generation nur solche zählen, welche alle 6 erwarteten Peaks aufweisen.

In einem zweiten Selektionsschritt wurden die noch überlebenden Mitglieder einer Generation nach der Trenngüte (s. Gleichung oben) eingestuft. D. h. es wird für jedes Mitglied einer Generation eine Trenngüte berechnet, anhand welcher eine Aussage über die Qualität der Trennung gemacht werden kann. Mittels dieses zweiten Selektionschrittes werden Versuche mit "guter" Trennung gegenüber solchen mit "schlechter" Trennung bevorzugt und in der nächsten Iterationsrunde des genetische Algorithmus bevorzugt.

In Tabelle 3 sind exemplarisch die Resultate für die Versuche der 1. Generation dargestellt. Versuche, welche nicht die geforderte Anzahl von 6 Peaks aufwiesen, sind mit "0.00" bewertet worden und fallen von vornherein für die weitere Optimierung weg (z. B. g1m2, g1m4, etc.).

Tabelle 3

Versuch
Trenngüte
g1m1	79.63
g1m2	0.00
g1m3	8.86
g1m4	0.00
g1m5	0.00
g1m6	0.00
g1m7	60.17
g1m8	0.00
g1m9	0.00
g1m10	0.00
g1m11	0.00
g1m12	0.00
g1m13	0.00
g1m14	0.00
g1m15	0.00
g1m16	47.79

Aus den Parametern der erfolgreichen Versuche, in diesem Fall g1m1, g1m3, g1m7 und g1m16, und den entsprechenden Trenngüten als Qualitätskriterium wurden durch den genetischen Algorithmus die nächste Generation, d. h. die Parameter für die Versuche der nächsten Generation, berechnet. Die Wahrscheinlichkeit einer Punktmutation lag bei 0.05; die eines Crossovers bei 0.95. Es wurde automatisch das beste Mitglied der letzen Generation in die nächste übernommen. Fernerhin haben die übrigen "erfolgreichen" Mitglieder gleiche Chancen, in die nächste Generation übernommen zu werden (ball-bearing Methode). Nach diesem Schema (siehe Fig. 8) wurde fortgefahren, bis ein Abbruchkriterium erreicht wurde, in diesem Falle eine zufriedenstellende elektrophoretische Trennung der 6 Analyten.

In dem beschriebenem Beispiel ist die Optimierung der elektrophoretischen Trennmethode über einen Optimierungszeitraum von 4 Generation erfolgt (siehe Fig. 11). Anhand der Trenngüte läßt sich der Gang und der Erfolg der Optimierung gut nachverfolgen.

Fernerhin erlaubt eine Analyse der Parameterentwicklung (Fig. 12-14), d. h. die Veränderung der einzelnen Parameter bei steigender Trenngüte, einen Rückschluß auf relevante Parameter. Es kann so in zukünftigen oder weiterführenden Optimierung verstärkt auf wichtige Parameter, d. h. Parameter mit einem großen Einfluss auf die Trenneigenschaften des jeweiligen Systems, eingegangen werden. Parameter, welche im Verlauf der Optimierung konstant bleiben können als "unwichtig" angesehen werden, d. h. sie haben keinen oder nur einen geringen Einfluss auf die Trenneigenschaften. Sie können in zukünftigen oder weiterführenden Optimierungen außer Acht gelassen werden. Die Optimierung mittels des genetischen Algorithmus erlaubt somit auch eine Aussage über die Relevanz einzelner Parameter auf das Gesamtsystem.

Beispiel 2

Ein zweites Beispiel betrifft die Trennung der Enantiomere von 2-Acetylamino-3- phenyl-propionsäure von 2-Acetylamino-3-phenyl-acrylsäure, die als Modellsystem für die chirale Trennung von Aminosäurederivaten aufgefasst werden kann. Die Strukturformeln dieser Verbindungen lauten folgendermaßen:

Das zugrundeliegende Reaktionssystem ist eine Standardreaktion für die homogenkatalytische Hydrierung von aktivierten Doppelbindungen.

Die chirale Trennung mittels CE wird durch chirale Selektoren erreicht. Diese werden als Trennpufferzusätze eingesetzt, gebräuchlich sind dabei vor allem Cyclodextrine, deren Löslichkeit durch Derivatisierung erhöht wird. Die unterschiedlichen Komplexbildungskonstanten der Enantiomere mit dem chiralen Selektor bewirken unterschiedliche effektive Wanderungsgeschwindigkeiten der Enantiomere im elektrischen Feld. Der Einfluß der chiralen Selektoren auf den EOF, die Stromstärke und auf andere Faktoren ist schwer vorherzusagen.

Anhand des vorgestellten Modellsystems konnte eine Optimierung der Trennung mittels genetischem Algorithmus erreicht werden.

Die Optimierung wurde mit den in der Tabelle angegebenen Variationsbreiten der Parameter durchgeführt:

Eine Vorselektionierung wurde in der ersten Generation mit einer weiteren Kapillare (50 µm) ausgeführt. Die Elektropherogramme wurden auf einer Skala von 0-3 bewertet. Dieses Ergebnis diente zur Erzeugung der zweiten Generation. Die Experimente der zweiten Generation wurden in einer 0.25 µm Kapillare ausgeführt. Die Individuen der zweiten Generation wurden mit einem Bewertungskriterium der Form:

bewertet mit:
n = Anzahl der detektierten Peaks,
t_n = Retentionszeit des n-ten Peaks, und
TP_i = die Anzahl der theoretischen Böden (s. o).

Die relativ Retentionszeit oder der Trennfaktor ist der Quotient der Retentionszeiten zweier Peaks, in Fig. 9 also der Quotient t₂/t₁. Diese Summe wird für jeden Peak im Elektropherogramm in Bezug auf die vorhergehenden gebildet, für die im Beispiel erwarteten drei Peaks ergeben sich also maximal 3 Summanden, wie die folgende Gleichung exemplarisch zeigt:

Im Gegensatz zum ersten Beispiel wurden die Chromatogramme auch dann ausgewertet, wenn nicht die erwartete Anzahl von drei Peaks gefunden wurde. Es ergaben sich dann bei zwei Peaks nur ein Summand, und für nur einen Peak ist die Summe definitionsgemäß null. Man erreicht dadurch, dass eine Trennung der chemisch unterschiedlichen Substanzen auch dann in die nächste Generation übernommen wird, wenn keine Trennung erreicht wurde. Die Summe der theoretischen Böden ist analog zu oben definiert.

Die Durchführung der Experimente erfolgte analog zu oben, und wurde zunächst für vier Generationen durchgeführt. Die Gütefunktion während der Durchführung des Optimierungsverfahrens nimmt für das beste Individuum zu, wie die Entwicklung der Gütefunktion in Fig. 15 zeigt.

Claims

1. Verfahren zur Optimierung der Parameter eines Trennungsverfahrens für Stoffgemische, insbesondere eines kapillarelektrophoretischen Verfahrens, in Hinblick auf ein vorgegebenes Bewertungskriterium, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Menge von verschiedenen Parametersätzen erzeugt wird,
b) zu jedem Parametersatz der Menge experimentell der zugehörige Wert des Bewertungskriteriums bestimmt wird,
c) durch Anwendung eines genetischen Algorithmus unter Beachtung der bestimmten Werte des Bewertungskriteriums eine neue Menge von Parametersätzen bestimmt wird, und
d) die Schritte b) und c) wiederholt werden, bis ein Abbruchkriterium erfüllt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bewertungskriterium eine Funktion der Abstände zwischen Peaks im Analysespektrum und/oder der Breite der Peaks ist, wobei letztere vorzugsweise durch die Halbwertsbreite und insbesondere die theoretische Bodenzahl der Peaks ausgedrückt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bewertungskriterium definiert ist, als der Wert
bewertet mit:
n = Anzahl der detektierten Peaks,
t_n = Retentionszeit des n-ten Peaks, und
TP_i = die Anzahl der theoretischen Böden (s. o).

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bewertungskriterium definiert ist als der Wert
wobei
n = Anzahl der beobachteten Peaks;
Δt_i = t_i+1 - t_i
t_i = Retentionszeit des Peaks Nr. i;
w_i 50% = Breite des Peaks Nr. i auf 50% seiner maximalen Höhe;
α_i = Gewichtungsfaktor
oder als: zweite Gütefunktion

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zu den optimierten Parametern die Trennspannung, die Trenntemperatur, die Pufferkonzentration, die Pufferzusammensetzung, die Konzentration von Lösungsvermittlern, die Konzentration von Selektoren wie insbesondere von chiralen Selektoren, die Injektionszeit, der pH-Wert des Puffers, der Wert des überlagerten Druckes, die Säulenmaterialien und/oder die Säulendimensionen wie insbesondere Säulenlänge und Säulendurchmesser gehören.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Selektionsschritt des genetischen Algorithmus diejenigen Parametersätze aussortiert werden, die im Analysespektrum eine kleinere Anzahl an Peaks als andere Parametersätze aufweisen.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwischenergebnisse einschließlich der gemessenen Bewertungskriterien in einer Datenbank gespeichert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch Auswertung der Datenbank die Relevanz von Parametern für das Bewertungskriterium festgestellt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Auswertung der Datenbank ein optimaler Parametersatz in Hinblick auf ein zweites Bewertungskriterium ermittelt wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es vor oder nach einem anderen Verfahren zur Optimierung der Verfahrensparameter ausgeführt wird.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es automatisiert durchgeführt wird.