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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung einer chemischen oder
biologischen Verbindung, die in einer Mischung von ähnlichen
Verbindungen vorhanden ist, durch Diffusion in einem geeigneten
Medium, wie einem Gel.
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Die
bekannten Verfahren zur Trennung einer Verbindung, die in einer
Mischung vorhanden ist, weisen im Allgemeinen das Anwenden einer
chemischen Reaktion (im weiten Sinn) und/oder einer Gesamtheit von äußeren Kräften auf
die Mischung von Verbindungen auf. In WO 99/45374 wird zum Beispiel
die Trennung eines Analyts von anderen Bestandteilen einer Probe
durch ein Elektrophoreseverfahren durch Affinität beschrieben. Die Affinitätschromatographien
ermöglichen
es, aus einer Mischung von Molekülen
die am meisten zurückgehaltenen
oder die am wenigsten zurückgehaltenen
Moleküle
an den Plätzen
der Wechselwirkung, die mit dem Chromatographieträger verbunden
sind, zu extrahieren, da diese Moleküle privilegierte Positionen
belegen, am Kopf und am Ende der Elution. Jedoch ist es schwierig,
insbesondere, wenn die Mischung etwa 10 oder mehrere ähnliche
Verbindungen enthält,
die Verbindungen mit dazwischen liegender Affinität zu isolieren, sehr
schwierig, die Verbindungen mit quantitativ definierter Affinität zu isolieren,
und unmöglich,
Verbindungen zu trennen, deren Affinitäten identisch sind, die aber
unterschiedliche kinetische Konstanten der Wechselwirkung aufweisen.
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Das
Problem der Trennung von Verbindungen, die in einer Mischung vorhanden
sind und kinetische Konstanten der Wechselwirkung, die durch einen
Bediener willkürlich
definiert sind, für
ein gegebenes Ziel haben, stellt sich insbesondere im Rahmen der
Entwicklung neuer therapeutischer Behandlungen, die auf der Optimierung
der Wechselwirkung von Molekülen
mit Zielen von biologischer Bedeutung beruhen, welche geeignet gewählt sind
(genomische Sequenzen, Proteine, ...) und im Bereich der kombinatorischen
Chemie, wo die getesteten Moleküle
oft in Form von "kontrollierten" Mischungen mit ähnlichen
Molekülen
erhalten werden.
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Die
vorliegende Erfindung hat insbesondere zum Ziel, für dieses
Problem eine einfache, wirksame und relativ leicht zu verwendende
Lösung
zu finden.
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Zu
diesem Zweck wird ein Verfahren zur Trennung einer chemischen oder
biologischen Verbindung offenbart, die in einer Mischung von ähnlichen
Verbindungen vorhanden ist, durch Diffusion in einem Medium wie
einem Gel, wobei das Verfahren einen Schritt des Einführens der
Mischung von Verbindungen in das Medium aufweist, dadurch gekennzeichnet,
dass es darin besteht:
- – die Verbindungen Ci der Mischung mit einem Bestandteil P, der
in dem Medium vorhanden ist, in dem Medium reagieren zu lassen,
um Produkte Qi zu erhalten, wobei die Reaktionen
Ci + P → Qi reversibel sind und kinetische Konstanten
k1,i in der Richtung des Erhaltens der Produkte
Qi und k2,i in der
umgekehrten Richtung aufweisen, und
- – auf
das Medium ein Feld anzuwenden, das periodisch mit der Zeit variiert
und auf das die Verbindungen Ci ansprechen,
wobei die Periode des Felds und die Konzentration des Bestandteils
P in dem Medium als Funktion der kinetischen Konstanten k1, k2 der zu trennenden
Verbindung C bestimmt werden, um Bedingungen der Resonanz zwischen
den vorgenannten Reaktionen und dem Feld aufzustellen, für welche
die Verbindung C einen sichtbaren Diffusionskoeffizienten in dem
Medium aufweist, welcher ein maximaler Wert ist.
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Gemäß der Erfindung
ermöglicht
die Kenntnis der kinetischen Konstanten der Reaktion einer Verbindung
C mit einem Ziel, eine Konzentration des Ziels in dem Medium und
eine Periodizität
des Felds zu bestimmen, für
welche der sichtbare Diffusionskoeffizient der Verbindung maximal
und wesentlich höher
als die sichtbaren Diffusionskoeffizienten der anderen Verbindungen
ist, derart, dass die Verbindung deutlich von den anderen durch
Diffusion in dem Medium getrennt wird.
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Selbst
wenn die Verbindungen, die in der Mischung vorhanden sind, in dem
Medium im Wesentlichen das gleiche Verhalten aufweisen und sich
voneinander nur durch die kinetischen Konstanten der Wechselwirkung
mit einem zuvor definierten Ziel unterscheiden, ermöglicht das
Verfahren gemäß der Erfindung,
eine Zielkonzentration in dem Medium und eine Periode des auf das
Medium angewendeten Felds zu bestimmen, für welche der sichtbare Diffusionskoeffizient
in dem Medium der zu trennenden Verbindung als Folge einer stochastischen
Resonanz zwischen den Reaktionen und dem angewendeten Feld maximal
ist.
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Wenn
sich zum Beispiel eine der kinetischen Konstanten der zu trennenden
Verbindung C von jenen der anderen Verbindungen der Mischung um
eine Größenordnung
unterscheidet, wobei die anderen charakteristischen Merkmale der
Verbindung identisch oder ähnlich
sind, ist der sichtbare Diffusionskoeffizient der Verbindung C in
dem Medium wenigstens 3,5 Mal größer als
jener der anderen Verbindungen der Mischung, was nicht nur ermöglicht,
diese von den anderen Verbindungen durch Diffusion zu trennen, sondern
gleichermaßen
diese aus dem Medium mit einer bedeutenden Ausbeute und einem relativ
hohen Reinheitsgrad aus dem Medium zu extrahieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das auf das Medium angewendete Feld ein elektrisches
Feld und das Verfahren wird in Form einer herkömmlichen Elektrophoresevorrichtung
verwendet, welche zum Beispiel einen mit dem Elektrolyt gefüllten Behälter aufweist
und in welchem eine Schicht eines geeigneten Gels angeordnet wird,
wobei Elektroden, die in dem Behälter
um die Gelschicht angeordnet sind und mit einem Netzteil verbunden
sind, es ermöglichen,
ein gleichförmiges
elektrisches Feld in dem Raum anzuwenden, welches periodisch mit
der Zeit zu der Gelschicht variiert.
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In
einer Variante ist das vorgenannte Feld ein Geschwindigkeitsfeld
in dem Medium, und das Verfahren wird in einem Chromatographieapparat
zum Beispiel der Art HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
verwendet, in welchem ein homogenes Geschwindigkeitsfeld eines inerten
Trägerfluids
in dem Medium mittels einer oder zweier Pumpen erzeugt wird.
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Die
Erfindung wird besser verständlich,
und andere charakteristische Merkmale, Details und Vorteile derselben
werden genauer offensichtlich beim Lesen der folgenden Beschreibung,
die zu Beispielzwecken und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
gemacht wird, in welchem:
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1 schematisch
Mittel zur Verwendung der Erfindung in der bevorzugten Ausführungsform
darstellt, wo das auf das Medium angewendete Feld ein elektrisches
Feld ist;
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2 ein
Graph ist, der die Variationen des Verhältnisses der sichtbaren und
der Selbst-Diffusionskoeffizienten
einer Verbindung C als Funktion eines Parameters A, welcher der
Amplitude des Felds entspricht, unter Resonanzbedingungen und unter
unterschiedlichen Bedingungen darstellt;
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3 ein
Graph ist, welcher die Variation des Verhältnisses der sichtbaren und
der Selbst-Diffusionskoeffizienten als Funktion der Werte der Parameter,
die den kinetischen Konstanten der Reaktion der Verbindung entsprechen,
darstellt;
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4 ein
Graph ist, welcher die Variationen der Reinheit und der Ausbeute
in dem Fall der reinen Diffusion einer gleichmolaren Mischung zweier
Verbindungen mit unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten als Funktion
eines Parameters ohne Dimension darstellt.
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In
der schematischen Darstellung der 1, welche
eine Ausführungsform
der Erfindung betrifft, in welcher das Verfahren mittels einer Elektrophoresevorrichtung
verwendet wird, kennzeichnet die Bezugsziffer 10 eine Schicht
eines Mediums wie beispielsweise Gel, zum Beispiel Agarosegel, ein
häufig
für Elektrophorese verwendeter
Typ.
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Die
Gelschicht 10 wird in einem Elektrophoresebehälter 12 angeordnet,
dessen Kontur gestrichelt dargestellt ist und in welchem Elektrodenreihen 14 angeordnet
sind, die zum Beispiel aus elektrisch leitenden Drähten gebildet
sind, die sich senkrecht zur Zeichnungsebene erstrecken.
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Die
Elektroden 14 sind zum Beispiel um die vier Seiten der
Gelschicht 10 angeordnet und sind mit Stromkreisen 16 zur
elektrischen Versorgung verbunden, die wiederum mit Steuermitteln 18 verbunden
sind, die gegebenenfalls per Computer gesteuert werden.
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Die
Mittel 16 zur Versorgung und 18 zur Steuerung
ermöglichen
es, auf die Gelschicht 10 ein elektrisches Feld anzuwenden,
welches periodisch mit der Zeit variiert und welches im Wesentlichen
gleichförmig
im Raum ist, das heißt,
welches gleich ist an jedem Punkt der Gelschicht 10, wobei
das elektrische Feld zum Beispiel in der Ebene der Gelschicht ausgerichtet
ist, in der durch die Pfeile E angezeigten Richtung.
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Diese
Technik ist in der Elektrophorese bekannt und in den Schriften WO
84/02001 und
US 5 084 157 beschrieben,
auf welche sich für
mehr Details bezogen werden kann.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
unterscheidet sich von bekannten Elektrophoresetechniken im Wesentlichen
darin, dass die Elektrophorese, welche aus der Anwendung eines periodischen
elektrischen Felds auf eine Mischung von Verbindungen resultiert,
in einem Reaktionsmedium stattfindet, und darin, dass das elektrische
Feld periodisch um einen mittleren Wert null variiert.
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Gemäß der Erfindung
wird ein Medium
10 verwendet, welches eine bestimmte Konzentration
eines Bestandteils P enthält,
der mit den Verbindungen reagiert, die in der eingegebenen Mischung
an einem Punkt des Mediums
10 enthalten sind, wobei die
Verbindungen C
i dieser Mischung mit dem
Bestandteil P reagieren, um Produkte Q
i zu
bilden, die sich wiederum in anfängliche
Produkte C
i und P zersetzen, wie unten angegebenen:
wobei k
1,i und
k
2,i kinetische Konstanten der Reaktionen
in einer Richtung und der umgekehrten Richtung sind und von einer
Verbindung C
i zur anderen variieren, wobei
k
1,i eine Anzahl von Reaktionen pro Konzentrationseinheit
und pro Zeiteinheit ist und wobei k
2,i eine
Anzahl von Reaktionen pro Zeiteinheit ist.
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In
der Folge wird der schwierigste Fall angenommen, in dem die Verbindungen
Ci, welche die in das Medium 10 eingegebene
Mischung bilden, die gleiche Masse m, die gleiche elektrische Ladung
z, den gleichen Reibungskoeffizienten γ in dem Medium und den gleichen
Diffusionskoeffizienten D in diesem Medium aufweisen. Von dem Bestandteil
P, welcher in dem Medium 10 vorhanden ist, wird angenommen,
dass er gegenüber dem
elektrischen Feld unempfindlich ist und unbeweglich oder schwach
in dem Medium 10 diffundieren kann, entweder, weil er durch
Kovalenz gebunden ist, oder weil seine Dimension die Bewegung im
Medium 10 beschränkt.
Die Verbindungen Qi können beweglich sein unter der
Bedingung, dass sie eine Reaktion auf die Aktion des Felds aufweisen,
die von jener der Verbindungen Ci verschieden
ist.
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Es
wird gleichermaßen
angenommen, dass die Konzentration des Bestandteils P im Wesentlichen
in dem Medium 10 einheitlich ist und in diesem Medium im
Wesentlichen während
der gesamten Trennung konstant gehalten wird.
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Wenn
das auf das Medium
10 angewendete elektrische Feld eine über die
Zeit sinusförmige
Variation ist und zum Beispiel der Form E(t) = acos(ωt) ist,
kann der mittlere Wert
x c(t) und die Varianz σ 2 / c(t) der Position x der Verbindung
C entlang einer zu dem auf das Medium
10 angewendeten elektrischen
Feld parallelen Achse berechnet werden:
und gleichermaßen:
wobei:
- A
- = za/mγ eine nachkalibrierte
Amplitude des elektrischen Felds ist,
- c1
- = k1 p,
wobei p die Konzentration von P in dem Medium 10 ist
- c2
- = k2
- c1 und
c2
- in s–1 ausgedrückt sind.
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Obwohl
das angewendete elektrische Feld im Mittel null ist, oszilliert
die mittlere Position der Verbindungen C
i und
Q
i um einen unterschiedlichen Ausgangswert
auf Grund der Asymmetrie der Anfangsbedingungen, wobei das System
teilweise die erste Auslenkung des elektrischen Felds beibehält. Wenn
die konstanten Terme und die oszillierenden Terme vernachlässigt werden
und P und Q
i als unbeweglich angenommen
werden, reduziert sich die Varianz der mit den Verteilungen C
i(x,t) und Q
i(x,t)
verbundenen Positionen nach einem sehr kurzen vorübergehenden
Zustand zu:
wobei Da der sichtbare Diffusionskoeffizient
eines Paars C
i, Q
i ist
und D der Selbstdiffusionskoeffzient der Verbindung C
i ist.
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Wenn
die Amplitude des elektrischen Felds ausreichend dafür ist, dass
die unten stehende Beziehung erfüllt
wird:
dann ist die sichtbare Diffusion
nicht von D abhängig
und wird einzig durch die chemischen Reaktionen und das elektrische
Feld gesteuert, wobei der sichtbare Diffusionskoeffizient durch
die nachfolgende Beziehung gegeben wird:
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In
diesem Fall ist A = za/mγ,
wenn die Qi unbeweglich sind, oder A = za/mγ – zQ a/mQγQ,
wobei zQ die Ladung ist, welche die Qi beitragen, mQ die
Masse von Qi ist und γQ der
Reibungskoeffizient von Qi ist, wenn die
Qi beweglich sind.
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Dieser
sichtbare Diffusionskoeffizient kann einen willkürlich großen Wert annehmen, der durch
den nachkalibrierten Amplitudenwert A des elektrischen Felds definiert
wird.
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Der
sichtbare Diffusionskoeffzient ist eine Funktion von c1 und
c2 und weist ein einziges Maximum auf (wenn
das elektrische Feld eine ausreichende Amplitude hat), welches erhalten
wird für:
c R / 1 = c R / 2 = ω/2
oder auf äquivalente
Weise: k R / 1·p
= k R / 2 = π/T,
wobei der Exponent R eine Resonanzbedingung ausdrückt und
T die Periode des elektrischen Felds ist.
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In 2 stellt
die Vollstrichkurve die Variation des Verhältnisses Da/D
als Funktion von A zu der Resonanz dar, die Kurve in langen Strichen
stellt die Variation dieses Verhältnisses
als Funktion von A für
die kinetischen Konstanten k R / 1 und k R / 2/10 dar, die Kurve mit kurzen
Strichen stellt die Variation dieses Verhältnisses als Funktion von A
für die
kinetischen Konstanten 10k R / 1, 10k R / 2 dar, und die gepunktete Kurve stellt
die Variation dieses Verhältnisses
für die
kinetischen Konstanten gleich 10k R / 1 und k R / 2 dar.
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3 stellt
die Variation des Verhältnisses
Da/D als Funktion von Logarithmen zur Basis
10 von c1 und c2 dar,
wobei das Maximum der Variation den vorgenannten Resonanzbedingungen
entspricht.
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Betrachtet
man die chemischen Reaktionen als zufällige Ereignisse, sind die Übergänge zwischen
Ci und Qi stochastische
Ereignisse und das Maximum des Werts Da wird
für Bedingungen
erhalten, der einer stochastischen Resonanz zwischen den chemischen
Reaktionen und dem auf das Medium 10 angewendeten elektrischen
Feld entspricht.
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Es
ist diese Resonanz, die sich durch einen maximalen Wert des sichtbaren
Diffusionskoeffizienten einer Verbindung C ausdrückt, welche es ermöglicht,
die Verbindung C von den anderen Bestandteilen Ci,
die in der Mischung vorhanden sind, zu trennen. Es kann insbesondere berechnet
werden, dass, wenn eine der kinetischen Konstanten einer Verbindung
Ci gleich der kinetischen Konstante der
Verbindung C ist, für
welche es Resonanz gibt, und dass die andere kinetische Konstante
der Verbindung Ci sich um einen Faktor 10 von der
anderen kinetischen Konstante der Verbindung C unterscheidet, der
sichtbare Diffusionskoeffizient der Verbindung Ci ungefähr 3,5 Mal
schwächer
ist als jener des Bestandteils C.
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Diese
Diffusionsdifferenz ermöglicht
es, die Verbindung C von den ähnlichen
Bestandteilen Ci gut zu trennen, selbst
wenn die Letztgenannten im Wesentlichen die gleiche elektrische
Ladung, die gleiche Masse und den gleichen Reibungskoeffizienten
wie C aufweisen oder auch im Wesentlichen das gleiche Verhältnis z/m·γ wie C (wobei
der Wert von A im Wesentlichen für
alle diese Bestandteile der gleiche ist) und sich voneinander durch
wenigstens den Wert einer kinetischen Konstante der Reaktion mit
dem Bestandteil (P) unterscheiden.
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Das
auf das Medium
10 angewendete elektrische Feld kann periodisch
mit der Zeit auf eine beliebige Weise variieren: die Variation kann
sinusförmig,
zackenförmig
oder anders sein. Die größte Diffusion
der Verbindung C, welche den Resonanzbedingungen entspricht, ermöglicht es,
diese von den anderen Verbindungen C
i der
Mischung zu trennen und diese teilweise an den Enden des Verteilungsprofils
in dem Medium
10 wiederzugewinnen. Es kann in dem Fall
der Reindiffusion einer Mischung zweier Verbindungen (C
1,
C
2), welche die gleiche Konzentration und
unterschiedliche Selbstdiffusionskoeffizienten haben, eine Reinheit
und einen Ausbeute des Wiedergewinnens der Verbindung C
1 durch
die folgenden Formeln berechnet werden:
wobei: N die Menge der in
das Medium
10 eingegebenen Verbindung C
1 zur
Zeit t = 0 am Punkt x = 0 ist,
I das Integral der Konzentration
C
1 (x, t) zwischen x und unendlich ist,
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In 4 ist
die Variation der Reinheit S und der Ausbeute R als Funktion von α dargestellt.
In dieser Figur wird ersichtlich, dass, indem eine gewünschte Reinheit
gewählt
wird, der Wert von α bestimmt
werden kann und somit jener von x, von welchem ausgehend die Verbindung
C gewonnen werden kann, sowie die Ausbeute, die zu erhalten gewünscht wird.
Wenn die Diffusionskoeffizienten der beiden Verbindungen C1 und C2 sich in
einem Verhältnis
von 3,5 unterscheiden, können
25 % der Verbindung C1 abgefangen werden
mit einer Reinheit von 90 % für α1 =
0,85.
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Nachfolgend
wird kurz ein Anwendungsbeispiel der Erfindung beschrieben, welches
es ermöglicht,
die Vorstellungen festzulegen. Dieses Beispiel betrifft die chemische
Reaktion der Hybridisierung von DNA-Proben an RNA in Lösung. In
dem Fall von Oligodesoxyribunukleotid-Proben an einer Ziel-RNA,
welche einen primären
Verbindungsplatz der inversen Transkriptase HIV-1 aufweist, ist
der Verbindungsvorgang durch die folgenden Werte gekennzeichnet: 3 × 104 M–1 s–1 ≤ k1 ≤ 106 M–1 s–1 10–3 s–1 ≤ k2 ≤ 2,5·10–2 s–1 D = 3.10–10m2 s–1 2,7·10–18C ≤ z ≤ 5,9·10–18C.
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Die
erste Resonanzbedingung k1·p = k2 ergibt RNA-Konzentrationen in dem Medium 10 zwischen 10–9M
und 10–6M,
die ohne Schwierigkeiten erreicht werden können.
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Die
zweite Resonanzbedingung ω =
2k2 führt
zu einem ω zwischen
2·10–3 s–1 und
5·10–2 s–1 und
ist leicht zu erfüllen.
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Die
letzte Bedingung bezogen auf die Amplitude des elektrischen Felds
ist erfüllt,
wenn diese Amplitude sehr viel größer ist als 4·10–5Vμm–1,
was kein technisches Problem darstellt.
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Indem
die Werte von ω und
p mit den Werten k1 und k2 einer
gegebenen Probe abgestimmt werden, kann diese Probe von den anderen
getrennt werden, indem diese in den stochasti schen Resonanzbedingungen
zwischen der Reaktion des Fixierens an der RNA und dem elektrischen
Feld platziert werden.
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Gemäß einem
weiteren besonders vorteilhaften Aspekt der Erfindung kann gleichermaßen ein nicht-elektrisches
Feld verwendet werden, welches in der Lage ist, auf die Verbindungen
unabhängig
von ihrer elektrischen Ladung zu wirken. Zum Beispiel wird zu diesem
Ziel eine chromatographische Vorrichtung des Typs HPLC verwendet,
in welcher eine oder zwei Pumpen in dem Medium ein homogenes Geschwindigkeitsfeld
erzeugen, das auf periodische Weise mit der Zeit variiert, wobei
diese Geschwindigkeiten vergleichbar sein können mit den Geschwindigkeiten
der Bewegung, die durch Anwendung eines elektrischen Felds erhalten
werden. Die in der vorausgegangenen Beschreibung erwähnte Größe A ist
der Wert der durch die Pumpe in dem Medium erzeugten Geschwindigkeit.
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Des
Weiteren ist es nicht notwendig, dass der Bestandteil P und die
Produkte Qi in dem Medium, welches einem periodischen Feld unterzogen
wird, unbeweglich bleiben, es ist ausreichend, dass die Produkte
Qi auf die Anwendung dieses Feldes auf eine unterschiedliche Weise
reagieren als jene der Bestandteile Ci.
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Auf
allgemeine Weise ist das Verfahren gemäß der Erfindung für die Trennung
von Molekülen
mit einer relativ geringen bis wesentlichen Größe (ungefähr zwischen 10 bis 106 Dalton variierend) von Proteinen, Oligonukleotiden,
Oligosacchariden anwendbar, wobei die Trennung aus der Kombination
in einem Medium einer chemischen Reaktion und einem gleichförmigen beliebigen
Feld mit periodischer Variation mit der Zeit resultiert.
wobei:
