DE10006590A1 - Verwendung funktionalisierter,poröser Membranen zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren - Google Patents

Verwendung funktionalisierter,poröser Membranen zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren

Info

Publication number
DE10006590A1
DE10006590A1 DE10006590A DE10006590A DE10006590A1 DE 10006590 A1 DE10006590 A1 DE 10006590A1 DE 10006590 A DE10006590 A DE 10006590A DE 10006590 A DE10006590 A DE 10006590A DE 10006590 A1 DE10006590 A1 DE 10006590A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
membrane
matrix
nucleic acids
use according
purification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE10006590A
Other languages
English (en)
Other versions
DE10006590B4 (de
Inventor
Thomas Kolzau
Heinz-Gerhard Koehn
Wilhelm Pluester
Mathias Ulbricht
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen North American Holdings Inc
Original Assignee
Eppendorf SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eppendorf SE filed Critical Eppendorf SE
Priority to DE10006590A priority Critical patent/DE10006590B4/de
Priority to US10/182,852 priority patent/US7153433B2/en
Priority to PCT/EP2001/001133 priority patent/WO2001059097A1/de
Publication of DE10006590A1 publication Critical patent/DE10006590A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE10006590B4 publication Critical patent/DE10006590B4/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Verwendung einer funktionalisierten porösen Membran zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, deren Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren über die Bedingungen in einem umgebenden Medium einstellbar sind, wobei die Membran mit deprotonierbaren Gruppen funktionalisiert ist und entsprechende Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine funktionalisierte Membran bzw. Matrix zur Aufreinigung von Nukleinsäuren und auf Verfahren zur Aufreinigung von Nu­ kleinsäuren, bei denen derartige Membranen/Matrizes zum Einsatz kommen.
Gattungsgemäße Membranen sind z. B. aus dem US-Patent 5438128 bekannt. Die hier beschriebenen porösen Polymermembranen, z. B. aus Polypropylen oder Nylon, sind mit Ionenaustauschergruppen funktionalisiert. Bei geringer Ionen­ konzentration binden die funktionalisierten Membranen ionisierte Nukleinsäuren, während eine Elution der gebundenen Nukleinsäuren bei hoher Ionenkonzentrati­ on erfolgt.
Die bekannten Membranen werden in Verfahren bzw. Kits zur Nukleinsäureauf­ reinigung eingesetzt. Üblicherweise wird dabei zunächst das ggf vorgereinigte, die Nukleinsäuren enthaltene Ausgangsmaterial in einem Bindungspuffer mit niedriger Ionenkonzentration durch die poröse Membran gesaugt oder gedrückt.
Beim Passieren der Membran werden die Nukleinsäuren selektiv von den Ionen­ austauschergruppen an der Membranoberfläche gebunden. In einem nächsten Schritt wird die Membran dann ggf. mit einem Puffer höherer Ionenstärke gewa­ schen, um unspezifisch gebundene Verunreinigungen abzutrennen. Die Elution der gebundenen Nukleinsäuren erfolgt dann in einem weiteren Schritt mit einem Puffer noch höherer Ionenstärke.
Nachteilig an der bekannten Methode ist, daß wegen der hohen Salzkonzentration das Eluat vor einer weiteren Aufarbeitung in aller Regel weiter z. B. mittels Etha­ nolfällung oder Dialyse aufgereinigt werden muß.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine bezüglich ihrer Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren schaltbare Membran bzw Matrix für eine einfachere Aufreini­ gung von Nukleinsäuren bereitzustellen sowie auf die Membran bzw. Matrix ab­ gestimmte Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren anzugeben.
Diese Aufgaben werden gemäß der unabhängigen Ansprüche 1, 10, 16, 18 und 19 gelöst.
Die erfindungsgemäß zur Aufreinigung von Nukleinsäuren eingesetzten Mem­ branen weisen als wesentliches Merkmal auf, daß ihre Oberfläche mit deproto­ nierbaren Gruppen funktionalisiert ist. Solche Membranen sind von Ulbricht und Riedel in Biomaterials 19 (1998) 1229-1237 in Verbindung mit der Immobilisie­ rung von Proteinen beschrieben worden. Die erfindungsgemäße Bestimmung, nämlich die Aufreinigung von Nukleinsäuren, ist seinerzeit nicht erwähnt oder angedeutet worden.
Wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten Membranen ist, daß sie aufgrund der Funktionalisierung mit deprotonierbaren Gruppen eine Oberfläche aufweisen, deren Affinität für Nukleinsäuren variabel einstellbar (schaltbar) ist. Wie sich gezeigt hat, lassen sich die Bindungseigenschaften der Membran insbesondere pH-abhängig und/oder in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration reproduzierbar einstellen.
Die Membranen können dabei z. B. zur Reinigung von Nukleinsäuren aus PCR- Ansätzen aber auch generell zur Reinigung von mRNA, Gesamt RNA oder DNA, insbesondere Plasmid-DNA (pDNA) oder genomischer DNA eingesetzt werden.
Das US-Patent 5693785 beschreibt den Einsatz von hydroxylierten Silka-Beads zur Aufreinigung von Nukleinsäuren. Allerdings ist bei den meisten hierin be­ schriebenen Aufarbeitungsprotokollen der Einsatz eines chaotropen Bindungspuf­ fers erforderlich, um eine ausreichende Bindung der DNA an den Silika-Beads zu gewährleisten. In Abwesenheit von chaotropen Bindungspuffern erfolgt eine Bindung nur, wenn die Oberfläche stark elektropositiv geladen ist. Die Möglich­ keit, die Bindungseigenschaften der Oberfläche in Abhängigkeit von den Umge­ bungsbedingungen zu beeinflussen, wird an keiner Stelle angesprochen oder na­ hegelegt.
Bei dem erfindungsgemäßen Einsatz von funktionalisierten Membranen erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren bevorzugt in Abwesenheit von chaotropen Rea­ genz. Die Elution der gebundenen Nukleinsäuren ist unter Niedrigsalzbedingun­ gen und ggf. bei Raumtemperatur möglich, was die Aufarbeitung wesentlich ver­ einfacht. Natürlich ist aber auch eine Aufarbeitung in Gegenwart von chaotropen Reagenzien möglich, falls dies gewünscht ist.
In der Praxis hat sich herausgestellt, daß die Membranen bei einem pH-Wert un­ terhalb oder im Bereich des pK-Wertes ihrer Oberfläche und/oder erhöhter Io­ nenkonzentration gute Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren aufweisen. Verschiebt man den pH-Wert zum alkalischen und/oder erniedrigt man die Ionen­ konzentration des die Membran umgebenden Mediums, so läßt die Affinität der Membran für Nukleinsäuren nach, und unter diesen Umständen ist z. B. die Eluti­ on der gebundenen Nukleinsäuren möglich.
Die Bedingungen, mit denen die Membranen zur Nukleinsäureaufreinigung ein­ gesetzt werden können, lassen sich daher sehr variabel und den unterschiedlichen Anwendungszwecken angepaßt einstellen.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist, daß die Membranen aufgrund ihrer Funk­ tionalisierung hydrophile Oberflächeneigenschaften aufweisen und deswegen sehr gut benetzbar sind. Im Hinblick auf die gute Benetzbarkeit können die Vo­ lumina der eingesetzten Elutionspuffer sehr gering gehalten werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Membranen sind insbesondere mit Sulfonsäu­ re-, Carbonsäure- oder Phosphorsäuregruppen funktionalisiert. Solche Membra­ nen besitzen besonders exakt schaltbare Oberflächeneigenschaften, d. h. ihre Af­ finität zu Nukleinsäuren läßt sich über den pH-Wert und/oder die Ionenkonzen­ tration des umgebenden Mediums gut einstellen.
Zur Ausbildung der erfindungsgemäßen Membran mit schaltbaren Oberflä­ cheneigenschaften genügt es grundsätzlich, die deprotonierbaren Gruppen direkt in bzw. an der Membranoberfläche vorzusehen. Wichtig ist lediglich, daß die Gruppen in Kontakt mit dem umgebenden Medium gelangen und in Abhängigkeit von den Bedingungen in dem Medium in neutralem oder deprotoniertem Zustand vorliegen.
Bevorzugt werden die Gruppen jedoch an Polymerketten, insbesondere z. B. Po­ lyacrylsäure, vorgesehen, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fi­ xiert ist und deren anderes Ende frei beweglich ist.
Membranen in dieser Ausgestaltung können unterschiedliche Grenzflächenzu­ stände einnehmen. Bei einem pH-Wert unterhalb oder im Bereich des pK-Wertes der Membranoberfläche bzw. bei höheren Ionenkonzentrationen (z. B. < 500 mM) liegen die Polymerketten dicht an der Membran an. In diesem Zustand können Nukleinsäuremoleküle besonders effizient an der Membranoberfläche adsorbie­ ren, wobei vermutlich heterogene Wechselwirkungen, wie von der Waals-Kräfte oder hydrophobe aber auch ionische Wechselwirkungen zwischen der Nuklein­ säure und der Polymerkette sowie den funktionellen Gruppen der Polymerkette eine Rolle spielen.
Wird die Membranumgebung dagegen auf einen neutralen bis alkalischen pH- Wert und/oder eine niedrige Ionenkonzentration eingestellt, stehen die Polymer­ ketten von der Membranoberfläche ab. In diesem Zustand lassen sich die gebun­ denen Nukleinsäuren in besonders einfacher Weise von den Polymerketten eluie­ ren, wobei sowohl ionische Wechselwirkungen (die funktionellen Gruppen in den Polymerketten sind negativ geladen und stoßen das ebenfalls negativ gelade­ ne Nukleinsäuremolekül ab) als auch möglicherweise rein mechanische Gründe eine Rolle spielen.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Membranen sind insbesondere aus Kunststoff hergestellt. Bevorzugte Materialien sind Polypropylen, Polyamid, Polyester, Po­ lysulfon oder PVDF. Denkbar ist aber auch, Membranen aus anderen, z. B. anor­ ganischen Materialien wie z. B. Aluminiumoxid, Titanoxid, Zirconoxid oder Sili­ ciumdioxid herzustellen.
Membranen im erfindungsgemäßen Sinne sind alle flächigen Festphasen, die be­ vorzugt eine Schichtdicke von weniger 500 Mikrometer aufweisen. Bevorzugt beträgt der Porendurchmesser 0,2 bis 10 Mikrometer.
Da die erfindungsgemäßen Membranen insbesondere in Hochdurchsatz- Applikationen eingesetzt werden sollen, sieht eine weitere vorteilhafte Ausge­ staltung vor, daß sie zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten, Spin-Säulen oder Re­ aktionsgefäßen konfektioniert sind.
Bislang wurde die Erfindung im Hinblick auf den möglichen Einsatz von Mem­ branen erläutert. Die zugrunde liegenden Prinzipien lassen sich aber auch auf andere zur Trennung von Nukleinsäuren einsetzbare durchströmbare Matrizes anwenden.
Die Erfindung soll daher zusätzlich auch den Einsatz solcher zur Aufreinigung von Nukleinsäuren geeigneten Matrizes abdecken, die mit einer wie oben ange­ sprochenen funktionalisierten Oberfläche ausgestattet sind. Die in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Membran angesprochenen Ausgestaltungen können auch bei solchen Matrizes Anwendung finden.
Eine besonders geeignete Matrix in diesem Zusammenhang wäre z. B. ein Filter. Geeignet wären aber auch Vließ, Filz, Fasern oder Sintermaterial. Als Matrix könnten weiterhin auch entsprechend ausgerüstete Pipettenspitzen oder Reakti­ onsgefäße (Consumables) mit z. B. Mikrostrukturkanälen in Frage kommen.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch Verfahren zur Nukleinsäureaufreinigung, in denen die oben erwähnten Membranen oder Matrizes Anwendung finden können.
In diesem Zusammenhang sind zunächst in drei unabhängigen Ansprüchen je­ weils Verfahrensparameter angegeben, unter denen Nukleinsäuren selektiv ge­ bunden werden können. In der nachfolgenden Erläuterung wird auf Membranen Bezug genommen. Die Ausführungen gelten aber auch sinngemäß für eine durch­ strömbare Matrix.
In einer ersten Variante erreicht man die Nukleinsäurebindung, in dem man eine Lösung des die Nukleinsäuren enthaltenen Ausgangsmaterials in einem Bin­ dungspuffer mit einer Ionenkonzentration von mehr als 100 mM durch die Mem­ bran permeieren läßt, wobei man bevorzugt den pH-Wert auf einen Wert unter­ halb oder im Bereich des pK-Werts der Membran- oder Matrixoberfläche ein­ stellt. Während des Hindurchtretens werden die Nukleinsäuren selektiv von der Membranoberfläche absorbiert.
Besonders bevorzugt wird die Ionenkonzentration des Bindungspuffers auf einen Wert von < 500 mM eingestellt. Bei diesen Werten wurde eine reproduzierbare quantitative Ausbeute beobachtet.
In einer weiteren Variante ist es möglich, daß die Affinität der Membran/Matrix zu Nukleinsäuren über den pH-Wert eingestellt wird. Bei dieser Variante wird ein Bindungspuffer mit einem pH-Wert gewählt, der im Bereich oder unterhalb oder im Bereich des pK-Wertes z. B. der Membranoberfläche liegt. Auch bei die­ sen Bedingungen werden die Nukleinsäuren nahezu quantitativ absorbiert, wenn man eine Lösung des die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterial in einen Bindungspuffer mit dem angesprochenen pH-Wert durch die Membran permeie­ ren läßt.
Die dritte Variante schließlich sieht vor, daß man das Ausgangsmaterial in einen Bindungspuffer aufnimmt, der ein Fällungsmittel in einer Konzentration unterhalb des Wertes enthält, in der Nukleinsäuren ausfallen. Als besonders geeignet hat sich hierbei Polyethylenglykol (PEG) herausgestellt, das dem Bindungspuffer z. B. in einer Konzentration von 6% (PEG 8000) zugesetzt sein kann. Auch in diesem Fall binden die Nukleinsäuren wiederum nahezu quantitativ an der Mem­ branoberfläche.
In allen drei angesprochenen Varianten erfolgte eine Adsorbtion nur, wenn die Membranen entsprechend funktionalisiert waren. Bei nicht funktionalisierten Membranen erfolgte keine, bzw. keine nennenswerte Bindung. Dies spricht da­ für, daß die angesprochenen Umgebungsbedingungen unabhängig voneinander, aber nur in Verbindung mit der speziellen Membranoberfläche eine Bindung von Nukleinsäure favorisieren.
Selbstverständlich ist es aber auch möglich, die einzelnen Parameter miteinander zu verknüpfen, d. h. die Membran zur Bindung von Nukleinsäuren auf ein Umge­ bungsmedium mit hoher Ionenkonzentration und niedrigem pH-Wert einzustellen etc.
Der Bindungspuffer kann separat vorgesehen werden. Genauso gut ist es aber auch möglich, ihn mit dem oder einem Lyse-Puffer zu kombinieren.
Bislang wurde in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nur über die selektive Bindung der Nukleinsäuren an der Membran gesprochen. In den meisten Anwendungsfällen ist zusätzlich gewünscht, daß sich die gebundenen Nukleinsäure ggf. nach Waschen wieder in einfacher Weise von der Membran eluieren lassen. Auch hier hat sich wieder herausgestellt, daß die oben angespro­ chenen unabhängigen Varianten, die eine Bindung der Nukleinsäuren an der Membran favorisieren, unter umgekehrten Vorzeichen zur Elution der gebunde­ nen Nukleinsäuren eingesetzt werden können.
Im einfachsten Fall erfolgt eine Elution mit Wasser bei neutralem ph-Wert. In Gegenwart von Wasser sind die funktionellen Gruppen der Membran größtenteils deprotoniert und die Ladungen sowohl der Membran als auch der Nukleinsäuren liegen in nicht abgeschirmten Zustand vor. Es kommt zu ionischen Abstoßungs­ reaktionen, die eine leichte Ablösung der Nukleinsäuren von der Membran er­ möglichen. Weist die Membran oder Matrix die oben angesprochenen Polymer­ ketten auf, an denen die funktionellen Gruppen vorgesehen sind, so tritt als wei­ terer Effekt hinzu, daß sich die Ketten von der Membran abstrecken und die Nu­ kleinsäuren (zusätzlich zu den beschriebenen ionischen Wechselwirkungen) rein mechanisch abstoßen.
Neben der Elution mit reinem Wasser sind selbstverständlich auch andere Eluti­ onspuffer denkbar. Welcher Puffer am ehesten geeignet ist, kann vom Fachmann ohne großen Aufwand ermittelt werden. Die generelle Regel ist, daß die Ionen­ konzentration des Elutionspuffers möglichst niedrig und der pH-Wert möglichst oberhalb des pK-Wertes der Membranoberfläche eingestellt wild. Im Zweifelsfall kann man eine höhere Ionenkonzentration (falls erforderlich) des Elutionspuffers ggf. über einen alkalischeren pH-Wert ausgleichen und umgekehrt. Eine Optimie­ rung beider Werte ist ohne größeren Aufwand möglich.
Die erfindungsgemäße Verwendung von funktionalisierten Membranen bzw. die entsprechenden Verfahren erlauben eine besonders einfache Aufreinigung von Nukleinsäuren mit den üblichen Schritten: Bindung der Nukleinsäuren an einer Membran, Waschen der Membran und Elution der gebundenen Nukleinsäuren.
Alle Schritte lassen sich in einfacher Weise, unter besonders schonenden Bedin­ gungen und mit guten Ausbeuten durchführen. Insbesondere kann auf die im Stand der Technik meist erforderlichen chaotropen Reagenzien und die üblicherweise eingesetzten Beads verzichtet werden. Die Elution kann aufgrund der guten Benetzbarkeit der Membranen und Matrizes mit geringsten Puffervolumina und z. B. bei Raumtemperatur erfolgen.
Besonders geeignet ist die Erfindung z. B. zur Aufarbeitung von Plasmid-DNA für die Sequenzierung, um nur ein bevorzugtes Anwendungsfeld zu nennen. Na­ türlich lassen sich auch andere Nukleinsäuren aus den unterschiedlichsten nu­ kleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien, ggf nach Vorreinigung, aufreinigen.
Im folgenden soll die Erfindung anhand einiger Beispiele näher erläutert werden, die besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele betreffen.
A: Herstellung funktionalisierter Membranen Beispiel 1 a) Modifizierung von Polypropylenmembranen
Eine Polypropylen-Mikrofiltrationsmembran (Accurel 2E HF, nominale Poren­ größe 0,2 µm, Membrandicke 150 µm; Membrana GmbH, Wuppertal oder Ver­ suchsmuster #1333-12A, nominale Porengröße 0,45 µm, Membrandicke 110 µm, 3M, St. Paul, USA) mit einem Durchmesser von d = 80 mm wird unter Schütteln für 2 h mit einer 100 mM Lösung von Benzophenon (BP) in Aceton equilibriert. Nachfolgend wird die Membran mit einer 10%igen wässrigen Acrylsäurelösung überschichtet. Anschließend wird für 15 min mit UV-Strahlung (UVA-Spot 2000; Dr. Hönle GmbH, Planegg) belichtet. Abschließend wird die modifizierte Mem­ bran für 24 h bei 60°C mit Wasser extrahiert und getrocknet.
b) Modifizierung von Nylonmembranen
Eine Nylon-Mikrofiltrationsmembran (Schleicher, nominale Porengröße 0,45 µm, Membrandicke 127 µm; ) wird unter den gleichen Bedingungen wie bei a) modifiziert.
B: Aufreinigung von Nukleinsäuren
Für die nachfolgenden Aufreinigungen wurden die gemäß der Beispiele 1a und b hergestellten oberflächenmodifizierten Membranen in eine 96er Mikrofiltrations­ platte eingespannt.
Beispiel 2
Als Basismaterial für diesen Versuch wird oberflächenmodifiziertes PP (Beispiel 1a) mit einer nominalen Porenweite von 0,45 µm eingesetzt. Die Aufreinigung erfolgte mittels Zentrifugation bei 3000 rpm, Raumtemperatur (Eppendorf 5810R; A-2 DWP Rotor) nach dem Prinzip: Bind-Wash-Elute.
Hierfür wird 1 µg pDNA mit jeweils 200 µl der Bindungspuffer 1 (BP1) oder 2 (BP2) versetzt (BP1: 5 mM Tris, pH = 7,5; BP2: 4 M NaCl, pH = 4,6). Nach der In­ kubation wird 2 × mit je 200 µl 70% EtOH gewaschen. Die Elution erfolgt mit 30 µl Tris (5 mM, pH = 7,5). Abschließend wird ein zweites Mal mit 100 µl eluiert. Die halbquantitative Auswertung von 4 µl Eluat erfolgte mittels Ethidiumbromid- Gelelektrophorese (nicht dargestellt).
Während bei Einsatz des Bindungspuffers BP1 keine Adsorption an die Membran erfolgt, läßt sich die pDNA bei Verwendung von BP2 nahezu quantitativ an die Membran binden und im ersten Elutionsschritt wieder eluieren.
Beispiel 3
Die Durchführung des Versuches erfolgt wie im Beispiel 2 beschrieben, wobei die Bindungspuffer gemäß Tabelle 1 eingesetzt wurden. Die eingesetzte Menge pDNA beträgt 500 ng. Die halbquantitative Analyse erfolgt über Gelelektrophore­ se (Ergebnisse nicht dargestellt)
Die Auswertung ist in (Tabelle 1) zusammengefaßt und erlaubt eine erste Ein­ schätzung der Rückgewinnungsrate (von - bis +++)
Tabelle 1
Wie sich aus der Tabelle ergibt, läßt sich lediglich bei der Acrylsäure­ modifizierten PP-Membran die DNA nahezu quantitativ binden und wieder eluie­ ren. Die Abhängigkeit der Bindung vom pH-Wert der Inkubationslösung ist in Tabelle 1 deutlich zu erkennen. Bei einem Wert unterhalb des pK-Wertes der Membranmodifizierung findet eine Bindung statt. Bei einem pH-Wert darüber erfolgt keine Bindung.
Beispiel 4
Es wird eine pDNA-Aufreinigung nach dem Prinzip der alkalischen Lyse durch­ geführt. Hierzu werden 1,5 ml Bakterienkultur mit den Puffern P1-P3 (P1: 100 µl, P2: 300 µl, P3: 300 µl) aus dem Kit "Perfect Prep Plasmid Midi" der Fa. Eppen­ dorf versetzt. Nach Zentrifugation wird das klare Lysat mit jeweils 700 µl Bindungspuffer (s. Tabelle 2) versetzt. Die Aufarbeitung der Probe erfolgt unter den im Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen. Zur Kontrolle wird eine Plasmidpräpa­ ration unter Durchführung der kompletten Aufreinigungsprozedur mit dem Kit "Perfect Prep Plasmid Mini" der Fa. Eppendorf, aus der identischen 1,5 mL Bak­ terienkultur durchgeführt. Als weitere Kontrolle wird das Gemisch aus geklärtem Lysat und jeweiligem Bindungspuffer (s. Tabelle 2) für 30 Minuten bei 12000 g, Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entfernt. Danach erfolgt zwei­ maliges Waschen mit 200 µl 70% Ethanol, Trocknung unter Vacuum, sowie die Zugabe von 30 µl Tris-HCl, pH 7,5.
Ausbeute und Reinheit wurden mittels Photometrie und Analyse durch Ethidi­ umbromid-Gelelektrophorese bestimmt (Tabelle 2, Abb. 1). Die Tabelle gibt die mittels Photometer (Biophotometer der Fa. Eppendorf) bestimmte Konzentration der eluierten pDNA in ng/µl an.
Tabelle 2
Die Plasmid DNA des GFP-N1 wurde nach Auftrennung im 0,8% Ethidiumbro­ mid-Agarosegel analysiert, das als Fig. 1 wiedergegeben ist. Die Spuren des Gels wurden wie folgt belegt:
  • 1. 1.) Kontrolle (ohne Membran) zum Nachweis eines Fällungsmechanismus, Bin­ dungspuffer pH 7,4
  • 2. 2.) Kontrolle (ohne Membran) zum Nachweis eines Fällungsmechanismus, Bin­ dungspuffer pH 4,6
  • 3. 3.) Bindungspuffer pH 4,6 unmodifizierte Membran
  • 4. 4.) Bindungspuffer pH 7,4 unmodifizierte Membran
  • 5. 5.) Bindungspuffer pH 4,6 modifizierte Membran
  • 6. 6.) Bindungspuffer pH 7,4 modifizierte Membran
  • 7. 7.) leer
  • 8. 8.) Kontrolle Plasmid Mini Präparation (Eppendorf Perfect Prep Mini)
Wie das Gel (Fig. 1) deutlich zeigt, läßt sich nur unter Verwendung der modifi­ zierten Nylon-Membran pDNA aufreinigen. Die Aufreinigung ist abhängig vom gewählten pH-Wert. So konnte eine erfolgreiche pDNA Isolierung nur nach Verwendung des Bindungspuffer mit pH 4,6 durchgeführt werden, nicht jedoch, wenn der pH 7,4 beträgt.
Die Fällungsprozedur eines DNA-Bindungspuffergemisches ohne Einsatz einer Membran verlief erfolglos. Hieraus läßt sich ableiten, daß die Isolierung auf die Modifizierung der Membran unter ausgewählten pH Bedingungen zurückzufüh­ ren ist und nicht auf eine Fällungsreaktion.

Claims (26)

1. Verwendung einer funktionalisierten porösen Membran zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, deren Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren über die Bedingungen in einem umgebenden Medium einstellbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit deprotonierbaren Gruppen funktio­ nalisiert ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mem­ bran mit Sulfonsäure- oder Carbonsäure-Gruppen funktionalisiert ist.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fixiert ist, und deren anderes Ende frei beweglich ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Membran aus Kunststoff hergestellt ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mem­ bran aus Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon, PVDF besteht.
7. Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Membran Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 µm aufweist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Membran eine Dicke < 500 µm aufweist.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Membran zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert ist.
10. Verwendung einer durchströmbaren Matrix zur Aufreinigung von Nu­ kleinsäuren, wobei die Matrix mit einer funktionalisierten Oberfläche aus­ gestattet ist, deren Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren in Abhängig­ keit über die Bedingungen in einem umgebenden Medium einstellbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit deprotonierbaren Gruppen funktio­ nalisiert ist.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein Filter ist.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Matrix Vliess, Filz, Fasern, Sintermaterial, entsprechend ausgerüstete Pipettenspitzen oder Reaktionsgefäße (Consumables) mit Mi­ krostrukturkanälen ist.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeich­ net, daß die Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Matrix fixiert ist, und deren anderes Ende frei be­ weglich ist.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.
15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Matrix zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten Spin- Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert ist.
16. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer Membran gemäß der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Matrix gemäß der Ansprüche 10 bis 15,
bei dem man eine Lösung des Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer mit hoher Ionenkonzentration (< 100 mM) durch die Membran/Matrix permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche der Membran/Matrix binden
und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran/Matrix eluiert.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionen­ konzentration des Bindungspuffers < 500 mM beträgt.
18. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer Membran gemäß der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Matrix gemäß der Ansprüche 10 bis 15,
bei dem man eine Lösung des Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer durch die Membran/Matrix permeieren lässt, dessen pH-Wert unterhalb oder im Bereich des pK-Werts der Membran(Matrix)oberfläche liegt, wo­ bei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche der Membran/Matrix binden
und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran/Matrix eluiert.
19. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer Membran gemäß der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Matrix gemäß der Ansprüche 10 bis 15,
bei dem man eine Lösung des Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer durch die Membran/Matrix permeieren lässt, der ein Fällungsmittel in ei­ ner Konzentration unterhalb des Werts enthält, in der Nukleinsäuren aus­ fallen,
und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran/Matrix eluiert.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Bin­ dungspuffer PEG in einer Konzentration < 10% enthält.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man zur Elution der gebundenen Nukleinsäuren einen Eluti­ onspuffer durch die Membran/Matrix permeieren läßt, dessen pH-Wert auf einen Wert oberhalb des pK-Werts der Membran(Matrix)oberfläche einge­ stellt ist.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man zur Elution der gebundenen Nukleinsäuren einen Eluti­ onspuffer durch die Membran/Matrix permeieren läßt, dessen Ionenkon­ zentration auf einen Wert < 500 mM eingestellt ist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Bindungs-, Wasch- und/oder Elutionspuffer mittels Va­ kuum durch die Membran/Matrix gesaugt werden.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Elution der an der Membran/Matrix gebundenen Nu­ kleinsäuren bei Raumtemperatur erfolgt.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Ausgangsmaterial einer Vorreinigung zur Abtrennung von groben Zelltrümmern und dergleichen unterzogen wird.
26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial geklärtes Zelllysat ist.
DE10006590A 2000-02-11 2000-02-11 Verwendung funktionalisierter Membranen bzw. Matrizes zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren Expired - Fee Related DE10006590B4 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10006590A DE10006590B4 (de) 2000-02-11 2000-02-11 Verwendung funktionalisierter Membranen bzw. Matrizes zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren
US10/182,852 US7153433B2 (en) 2000-02-11 2001-02-02 Use of functionalized porous membranes or matrices for purification of nucleic acids and corresponding methods
PCT/EP2001/001133 WO2001059097A1 (de) 2000-02-11 2001-02-02 Verwendung funktionalisierter, poröser membranen bzw. matrizes zur aufreinigung von nukleinsäuren sowie entsprechende verfahren

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10006590A DE10006590B4 (de) 2000-02-11 2000-02-11 Verwendung funktionalisierter Membranen bzw. Matrizes zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE10006590A1 true DE10006590A1 (de) 2001-08-23
DE10006590B4 DE10006590B4 (de) 2007-10-18

Family

ID=7630912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10006590A Expired - Fee Related DE10006590B4 (de) 2000-02-11 2000-02-11 Verwendung funktionalisierter Membranen bzw. Matrizes zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren

Country Status (3)

Country Link
US (1) US7153433B2 (de)
DE (1) DE10006590B4 (de)
WO (1) WO2001059097A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10106199A1 (de) * 2001-02-10 2002-08-22 Eppendorf Ag Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen flüssigen Probe
EP1676615A1 (de) 2004-12-28 2006-07-05 Polymerics GmbH Festphasensorbens

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040180445A1 (en) * 2003-03-12 2004-09-16 Domanico Michael J. Methods and compositions for purification of nucleic acid from a host cell
US7031802B2 (en) * 2003-08-13 2006-04-18 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Semi-autonomous operation of a robotic device
WO2008016988A1 (en) 2006-08-01 2008-02-07 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
WO2012173592A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Empire Technology Development Llc Programmable membrane system
US9738984B2 (en) 2011-06-13 2017-08-22 Empire Technology Development Llc Reliable point of use membrane modification
WO2012173591A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Empire Technology Development Llc Functional and reusable electrodeposited coatings on porous membranes

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0281390A2 (de) * 1987-03-02 1988-09-07 Gen-Probe Incorporated Polykationische Träger zur Reinigung, Trennung und Hybridisierung von Nukleinsäure
DD274676A1 (de) * 1988-08-04 1989-12-27 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von festen phasen fuer molekularbiologische nachweis- und trennoperation

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1538810A (en) * 1976-08-10 1979-01-24 Sumitomo Electric Industries Hydrophilic porous fluorocarbon structures and process for their production
JPS6270757A (ja) * 1985-09-25 1987-04-01 Toyo Soda Mfg Co Ltd 液体クロマトグラフイ−による分離・分析方法及び分離・分析装置
IT1201498B (it) * 1985-11-20 1989-02-02 Ausimont Spa Perfluoropolieteri funzionalizzati e procedimento per la loro preparazione
US5599667A (en) * 1987-03-02 1997-02-04 Gen-Probe Incorporated Polycationic supports and nucleic acid purification separation and hybridization
US5438128A (en) * 1992-02-07 1995-08-01 Millipore Corporation Method for rapid purifiction of nucleic acids using layered ion-exchange membranes
EP0555798B1 (de) * 1992-02-13 1999-05-06 Becton, Dickinson and Company Celithydrat und Reinigung von DNS
US5503816A (en) * 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
EP0949959B1 (de) * 1996-08-26 2008-07-09 Massachusetts Institute Of Technology Herstellung von polymergegenständen mit hydrophiler oberfläche
US6120985A (en) * 1997-10-31 2000-09-19 Bbi Bioseq, Inc. Pressure-enhanced extraction and purification
KR20010032806A (ko) * 1997-12-06 2001-04-25 매튜 존 베이커 핵산 분리방법
US6914137B2 (en) * 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
US6783937B1 (en) * 1999-02-25 2004-08-31 Pall Corporation Negatively charged membrane
US6258057B1 (en) * 1999-03-17 2001-07-10 Norma Marinello Disposable mouthwash packet
US6372813B1 (en) * 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6524482B2 (en) * 2001-04-19 2003-02-25 Ibc Advanced Technologies, Inc. Use of ion binding ligands attached to solid supports and membranes for ion removal from a biological system
US7981600B2 (en) * 2003-04-17 2011-07-19 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using an anion exchange material that includes a polyoxyalkylene

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0281390A2 (de) * 1987-03-02 1988-09-07 Gen-Probe Incorporated Polykationische Träger zur Reinigung, Trennung und Hybridisierung von Nukleinsäure
DD274676A1 (de) * 1988-08-04 1989-12-27 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von festen phasen fuer molekularbiologische nachweis- und trennoperation

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10106199A1 (de) * 2001-02-10 2002-08-22 Eppendorf Ag Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen flüssigen Probe
EP1676615A1 (de) 2004-12-28 2006-07-05 Polymerics GmbH Festphasensorbens
US7304017B2 (en) 2004-12-28 2007-12-04 Polymerics Gmbh Sorbent for use in process of solid phase extraction

Also Published As

Publication number Publication date
US7153433B2 (en) 2006-12-26
WO2001059097A1 (de) 2001-08-16
US20030191302A1 (en) 2003-10-09
DE10006590B4 (de) 2007-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69936584T2 (de) Schnelles und einfaches verfahren zur isolierung von zirkulären nukleinsäuren
EP0616639B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren
DE69828517T2 (de) Methode zur dns-isolierung.
EP1146049B1 (de) Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen
DE19746874A1 (de) Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen
WO1998030685A2 (de) Reinigung oder/und konzentrierung von dna durch cross-flow-filtration, abtrennung von endotoxinen aus einer nucleinsäure-präparation
EP0781291A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur isolierung von zellinhaltsstoffen wie nucleinsäuren aus natürlichen quellen
DE69421885T2 (de) Oberflächenmaterial für Festphase-Extraktionsreinigung von DNA
EP2638156B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur isolierung und reinigung von doppelsträngigen nukleinsäuren
EP1282637B1 (de) Reinigung von proteineinschlusskörpern durch querstrom-mikrofiltration
DE602004011448T2 (de) Poröse Medien
DE102005057334A1 (de) Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen Ausgangsmaterialien
DE10006590B4 (de) Verwendung funktionalisierter Membranen bzw. Matrizes zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren
DE10106199A1 (de) Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen flüssigen Probe
EP1234029B1 (de) Verfahren zur herstellung oberflächenmodifizierte trägermaterialien zur bindung biologischer materialien
EP1242816B1 (de) Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben
DE102006020872A1 (de) Verfahren zur Nucleinsäureisolierung und Vorrichtung zur Nucleinsäureisolierung
DE19900681A1 (de) Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
DE102005047736B4 (de) Verfahren und System zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien
DE10006591B4 (de) Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
EP1125943B1 (de) Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie Anionenaustauscher zur Durchführung dieses Verfahrens
EP1394269A1 (de) Verfahren zur Isolierung biologischer Makromoleküle sowie Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens
EP1783220A1 (de) Verfahren zur selektiven, reversiblen Adsorption von Nukleinsäuren an ein Trägermaterial

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: QIAGEN NORTH AMERICAN HOLDINGS, INC., GERMANTO, US

8128 New person/name/address of the agent

Representative=s name: ROTH, A., DIPL.-BIOL. DR. SC. HUM., PAT.-ANW., 405

8364 No opposition during term of opposition
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20140902