DE10006214A1 - System zur einfachen Nukleinsäureanalytik - Google Patents
System zur einfachen NukleinsäureanalytikInfo
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Abstract
Es wird ein System zur einfachen Nukleinsäureanalytik beschrieben, bei dem der Amplifikationsraum mindestens einen Teil des Bindungsraumes umfaßt. Eine weitere Verbesserung wird durch die Gestaltung des Bindungs- oder/und Amplifikationsraumes als Kapillare erzielt, die gegebenenfalls von einer heizbaren Metallschicht umgeben ist.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur einfachen
Nukleinsäureanalytik.
Bei bekannten Systemen zur Nukleinsäurenanalytik wird zunächst eine
Bindung von Nukleinsäuren zur Reinigung bzw. Isolierung des gesuchten
Analyten durchgeführt. Die Bindung erfolgt üblicherweise in Gefäßen mit
relativ großen Volumina von einigen cm3, um die für einen sensitiven
Nachweis erforderliche Menge an Probe, Bindepuffer etc. aufnehmen zu
können. Da im diagnostischen Bereich Nachweisgrenzen von 1 bis 10
Analyten pro ml Probe erreicht werden sollen, sind für sensitive
diagnostische Verfahren entsprechend große Probemengen und damit große
Reaktionsvolumina erforderlich. Kleinere Probevolumina führen zu weniger
sensitiven Verfahren und zu der Gefahr, daß in dem ausgewählten Teil der
tatsächlich positiven Probe der gesuchte Analyt gerade nicht vorhanden ist,
was zu einem falsch negativen diagnostischen Ergebnis führen würde.
Andererseits sollte eine für den Nachweis erforderliche
Nukleinsäureamplifikation des isolierten DNA-Analyten jedoch in möglichst
kleinen Gefäßen durchgeführt werden, um eine ausreichend hohe
Amplifikationsgeschwindigkeit zu erzielen. Dieser Kontrast hat zur Folge,
daß die zur Reinigung immobilisierten Nukleinsäuren üblicherweise aus dem
Bindungsraum eluiert und in einen Amplifikationsraum überführt werden
müssen, der vom Bindungsraum verschieden ist. Vorrichtungen für eine
Nukleinsäureanalytik mit Mehrkammersystemen werden beispielweise in EP 0 754 725;
WO 95/11454; US 5,645,801; WO 97/02357; US 5,714,380;
EP 0 733 714; EP 0 674 009; US 5,725,831; US 5,639,428; WO 97/10056;
WO 94/05414; WO 96/ 41864; US 5,589,136; WO 97/00726;
EP 0 838 025; WO 97/03348; EP 0 594 260; EP 0 594 259; US 5,288,463;
US 5,422,271; US 5,593,838; WO 93/22053; WO 93/22054;
WO 93/22055; WO 93/22058 und WO 96/15269 beschrieben. Der bei
diesen Vorrichtungen erforderliche Transferschritt der isolierten
Nukleinsäuren von einem Gefäß in ein anderes, ist jedoch mit zusätzlichen
Maßnahmen und der Gefahr verbunden, bei der Überführung einen Teil oder
den gesamten gesuchten Analyten zu verlieren oder die Probe zu
kontaminieren.
Es besteht deshalb ein Bedarf nach Nukleinsäureanalyseverfahren, mit
denen die Nachteile der bekannten Verfahren überwunden werden können
und die insbesondere eine hohe Sensitivität aufweisen und mit denen der
technische und zeitliche Aufwand für eine Analyse verringert werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum
Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe umfassend die Schritte:
- a) Reinigen der Nukleinsäuren in einem Bindungsraum, wobei die Nukleinsäuren immobilisiert und Verunreinigungen abgetrennt werden,
- b) Eluieren der immobilisierten Nukleinsäuren,
- c) Amplifizieren der gereinigten Nukleinsäuren in einem Amplifikationsraum und
- d) Detektieren der Amplifikationsprodukte in einem Detektionsraum,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Amplifikationsraum
mindestens einen Teil des Bindungsraumes umfaßt.
Aufgrund der Durchführung der Amplifikation in mindestens einem Teil des
Bindungsraumes, kann eine deutliche Verbesserung im Hinblick auf den
technischen und zeitlichen Aufwand bei der Nukleinsäureanalytik erhalten
werden. Erfindungsgemäß kann der gleiche Raum oder ein Teil des Raumes
sowohl für die Immobilisierung als auch die Amplifikation verwendet
werden, wobei die Probe, gegebenenfalls vermischt mit weiteren
Reagenzien, zur Immobilisierung mindestens einmal, bevorzugt mehrmals,
durch den Bindungsraum hindurchgeleitet wird.
Grundsätzlich umfassen Systeme zur Nukleinsäureanalytik einen oder
mehrere der folgenden Schritte: Probenvorbereitung, Amplifikation,
Detektion und Auswertung.
Die Probenvorbereitung kann gegebenenfalls vor dem Reinigen der
Nukleinsäure in Schritt (a) eine Lyse von nukleinsäurehaltigen Proben
umfassen. Eine solche Lyse wird bevorzugt durchgeführt, wenn die zu
untersuchende Probe Zellen oder/und Zellbestandteile enthält. Eine Lyse von
Zellen kann beispielsweise durch Zugabe von lytischen Reagenzien,
insbesondere chaotropen Reagenzien oder lytischen Enzymen bewerkstelligt
werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird in einer
Doppelkolbenspritze ein chaotropes Reagenz vorgelegt. Die Probe wird in
die Spritze aufgezogen und die Spritzenöffnung anschließend verschlossen,
beispielsweise durch ein Ventil oder einen Hahn. Durch Hin- und
Herbewegen des zweiten Kolbens der Doppelkolbenspritze wird eine
intensive Durchmischung von nukleinsäurehaltiger Probe und chaotropem
Reagenz erreicht. Falls gewünscht, kann die Lyse durch Erwärmung der
Mischung bei erhöhter Temperatur, bevorzugt von 30°C bis 70°C
durchgeführt werden. Die Lyse wird insbesondere durch Ausübung von
Scherkräften auf die nukleinsäurehaltige Probe bewirkt.
Weiterhin umfaßt die Probenvorbereitung einen Reinigungsschritt, um
möglicherweise den späteren Nachweis störende Komponenten der Probe
abzutrennen. Die Reinigung der Nukleinsäuren wird erfindungsgemäß in
einem Bindungsraum durchgeführt, wobei die Nukleinsäuren immobiliert und
Verunreinigungen abgetrennt werden. Die Nukleinsäuren können z. B. durch
kovalentes oder adsorptives Binden im Bindungsraum immobilisiert werden.
Weiterhin ist auch eine Bindung der Nukleinsäuren über hochaffine
Wechselwirkungen, beispielsweise eine sequenzspezifische Bindung über
Hybridisierungssonden oder über Bindepartner von hochaffinen
Bindungspaaren wie etwa Avidin/Biotin oder über spezifische Antikörper
möglich. Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung der Nukleinsäuren durch
adsorptive Bindung, beispielsweise an eine Glasoberfläche. Die Bindung der
Nukleinsäuren an die Oberfläche kann durch Zugabe von geeigneten
Bindereagenzien, wie etwa Isopropanol, chaotropen Salzen etc. unterstützt
werden.
Die Bindung erfolgt bevorzugt an eine innere Oberfläche des
Bindungsraumes, es ist aber auch möglich, die Nukleinsäuren an im
Bindungsraum eingebrachte Anordnungen, wie etwa Packungen oder
Schüttungen zu binden.
Falls eine Zellen, beispielsweise Mikroorganismen enthaltende Probe
analysiert werden soll, kann es vorteilhaft sein, zunächst die Zellen, z. B.
Infektionskeime, über spezifische insbesondere oberflächenantigen
spezifische Antikörper oder unspezifische adsorptive Bindung an die
Oberfläche des Bindungsraums abzufangen bzw. zu isolieren. So können
beispielsweise für eine spezifische Bindung von Mikroorganismen, wie
beispielsweise Infektionskeimen entsprechende Antikörper im Bindungsraum
immobilisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß Zellen wie
beispielsweise Chlamydien adsorbtiv an Oberflächen, bevorzugt Oberflächen
aus Polystyrol gebunden und auf diese Weise aufgereinigt werden können.
Die Nukleinsäuren selbst können dann nach einer Lyse der Zellen, die
beispielsweise durch thermische Einwirkung während der
Amplifikationsreaktion erfolgen kann, nachgewiesen werden.
Besonders bevorzugt wird als Bindungsraum ein zumindest teilweise
kapillarer Raum verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt
die Immobilisierung der Nukleinsäuren oder Zellen an die innere Oberfläche
einer Kapillare, die aus Glas, insbesondere Borsilikat, oder Polystyrol
besteht. Der kapillare Raum kann aber auch als Spalt, z. B. zwischen zwei
Deckplatten ausgebildet sein. Der Öffnung bzw. der Durchmesser des
kapillaren Raums beträgt bevorzugt ≧ 0,05 mm, besonders bevorzugt ≧
0,5 mm und am meisten bevorzugt ≧ 0,9 mm und bevorzugt ≦ 5 mm,
besonders bevorzugt ≦ 2 mm und am meisten bevorzugt ≦ 1,1 mm.
Während nur ein Teil des Bindungsraumes, insbesondere ≧ 10%, bevorzugt
≧ 20% des gesamten Bindungsvolumens als kapillarer Raum ausgebildet
sein können, ist es bevorzugt, daß praktisch der gesamte Bindungsraum,
bevorzugt ≧ 80% und insbesondere ≧ 90% bezogen auf das gesamte
Bindungsraumvolumen als kapillarer Raum ausgebildet sind.
Zur Immobilisierung wird eine Kapillare beispielsweise an die oben
beschriebene Doppelkolbenspritze angedockt und die nukleinsäurehaltige
Probe bzw. das nach einer Lyse erhaltene Gemisch mindestens einmal,
bevorzugt mindestens fünfmal, mehr bevorzugt mindestens zehnmal und am
meisten bevorzugt mindestens zwanzigmal durch die Kapillare geleitet.
Durch das wiederholte Leiten der Probe bzw. der Lysemischung durch den
Bindungsraum kann vorteilhafterweise eine Erhöhung der Ausbeute an
immobilisierten Nukleinsäuren und damit eine Erhöhung der Sensitivität des
gesamten Verfahrens erzielt werden.
Das Volumenverhältnis von Bindungsraum zu Nukleinsäure enthaltender
Probe beträgt bevorzugt mindestens 10 : 1, besonders bevorzugt mindestens
20 : 1.
Ein großes Verhältnis von Bindungsraum zu Probe ist vorteilhaft, da es ein
großes Probevolumen, wie es für eine hohe Sensitivität bei der Bindung
erforderlich ist, und gleichzeitig die Durchführung des Verfahrens in einem
kleinen Raum, insbesondere in einem kapillaren Raum, ermöglicht, wie er für
die spätere Amplifikation der Nukleinsäuren benötigt wird. Ein hohes
Verhältnis von Probevolumen zu Volumen des Bindungsraumes kann
erhalten werden, wenn die Probe nicht, wie im Stand der Technik üblich, in
den Bindungsraum eingefüllt wird, sondern vielmehr mindestens einmal,
bevorzugt mehrmals durch den Bindungsraum hindurchgeleitet wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung von
Nukleinsäuren an die Oberfläche eines Glasvlieses in einer Packung,
beispielsweise in einer Patrone, die an die oben beschriebene Kapillare
angedockt wird. Auch bei dieser Ausführungsform wird die Nukleinsäuren
enthaltende Probe bzw. die Lysemischung mindestens einmal durch die
Packung geleitet, wobei die Nukleinsäuren beim Durchströmen an der
Oberfläche des Glasvlieses binden.
Nach oder gleichzeitig mit dem Immobilisieren der Nukleinsäuren werden
Verunreinigungen, die in der Probe enthalten sind, abgetrennt, wodurch ein
selektiver und empfindlicher Nachweis von Nukleinsäuren erhalten wird. Die
Abtrennung von Verunreinigungen kann beispielsweise dadurch erfolgen,
daß der Bindungsraum, an den die Nukleinsäuren immobilisiert sind, mit
einem Waschpuffer behandelt oder gespült wird. Der Waschpuffer wird
bevorzugt langsam mindestens einmal durch den Bindungsraum geleitet und
enthält bevorzugt 70 bis 80 Vol-% Ethanol.
Eine weitere Reinigung kann dadurch erfolgen, daß zur Entfernung des
Waschpuffers der Bindungsraum getrocknet wird, indem er beispielsweise
auf etwa 80°C aufgeheizt und gleichzeitig mit Luft oder einem Intergas
durchgeströmt wird. Die Entfernung von Waschpufferresten, insbesondere
von Restalkohol ist deswegen vorteilhaft, da Rückstände von Alkohol die
anschließende Amplifikation inhibieren oder stören können.
Am Ende von Schritt (a) liegen die Nukleinsäuren bevorzugt in
angetrockneter Form an den Bindungsraum immobilisiert, bevorzugt
adsorptiv an eine Glasoberfläche gebunden vor.
Zur Vorbereitung der Amplifikation werden die immobilisierten Nukleinsäuren
in Schritt (b) eluiert. Die Elution kann mit geeigneten, dem Fachmann
bekannten Elutionslösungen durchgeführt werden. Nukleinsäuren können
z. B. durch ein Reagenzgemisch mit niedrigem Salzgehalt von einer
Glasoberfläche gelöst werden. Besonders vorteilhaft wird zum Eluieren eine
Lösung eingesetzt, die bereits alle für die Amplifizierung erforderlichen
Reagenzien enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch
Aufziehen eines Mastermix in den Bindungsraum, insbesondere eine
Kapillare, die Nukleinsäure von der Oberfläche, insbesondere einer Glas-
oder Polystyroloberfläche abgelöst. Unter Eluieren wird hier insbesondere
das Ablösen der immobilisierten Nukleinsäuren von der Oberfläche
verstanden, wobei die eluierten Nukleinsäuren nicht aus dem Bindungsraum
entfernt werden. Werden in dem Probenvorbereitungsschritt die
Infektionskeime beispielweise durch adsorbtive Bindung an Polystyrol
aufgereinigt, werden diese bevorzugt erst zu Beginn des Amplifika
tionsschrittes lysiert. Es werden daher für den Probenvorbereitungsschritt
nicht lysierende Puffer gebraucht.
Anschließend wird in Schritt (c) ein Amplifizieren der gereinigten
Nukleinsäuren in einem Amplifikationsraum durchgeführt. Da
erfindungsgemäß der Amplifikationsraum mindestens einen Teil des
Bindungsraumes umfaßt, ist eine Überführung oder ein Transport der
eluierten Nukleinsäuren nicht erforderlich, so daß damit verbundene
Ausbeuteverluste vermieden werden können. Die Amplifikation wird
bevorzugt mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Diese
Amplifikationsmethode hat den Vorteil, daß sie universell einsetzbar ist, und
eine hohe Spezifität und Sensitivität aufweist. Es können aber
selbstverständlich auch andere, dem Fachmann bekannte Amplifika
tionsmethoden eingesetzt werden, wie beispielsweise IsoCR-, LCR-,
Champ-, SDA-, Qß-Replikase-, NASBA3SR-, CPT-, TMA-, rRNA-
Hybridisierungs- oder bDNA-Methoden. Die jeweils am vorteilhaftesten
einsetzbare Amplifikationsmethode kann in Abhängigkeit vom Analyten und
anderen Rahmenbedingungen ohne weiteres vom Fachmann ermittelt
werden.
Bevorzugt wird ein Amplifikationsraum verwendet, der thermostatisierbar
ist. Es hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, den
Amplifikationsraum mit einer heizbaren Metallschicht zu umgeben, da auf
diese Weise eine schnelle Erwärmung und somit kurze Heizzyklen möglich
sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung der Polymerase-
Kettenreaktion wird der Bindungsraum, insbesondere eine Kapillare an
seinem unteren Ende zunächst mit einem ersten Stopfen verschlossen.
Anschließend kann die Kapillare von der oben beschriebenen
Doppelkolbenspritze abgenommen werden und mit einem zweiten Stopfen
verschlossen werden. Der Bindungsraum dient dann gleichzeitigt als
Amplifikationsraum.
Falls eine Kapillare mit einer heizbaren Metallschicht als Amplifikationsraum
verwendet wird, wird beim Durchleiten von elektrischem Strom durch die
Kapillare bzw. die elektrisch leitende Außenbeschichtung die Kapillare
aufgeheizt. Die gewünschte Temperatur kann ohne weiteres anhand des
Temperaturkoeffizienten und des elektrischen Widerstandes abgeleitet und
geregelt werden. Die Abkühlung des Amplifikationsraumes kann
beispielsweise durch Anblasen mit Umgebungsluft beschleunigt werden,
wobei bei Verwendung einer Kapillare als Amplifikationsraum in Folge der
geringen Masse nach Abschalten des Heizstromes ohnehin eine hohe
Abkühlgeschwindigkeiterhalten wird. Bei der erfindungsgemäß bevorzugten
Verwendung einer mit einer heizbaren Metallschicht umgebenen Kapillare
ist aufgrund der hohen Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten ein
Thermozyklus von 92°C, 55°C, 72°C in weniger als 25 sec durchführbar.
Die bei der Amplifikation gebildeten Produkte werden erfindungsgemäß
detektiert, um die in der Probe enthaltenen Nukleinsäure nachzuweisen. Die
Detektion kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Bevorzugt erfolgt die
Detektion online durch Fluoreszenz.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Detektions
raum mindestens einen Teil des Amplifikationsraumes oder/und mindestens
einen Teil des Bindungsraumes. Besondere Vorteile hinsichtlich der
Einfachheit des Verfahrens werden erhalten, wenn alle Schritte des
Nachweisverfahrens, also das Reinigen der Nukleinsäuren, das Amplifizieren
der gereinigten Nukleinsäuren und das Detektieren der Amplifikations
produkte im gleichen Reaktionsraum, insbesondere in einer Kapillare
durchgeführt werden.
So kann bei der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform einer mit
Stopfen verschließbaren Kapillare als Bindungs- und Amplifikationsraum das
Anregungslicht durch ein optisches Fenster in den Stopfen eingestrahlt und
das durch ein Fenster am selben oder am gegenüberliegenden Stopfen
auftretende Licht vermessen werden, um eine Fluoreszenzdetektion
durchzuführen. In gleicher Weise kann auch die Änderung einer Adsorption
zur Detektion herangezogen werden.
Zur Auswertung können dann die Intensitäten des Anregungslichtes und des
Fluoreszenzlichtes miteinander verrechnet werden, wodurch ein Signal
erhalten wird. Durch Auftrag der Signalintensität gegen die Anzahl der
durchlaufenen Amplifikationszyklen kann neben dem qualitativen Nachweis
auch quantitativ auf die Konzentration eines Analyten geschlossen werden.
Dies ermöglicht eine diagnostische Vorentscheidung, beispielsweise aus
dem Vergleich der Zyklenzahl, bei der ein deutlicher Signalanstieg beginnt,
mit einem vorher definierten Grenzwert.
Eine weitere Verbesserung des Testes kann durch Zugabe einer definierten
Menge eines internen Standards sowie der zugehörigen Sonden und
Markierungen erzielt werden, wobei hier eine Überwachung der
Amplifikation auf eine mögliche Inhibierung durch Testreagenzien oder/und
in der Probe vorliegende Verunreinigungen durchgeführt werden kann.
Vorteilhaft ist es hierbei, die interne Kontrolle und den Analyten auf zwei
verschiedenen Wellenlängen nachzuweisen, was die gleichzeitige
Durchführung von Analyse und Kontrolle ermöglicht.
Eine weitere Verfahrenskontrolle erhält man durch einen Vergleich der
Temperaturkinetik beim Aufheizen des Amplifikationsraumes mit
hinterlegten Sollwerten, woraus sich der Füllgrad des Amplifikationsraumes,
insbesondere einer Kapillare ableiten läßt. Verliert der Amplifikationsraum
während der Amplifikation Flüssigkeit, so führt das zu Änderungen der
Aufheizkinetik und bei Überschreiten einer zuvor definierten Toleranzgrenze
zur Fehlermeldung.
Zur weiteren Vereinfachung des Verfahrens werden bevorzugt alle Schritte
in einer geschlossenen Vorrichtung ausgeführt, also in einer integrierten
Vorrichtung, die alle notwendigen Reaktionsräume und Reagenzien enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für Point of Care (PoC)-
Nachweise geeignet, da neben einer mit Labor-Standardmethoden
vergleichbaren Leistungsfähigkeit eine einfache Handhabung ohne großen
apparativen Aufwand, niedrige Herstellungskosten und ein geringer
Analyseaufwand erzielt werden können. Durch die Integration der
Probenvorbereitung mit der nachfolgenden Amplifikation können
Pipettierschritte und damit verbundene Kontaminationsprobleme vermieden
werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zum Nachweis von
Pathogenen in biologischen Proben geeignet. Es ermöglicht einen einfachen
und schnellen Nachweis von Keimen, beispielsweise Chlamydia oder
anderen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin eine Vorrichtung zum Nachweis von
Nukleinsäuren in einer Probe, insbesondere durch ein wie oben
beschriebenes Verfahren, umfassend:
- a) einen Bindungsraum zur Reinigung von Nukleinsäuren, in dem die Nukleinsäuren immobilisiert und Verunreinigungen abgetrennt werden,
- b) einen Amplifikationsraum zur Amplifikation von Nukleinsäuren,
- c) einen Detektionsraum zur Detektion von Nukleinsäuren und gegebenenfalls
- d) Reservoirs oder/und Zuleitungen für Probe oder/und Reagenzien,
welche dadurch gekennzeichnet ist, daß der Amplifikationsraum
mindestens einen Teil des Bindungsraums umfaßt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist ein integriertes System. Bevorzugt
umfaßt auch der Detektionsraum mindestens einen Teil des
Amplifikationsraumes oder/und des Bindungsraums. Der Bindungs- und/oder
Amplifikationsraum kann zumindest teilweise als kapillarer Raum ausgebildet
sein, wodurch die oben beschriebenen Vorteile erhalten werden.
Eine Voraussetzung zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe besteht
darin, eingeschlossene oder in Aggregaten gebundene Nukleinsäuren
zunächst freizusetzen, um sie einer Analyse zugänglich zu machen. Hierzu
werden beispielsweise Zellen mit lytischen Enzymen behandelt, um ein
Aufbrechen der Zellwand und ein Freisetzen der in den Zellen enthaltenen
Nukleinsäuren zu erreichen. Eine solche Lyse erfordert jedoch einen
beträchtlichen Zeitaufwand.
WO 95/18851 beschreibt ein Verfahren zum Zerkleinern hochmolekularer
Strukturen, wobei die Probe durch poröse Schichten geleitet wird, um die
Zerkleinerung durch Scherung zu unterstützen. Hier besteht aber das
Problem, daß auch der gewünschte Analyt zumindest teilweise in den Poren
zurückgehalten wird und somit die Sensitivität des gesamten
Nachweisverfahrens beeinträchtigt wird.
Eine weitere Aufgabe bestand deshalb darin, ein Verfahren zum Aufschluß
von nukleinsäurehaltigen Aggregaten bereitzustellen, welches eine
Freisetzung der Nukleinsäuren in kurzer Zeit und ohne Ausbeuteverluste
ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum
Aufschluß einer Nukleinsäuren enthaltenden Matrix oder von
nukleinsäurehaltigen Aggregaten, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
eine Aufschlußmischung, die die Nukleinsäuren enthaltende Matrix und ein
Aufschlußreagenz umfaßt, durch einen kapillaren Raum bewegt wird, wobei
die Matrix aufgebrochen und die darin enthaltenen Nukleinsäuren freigesetzt
werden.
Für einen Aufschluß von Nukleinsäuren enthaltenden Matrizen werden hohe
Scherkräfte benötigt, um einen Probenaufschluß in kurzer Zeit zu erhalten.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden hohe Scherkräfte durch
Verwendung eines kapillaren Raums und Bewegen der Probe, beispielsweise
Durchleiten oder Fördern der Probe durch den kapillaren Raum erhalten,
wodurch der Aufschluß der Nukleinsäure enthaltenden Matrix unterstützt
wird.
Unter Aufschluß ist jedes Aufbrechen oder Zerkleinern einer Nukleinsäure
enthaltenden Matrix zu verstehen, bei dem in der Matrix eingeschlossene
oder mit der Matrix verbundene Nukleinsäuren freigesetzt werden.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Aufschluß um eine Lyse. Bei der
Nukleinsäure enthaltenden Matrix handelt es sich bevorzugt um Zellen
oder/und Zelltraktionen. Es können aber auch andere Gebilde
aufgeschlossen werden, welche Nukleinsäuren eingeschlossen oder
gebunden enthalten, wie etwa Micellen oder ähnliches.
Das Aufschlußreagenz dient erfindungsgemäß dazu, die Freisetzung der
Nukleinsäuren zu unterstützen. Bevorzugt wird ein Aufschlußreagenz
verwendet das ein lytisches Enzym und/oder eine chaotrope Substanz
enthält. Grundsätzlich sollte das Aufschlußreagenz in der Lage sein, die
nukleinsäurehaltigen Aggregate aufzulösen oder anzugreifen.
Als kapillarer Raum wird bevorzugt eine Glaskapillare oder/und eine
Polystyrol-Kapillare, insbesondere eine Borsilikat-beschichtete Kapillare
verwendet. Dies hat den Vorteil, daß neben der Erzeugung von hohen
Scherkräften, was den Aufschluß unterstützt, der gleiche Raum auch zur
Immobilisierung und weiteren Behandlung bzw. Verarbeitung der
freigesetzten Nukleinsäuren, wie oben beschrieben, verwendet werden
kann. Bei dem kapillaren Raum kann es sich auch um einen Stempel mit
kapillaren Löchern oder um einen Spalt zwischen einer Gefäßwand und
einem Stempel handeln. Vorzugsweise wird die Probe mehrmals,
insbesondere mehr als fünfmal, besonders bevorzugt mehr als zehnmal
durch den kapillaren Raum hindurchgeleitet, um einen schnellen Aufschluß
zu erzielen. Das Volumenverhältnis von Aufschlußmischung zu kapillarem
Raum ist dabei bevorzugt größer 10 : 1, besonders bevorzugt größer als
20 : 1. Wenn die Probe durch den kapillaren Raum hindurchgeleitet wird, ist
es möglich, ein großes Probevolumen zu verwenden, was eine hohe
Sensitivität ergibt und den kapillaren Raum klein zu halten, was Vorteile
hinsichtlich der Gesamtanordnung und insbesondere hinsichtlich einer später
durchzuführenden Amplifikation liefert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von
Nukleinsäuren aus Mikroorganismen, welches dadurch gekennzeichnet ist,
daß man eine Mikroorganismen enthaltende Probe mit einer
Polystyroloberfläche unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen die
Mikroorganismen an die Polystyroloberflächen binden und andere
Probenbestandteile abtrennt und die Nukleinsäuren aus den
Mikroorganismen gewinnt. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß
Polystyroloberflächen hervorragend zur Probenvorbereitung für die
Nukleinsäureanalytik geeignet sind. Gefäße, die eine Polystyroloberfläche
aufweisen, können zur Probenvorbereitung bei der Nukleinsäureanalytik
eingesetzt werden, wodurch eine hochintegrierte Anordnung bereitgestellt
werden kann. Polystyrol bietet gegenüber den bisher zur Immobilisierung
verwendeten Glasoberflächen zahlreiche Vorteile wie etwa leichte
Verarbeitbarkeit, geringes Gewicht und mechanische Stabilität auch bei
geringen Wandstärken.
Als Polystyroloberfläche ist beispielweise die Innenwand eines mit Polystyrol
beschichteten oder aus Polystyrol bestehenden Bindungsraumes geeignet,
aber auch die Verwendung von Polystyrolkügelchen oder Polystyrolbeads
o. ä. Bevorzugt wird eine Polystyrol-Kapillare verwendet. Zur Erhöhung der
Ausbeute und um den Bindungsraum möglichst klein zu halten, kann die
Probe mehrmals über die Polystyroloberfläche geleitet werden.
Wie oben ausgeführt, ist es ein wesentliches Ziel bei der Entwicklung von
Nukleinsäure-Nachweisverfahren, den apparativen und/oder zeitlichen
Aufwand zu verringern. Die zur Durchführung einer Amplifikation benötigten
Aufheiz- und Abkühlzyklen erfordern einen beträchtlichen Zeitaufwand,
weshalb es vorteilhaft wäre, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem dieser
Zeitaufwand verringert ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung deshalb ein Verfahren zur
Amplifikation von Nukleinsäuren, das Schritte bei unterschiedlichen
Temperaturen umfaßt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die
Amplifikation in einem Raum durchgeführt wird, der von einer heizbaren
Metallschicht umgeben ist. Die Verwendung einer heizbaren Metallschicht,
die den Amplifikationsraum bevorzugt vollflächig umgibt, können kurze
Aufheizraten erzielt werden. Die Abkühlung kann dann auf herkömmliche
Weise beschleunigt werden, beispielsweise durch das Einblasen von Luft
oder durch die Verwendung von anderen Kühltechniken. Bevorzugt wird die
Amplifikation jedoch in einem kapillaren Raum durchgeführt. Aufgrund der
geringen Masse eines solchen kapillaren Raumes kann die Aufheiz- und
Abkühlgeschwindigkeit weiter erhöht werden. Besonders bevorzugt wird
eine Glas- oder/und Polystyrol-Kapillare verwendet, die von heizbaren,
bevorzugt von einer vollflächigen heizbaren Metallschicht umgeben ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein kapillares Reaktionsgefäß zur
Durchführung einer Amplifikation von Nukleinsäuren, welche von einer
heizbaren Metallschicht umgeben ist.
Die oben genannten Aspekte der Erfindung können entweder allein oder in
beliebiger Kombination verwendet werden, um eine Verbesserung der
Nukleinsäureanalytik zu erhalten. Die genannten Verbesserungen sind
insbesondere auch im Hinblick auf ein automatisierbares Gesamtverfahren
von Vorteil. Eine einfache und schnelle Nukleinsäureanalyse kann
insbesondere für Kontrollanalysen eingesetzt werden, die eine Aussage
darüber ermöglichen sollen, ob die Durchführung umfangreicherer und
aufwendigerer Testverfahren überhaupt indiziert ist. Die Verfahren sind auch
für die gleichzeitige Untersuchung von mehreren Proben geeignet.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die nachfolgenden
Beispiele weiter erläutert, worin die Fig. 1 bis 7 eine bevorzugte
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren zeigen.
Fig. 1 zeigt eine Spritzenanordnung zum Aufziehen einer Zellen
enthaltenden Probe, wobei in der linken Spritze ein Chaotrop
vorgelegt ist, und in der rechten Doppelkammerspritze mit
Nadelkolben Proteinase K trocken vorgelegt ist. Aus einem
Vorratsgefäß wird die Probe durch Betätigung des Kolbens der
rechten Spritze eingesaugt.
Fig. 2 zeigt das Mischen der Probe mit den vorgelegten Reagenzien sowie
den Aufschluß von nukleinsäurehaltigen Aggregaten. Dazu werden
die Kolben der Spritzen wechselseitig betätigt und der Aufschluß
durch Gleiten des Gemisches durch einen kapillaren Raum zwischen
den Spritzen unterstützt.
Fig. 3 zeigt das Binden der freigesetzten Nukleinsäure an eine
Kapillarinnenwand. Dazu wird die Probe mindestens einmal,
bevorzugt mehrmals, durch eine Kapillare zurück ins Probegefäß
gedrückt und gegebenenfalls wieder eingesaugt.
Fig. 4 zeigt das Waschen der an der Innenseite der Kapillare immobilisierten
Nukleinsäuren durch einmaliges Aufsaugen eines Waschpuffers.
Fig. 5 zeigt das Trocknen der gewaschenen immobilisierten Nukleinsäuren
durch langsames Einsaugen von Luft.
Fig. 6 zeigt die Aufnahme von Mastermix in die Kapillare, wobei der
Mastermix die immobilisierten Nukleinsäuren eluiert und gleichzeitig
alle für die nachfolgenden Amplifikation erforderlichen Reagenzien
erhält.
Fig. 7 zeigt die Amplifikation und Detektion der Amplifikationsprodukte.
Dazu wird die Kapillare mit einem Verschlußstopfen verschlossen,
welcher ein Fenster enthält. Nach Durchführung der Amplifikation,
erfolgt die Detektion durch Einstrahlung von Licht über die gezeigte
Optik (beispielsweise mittels Fluoreszenzdetektion).
Die verwendete Doppelkolbenspritze entspricht weitgehend einer
herkömmlichen Einmalspritze aus Polypropylen. Sie weist zwischen dem
Spritzenkörper und dem Auslaß ein Ventil oder einen Absperrhahn auf. Der
Doppelkolben ist so ausgeführt, daß im Inneren des Hauptkolbens die
Schubstange für den Mischkolben läuft.
Der Hauptkolben weist an seinem unteren Ende zwei Dichtbereiche auf.
Zum einen eine Dichtung zur Spritzenwand und zum anderen eine Dichtung
zur Schubstange des Mischkolbens. Der Hauptkolben wird durch einen
Schubzylinder bewegt, der über den Spritzenkörper hinausragt und an
seinem oberen Ende so ausgeführt ist, daß er sicher mit der Hand oder
alternativ mit einem Instrumententeil erfaßt und bewegt werden kann.
Der Mischkolben bildet an seinem unteren Ende mit der Spritzenwand einen
schmalen Spalt. Die Schubstange des Mischkolbens läuft durch den Boden
des Hauptkolbens und ragt bei jeder Stellung des Hauptkolbens noch aus
dem Schubzylinder des Hauptkolbens. Am oberen Ende ist sie so
ausgeführt, daß sie sicher mit der Hand oder alternativ einem
Instrumententeil erfaßt und bewegt werden kann.
Der Absperrhahn kann wahlweise manuell oder automatisch betätigt
werden, wobei er beide Stellungen (offen/geschlossen) dauerhaft einnehmen
kann.
Die Öffnung der Spritze für Fluide ist in Form eines üblichen Konus
ausgeführt. Günstigerweise ist der Konus passend zur Aufnahme von einmal
Pipettenspitzen und der Amplifikationskapillare.
Anstelle der oben beschriebenen Doppelkolbenspritze können auch separate
Spritzen, beispielsweise zwei Einmalspritzen aus Polypropylen über einen
Kunststoffdreiwegehahn gekoppelt werden. Zum Aufziehen von Reagenz-
bzw. Probe wird an den Dreiwegehahn über einen Konus eine
Einmalpipettenspitze angedockt. Die Flüssigkeit wird dann durch Aufziehen
der Spritzenkolben in eine der Spritzen aufgenommen. Es kann auch noch
weitere Flüssigkeit in die gleiche Spritze gesaugt werden. Zum Mischen wird
der Dreiwegehahn so gestellt, daß die beiden Spritzen verbunden sind und
ein Austritt der aufgenommenen Probe bzw. Reagenzien verhindert wird.
Durch wechselseitiges Betätigen der beiden Spritzenkolben wird die
Flüssigkeit durch die Bohrung im Hahnkücken von einer zur anderen Spritze
gedrückt und dabei unter hohen Scherkräften gemischt.
Um das Amplifikationsvolumen exakt in die Amplifikationskapillare
aufzuziehen, wird einer der Kolben der Spritzen als Doppelkolben so
ausgeführt, daß er zentral einen sehr schmalen Kolben aufnimmt, z. B. einen
Kolben aus Metall- oder Kunststoffdraht, der einen Durchmesser
entsprechend dem Innendurchmesser der Amplifikationskapillare aufweist.
Damit ist eine genaue Aufnahme von Flüssigkeit in die
Amplifikationskapillare möglich und es wird ein unbeabsichtigtes Einsaugen
von Mastermix und Eluat in den Abfallbehälter vermieden.
Die verwendete Amplifikationskapillare hat bevorzugt einen
Innendurchmesser von ca. 1 mm und weist an der inneren Oberfläche eine
Glasoberfläche auf. Die Glasoberfläche kann glatt oder zur Vergrößerung der
Oberfläche aufgerauht oder strukturiert sein. Die Kapillare selbst kann aus
Metall, Glas oder Kunststoff hergestellt sein, wobei die Wandung möglichst
dünn ausgeführt ist. Die äußere Oberfläche ist aus elektrisch leitendem
Material, bevorzugt aus Metall. Das elektrisch leitende Material hat einen
elektrischen Widerstand mit einem positiven oder negativen
Temperaturkoeffizienten. An beiden Enden der Kapillare befindet sich eine
Beschichtung mit hoher elektrischer Leitfähigkeit und geringem
Kontaktwiderstand zur Ausbildung eines elektrischen Kontakts zwischen der
Kapillare und dem Instrument. Durch Anlegen einer elektrischen Spannung
fließt Strom, der die leitfähige Schicht und damit die Kapillare erwärmt. Der
Strom ist abhängig von der Temperatur und kann somit abhängig auch zur
Temperaturmessung herangezogen werden.
Die Amplifikationskapillare wird bevorzugt mit Verschlußstoffen versehen,
welche aus Kunststoff, insbesonder einem optisch klaren Material gebildet
sind. Besonders bevorzugt sind Polycarbonat und Polypropylen.
Günstigerweise ist der Verschlußstopfen so ausgeführt, daß ein Stopfen in
den den Innenraum der Kapillare ragt und das Äußere von einem Hemd
umfaßt wird. Durch die der Kapillare abgewandte Seite kann Licht
ausgestrahlt bzw. eingeleitet werden. Dazu kann in den Verschlußstopfen
ein optisches Element, beispielsweise ein Fenster oder eine Linse integriert
sein. Die die Wandung des Hemdes des Stopfens kann zusätzlich ein
elektrisch leitendes Element, z. B. ein Draht integriert sein, der beim
Aufdrücken des Stopfens auf die Kapillare einen elektrischen Kontakt
herstellt.
Zur Bindung von Nukleinsäuren nach chaotroper Lyse an eine Glasvlies-
Oberfläche wurde ein Glasvlies in einen Spritzenvorsatzfilter integriert. Der
direkte Einsatz des Glasvlieses in den Amplifikationsraum ist aufgrund einer
möglichen Inhibition des Glasvliesmaterial während der
Amplifikationsreaktion, z. B. einer PCR-Reaktion nicht vorteilhaft. 250 µl
Chlamydien-haltiger Zellkultur-Überstand (1%) wurden durch chaotrope Lyse
lysiert. Das Lysat wurde mittels einer Einmalspritze über das Glasvlies
geleitet, um ein Binden der Nukleinsäuren zu bewirken. Als Lyse-, Wasch-
und Elutionspuffer wurden die entsprechenden Lösungen des High Pure
Plasmid Isolation Kits (Boehringer Mannheim Kat. No. 1754777) verwendet.
Das bei den Versuchen eingesetzte Glasvlies war in seiner
Zusammensetzung identisch mit dem Glasvlies der Filtertubes des High Pure
Plasmid Isolation Kits. Anschließend wurde mit Waschpuffer gewaschen
und mit Luft getrocknet. Zu beachten ist hierbei, daß Alkoholreste aus dem
Waschpuffer möglichst vollständig entfernt werden. Anschließend wurden
die Nukleinsäuren eluiert und eine PCR-Amplifikation und eine Gel-Detektion
durchgeführt. Bevorzugt wird die Elution der Nukleinsäure mit der Master-
Lösung durchgeführt, die bereits alle für die Amplifikation erforderlichen
Reagenzien enthält. Es wurde zwar festgestellt, daß die Vliespassage zu
einem Amplifikationsverlust bei der PCR-Reaktion führt (105-CT-Plasmide);
dies wird allerdings durch die hohe Bindekapazität und hohe
Bindegeschwindigkeit des Glasvliesmaterials kompensiert.
Als Primer für die Amplifikation wurden die Oligonukleotide CP24 5'-
GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3' (Position 195-219 von pCTT1)
und CP27: 5'-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3' (Position 401-376
von pCTT1) gegebenenfalls im 5'-biotinylierter oder 5'-digoxigenylierter
Form verwendet.
Das Reaktionsvolumen war 100 µl (4 mM MgCl2, jeweils 0,1 mM dNTP,
jeweils 300 nM Primer CP24 und CP27, 2,5 U Taq-Polymerase, 2 U UNG
(Uracil-DNA-Glycosylase) und Matrize in PCR-Puffer (Roche Diagnostics
Katalog-Nr. 1600753).
Die Reaktionsführung war wie folgt:
- - 10 min 37°C, 5 min bei 95°C, 1 min bei 60°C
- - 34 Zyklen mit jeweils 30 s bei 95°C und 60 s bei 60°C
- - 10 min bei 72°C
- - Halten bei 50°C
Ein wesentlicher Vorteil bei der Probenvorbereitung in einer Glaskapillare,
beispielsweise in Kombination mit einer Spritze, besteht in der einfachen
manuellen Bedienbarkeit sowie der einfachen Integration mit der
nachfolgenden Amplifikation. Die bei der Probenvorbereitung verwendete
Kapillare kann mit den daran gebundenen Nukleinsäuren nach Befüllen mit
Mastermix direkt für die Amplifikation verwendet werden. Der
Probenvorbereitungsraum ist somit zugleich Amplifikationsraum. Die
Verwendung einer Glaskapillare ermöglicht sowohl eine schnelle
Amplifikation als auch eine Online-Detektion und stellt somit eine
hochintegrierte Gesamtlösung für den Nukleinsäuren-Nachweis dar.
Das Probematerial wird bevorzugt mehrmals durch die Glaskapillare geleitet,
beispielsweise mit einer Schlauchpumpe bei Inkubationszeiten von etwa 20 min.
Es ist aber auch möglich, die Probe-enthaltende Lösung mittels einer
manuel bedienenden Spritze mit einer Inkubationszeit von lediglich 1 min
durch die Kapillare zu leiten, wobei immer noch eine ausreichende
Sensitivität des Tests erzielt wird. Besonders vorteilhaft ist es, auch hier zur
Eluierung der immobilisierten Nukleinsäuren direkt eine Mastermix-Lösung
zu verwenden, so daß der Amplifikationsschritt, beispielsweise eine PCR
unter Wegfall eines separaten Elutionsschrittes durchgeführt werden kann.
Es wurde festgestellt, daß Mikroorganismen in wässrigem Milieu an
Polystyroloberflächen gebunden werden können. So binden beispielweise
Chlamydien an eine Polystyrol-Einmalimpföse in einem 20minütigen
Inkubationsschritt und können direkt in einem PCR-Reaktionsansatz
überführt werden. Es wurden deshalb Polystyrolkapillaren in Verbindung mit
einer Einmalspritze eingesetzt, um eine hochintegrierte Vorrichtung für einen
Chlamydien-Nukleinsäurenachweis herzustellen. Bei einer Inkubationszeit
einer Chlamydien-enthaltenden Probe von 1 min konnte je nach
Verdünnungsmedium (H2O, PBS oder Urin) eine Sensitivität zwischen 0,1
bis 0,01% Zellkultur-Überstand erhalten werden.
Zur Herstellung von Polystyrolkapillaren wurden Standard-Polystyrol-
Reaktionsgefäße (Sarstedt) nach Erwärmen zu Kapillaren ausgezogen und
in Kombination mit einer Einmalspritze verwendet. Es zeigte sich, daß die
Polystyrolkapillaren hervorragend zur Probenvorbereitung von Nukleinsäuren
geeignet sind. Bei einer solchen Probenvorbereitung gelang es 300 µl eines
0,01% Zellkulturüberstands in einer nachfolgenden PCR-Reaktion und
Detektion noch deutlich als positiv nachzuweisen. Es gelang somit, unter
Verwendung einer Polystyrolkapillare eine herkömmlichen Labormethoden
vergleichbare Sensitivität zu erzielen.
Als Glaskapillare wurde eine 5 µl Modulohm-Kapillare (Borsilikatglas) mit 3 cm
Länge verwendet. 250 µl Probe + 50 µl Proteinase K (20 mg/ml) und
250 µl Lysereagenz (5,4 M GuSCN, 20% Triton X-100, 1% DTT, 10 mM
Tris HCl, pH 6) wurden nach kurzem vortexen für 10 min bei 70°C inkubiert
und anschließend über 5 min auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Eine
Spritze (10 ml, Becton Dickinson) wurde über einen kurzen
Kunststoffschlauch mit der Glaskapillare verbunden. Das Lysat wurde über
2 min mit gleichmäßiger Bewegung in die Spritze aufgezogen und
ausgestoßen. Während dieser Zeit fand eine Bindung der Nukleinsäuren an
die Kapillare statt. Dann wurden 800 µl Waschpuffer (20 mM NaCl, 10 mM
Tris HCl pH 7,5, 70 Vol-% Ethanol) mit der Spritze über 2 min durch die
Kapillare gespült und die Kapillare anschließend durch Aufziehen von Luft
über 1 min getrocknet. Dann wurden 100 µl Elutionspuffer (10 mM Tris HCl
pH 8,5) mit der zweiten Spritze (1 ml; Fa. Becton Dickinson) in die Kapillare
aufgezogen. Die PCR-Reaktion erfolgte bei den in 5 angegebenen
Bedingungen. Nachgewiesen wurde mittels einer Nachweissonde (5'-
GTCTCTCATCGAGACAAAGTG-3' aus dem Chlamydia trachomatis-Plasmid
pCTT [C.thrachomatis Basen 1-7496] entsprechend Position 354-374 von
pCTT1 (Sriprakash und Macavoy, Plasmid 18 (1987), 205-214) nach
Standardvorgehensweise.
Polystyrolgefäße (Sarstedt) wurden mit einer Heizlampe erhitzt und zu
Kapillaren mit einem Durchmesser zwischen 1 und 2 mm ausgezogen. Nach
dem Erkalten wurden 3 cm lange Teilstücke abgetrennt. Eine Spritze (10 ml,
Bectonc Dickinson) wurde über einen kurzen Kunststoffschlauch mit der
Polystyrolkapillare verbunden. Dann wurde die Probe für 1 min mittels der
Spritze durch die Kapillare gespült. Anschließend wurden 800 µl
Waschpuffer mittels der Spritze durch die Kapillare gezogen und die
Kapillare durch Aufziehen von Luft für 1 min getrocknet. Die Amplifikation
mittels einer PCR-Reaktion und Detektion mittels Hybridisierung mit einer
Nachweissonde wie unter 8 beschrieben können anschließend direkt unter
Verwendung der Polystyrolkapillare oder durch Zerschneiden der Kapillare
und Überführen in ein PCR-Reaktionsgefäß durchgeführt werden.
Claims (35)
1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe
umfassend die Schritte:
- a) Reinigen der Nukleinsäuren in einem Bindungsraum, wobei die Nukleinsäuren immobilisiert und Verunreinigungen abgetrennt werden,
- b) Eluieren der immobilisierten Nukleinsäuren,
- c) Amplifizieren der gereinigten Nukleinsäuren in einem Amplifikationsraum und
- d) Detektieren der Amplifikationsprodukte in einem Detektionsraum,
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Detektionsraum mindestens einen Teil des
Amplifikationsraumes oder/und mindestens einen Teil des
Bindungsraumes umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Bindungs- oder/und Amplifikationsraum ein zumindest
teilweise kapillarer Raum verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß in Schritt (a) eine Adsorption von Nukleinsäuren an eine Glas
oberfläche durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß zum Eluieren in Schritt (b) eine Lösung eingesetzt wird, die alle
für die Amplifizierung erforderlichen Reagenzien enthält.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Amplifikationsraum thermostatisierbar ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Amplifikationsraum mit einer heizbaren Metallschicht
umgeben ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß vor dem Reinigen der Nukleinsäuren in Schritt (a) eine Lyse von
nukleinsäurehaltigen Proben durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe Zellen umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen an eine Polystyroloberfläche gebunden werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Reinigen der Nukleinsäuren, das Amplifizieren der gereinigten
Nukleinsäuren und das Detektieren der Amplifikationsprodukte im
gleichen Reaktionsraum durchgeführt werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß alle Schritte in einer geschlossenen Vorrichtung durchgeführt
werden.
13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum
Nachweis von Pathogenen in biologischen Proben.
14. Vorrichtung zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe,
insbesondere durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
12, umfassend:
- a) einen Bindungsraum zur Reinigung von Nukleinsäuren, in dem die Nukleinsäuren immobilisiert und Verunreinigungen abgetrennt werden,
- b) einen Amplifikationsraum zur Amplifikation von Nukleinsäuren,
- c) einen Detektionsraum zur Detektion von Nukleinsäuren und gegebenenfalls
- d) Reservoirs oder/und Zuleitungen für Probe oder/und Reagenzien, dadurch gekennzeichnet,
15. Vorrichtung nach Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Detektionsraum mindestens einen Teil des
Amplifikationsraums oder/und des Bindungsraums umfaßt.
16. Vorrichtung nach Anspruch 14 oder 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Bindungs- oder/und Amplifikationsraum zumindest teilweise
als kapillarer Raum ausgebildet ist.
17. Verfahren zum Aufschluß einer Nukleinsäure enthaltenden Matrix,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Aufschlußmischung umfassend die Nukleinsäure enthaltende
Matrix und ein Aufschlußreagenz, durch einen kapillaren Raum
bewegt wird, wobei die Matrix aufgebrochen und die darin
enthaltenen Nukleinsäuren freigesetzt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei der nukleinsäurehaltigen Matrix um Zellen oder/und
Zellfraktionen handelt.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Aufschlußreagenz verwendet wird, das ein lytisches Enzym
oder/und eine chaotrope Substanz enthält.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem kapillaren Raum um eine Glaskapillare oder/und
eine Polystyrol-Kapillare handelt.
21. Verfahren nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem kapillaren Raum um eine Borsilikat-beschichtete
Kapillare handelt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe mehrmals durch den kapillaren Raum hindurch geleitet
wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Volumenverhältnis von Aufschlußmischung zu kapillarem
Raum größer als 10 : 1 ist.
24. Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Mikroorganismen,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Mikroorganismen enthaltende Probe mit einer
Polystyroloberfläche unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen
die Mikroorganismen an die Polystyroloberfläche binden, andere
Probenbestandteile abtrennt, und die Nukleinsäuren aus den
Mikroorganismen gewinnt.
25. Verfahren nach Anspruch 24,
dadurch gekennzeichnet,
daß weiterhin ein Salz zugesetzt wird, um die Bindung der
Mikroorganismen an die Polystyroloberfläche zu unterstützen.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Polystyrol-Kapillare verwendet.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe mehrmals über die Polystyrol-Oberfläche geleitet wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei den Mikroorganismen um Chlamydien handelt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28,
dadurch gekennzeichnet,
daß Urin als Probe verwendet wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29,
dadurch gekennzeichnet,
daß anschließend eine Amplifizierung der isolierten Nukleinsäuren
durchgeführt wird.
31. Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren, das Schritte bei
unterschiedlichen Temperaturen umfaßt,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Amplifikation in einem Raum durchgeführt wird, der von einer
heizbaren Metallschicht umgeben ist.
32. Verfahren nach Anspruch 31,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Amplifikation in einem kapillaren Raum durchgeführt wird.
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32
dadurch gekennzeichnet,
daß der Raum von einer vollflächigen Metallschicht umgeben ist.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Glas- oder/und Polystyrol-Kapillare verwendet wird, die von
einer heizbaren Metallschicht umgeben ist.
35. Kapillares Reaktionsgefäß zur Durchführung einer Amplifikation von
Nukleinsäuren, welches von einer heizbaren Metallschicht umgeben
ist.
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