DD301459A7

DD301459A7 - Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekülen

Info

Publication number: DD301459A7
Application number: DD30458087A
Authority: DD
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1993-02-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekülen. Erfindungsgemäß wird ein schwerlöslicher Feststoff, der Metallionen, ausgenommen Al-Ionen, in der Matrix oder in einer Zwischenschicht enthält, mit einer bifunktionellen Verbindung umgesetzt, die als funktionelle Gruppen eine oder gegebenenfalls zwei geminale Phosphonsäuregruppen und eine funktionelle Gruppe hoher chemischer Reaktivität enthält.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekülen auf schwerlösliche Feststoffe. Anwendungsgebiet der Erfindung ist der Einsatz der Produkte in der Soffwandlung (Biotechnologie), Trennung (Affinitäts-, Immunchromatographie) und Analytik (Festphasendiagnostik).

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß Biomakromoleküle an schwerlösliche Feststoffe durch Adsorption, Ionenaustausch oder kovalonte Bindung immobilisiert werden. Die letztere Methode ist besonders gut zur Erzeugung stabiler Bindungen geeignet. Kovalente Bindung erfolgt nach einer chemischen Modifizierung (Aktivierung) des Feststoffs und/oder der zu immobilisierenden Verbindung. Als Feststoffe werden natürliche Stoffe (Mineralien, Chitin u.a.) und syn'hetische anorganische Stoffe (Glas, Silikate u.a.) oder organische Polymere eingesetzt. Für kontinuierliche technisch durchgeführte Prozesse werden anorganische Feststoffe als Trägermaterialien aufgrund ihrer guten mechanischen Eigenschaften ausgewählt. Sie erfordern jedoch als ersten Schritt der Immobilisierung in der Regel eine Funktionalisierung durch reaktionsfähige Überzüge.

Es sind Verfahren zum Aufbringen organischer Beschichtungen auf organische oder anorganische Feststoffe bekannt, die unter Verwendung von bifunktionellen Silanen zu einer Funktionalisierung führen. Dabei wird ein Silan der allgemeinen Formel (R₁O)₃SiR₂ImItR, einem Alkyl-, R₂ einem Vinyl-, γ-Aminopropyl-, Epoxi-Alkyl-SH- oder anderem Rest) in organischer oder wäßrig organischer Lösung eingesetzt und das Primärprodukt unter Bildung von C-O-Si-, Metall-O-Si und/oder Si-O-Si-Bindungen bei erhöhter Temperatur kondensiert. Beides, die Verwendung organischer Lösungsmittel und Kondensation bei erhöhter Temperatur sind relativ kostenaufwendig ebenso wie die Herstellung der Silane (U. DESCHLER, P.KLEINSCHMIT u. P. PANSTER Angew. Chemie 9811986] 237-253).

Die Immobilisierung von Biomakiomolekülen an derart silanisierte Träger erfolgt durch direkte Kopplung (z.B. Reaktion von Aminogruppen des Biomakromoleküls mit iEpoxi >ilan) nach Modifizierung der Überzugsschicht (z. B. γ-Aminopropylsilan durch bifunktionelle Verbindungen wie Dialdehyde, Karbodimide, Chinone u. a.) oder nach Modifizierung des Biomakromoleküls (z. B. Perjodatoxidation von Glykoproteinen zu aldehydhaltigen Proteinen, Einführung von polymerisierbaren Doppelbindungen u.a.). Nachteil des bekannten Verfahrens ist der mehrstufige Prozeß der Silanisierung und Kondensation. Aus EP 218506 sind Aluminium-Verbindungen bekannt, die mit funktioneilen Phosphatgruppen versehen sind und Träger für Biomoleküle sind. Ihre Herstellung ist aufwendig.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekulen zu entwickeln, das die Primärfunktionalisierung eines Trägermaterials durch einfaches Behandeln mit einer wäßrigen Lösung des Funktionalisierungsreagenz bei großer Vielfalt der funktionellen Gruppen ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein schwerlöslicher, mehrwertige Metallionen - ausgenommen Al-Ionen - enthaltender Feststoff mit einer bifunktionellen Verbindung behandelt, die eine oder zwei geminale Phosphonsäuregruppen und eine funktioneile Gruppe hoher chemischer Reaktivität enthält, wobei diese Gruppe anschließend direkt oder nach chemischer Modifizierung mit dem Biomakromolekül direkt oder nach dessen chemischer Modifizierung reagiert. Als Feststoffe werden Metalloxide, -salze, Gläser oder organische Polymere benutzt. Als Metallionen kommen dabei solche in Frage, die mit Phosphonsäuren schwer lösliche Verbindungen oder stabile Komplexe bilden und a priori in der Matrix enthalten oder als Zwischenschicht aufgebracht sind. Biomakromoleküle sind vorzugsweise Enzyme, Antigene, Antikörper oder Nukleinsäuren, gegebenenfalls auch Polysaccharide. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Immobilisierung von Biomakromolekülen nach direkter Beschichtung von

Metalloxiden und -salzen, z. B. Silikaten, Phosphaten u.a. oder nach Behandlung von nicht metallhaltigen anorganischen Stoffen wie Siliziumdioxid oder organischen Polymeren, z.B. Zellulose mit rrotallorganischen Verbindungen, Salzen, Oxysalzen, Metallhalogeniden oder -oxyhalogeniden zur Aufbringung funktioneller Beschichtungen auf diese Stoffe. Als bifunktionelle Phosphorsäurederivate werden Verbindungen der allgemeinen Formel

5' H₂PO₃-CH-R₂

genutzt, wobei R, = -H oder -PO₃H₂ und R₂ ein -OH, -NH₂ oder -SH substituierter Alkyl-, Alkylen-, Aryl-, Alkylenaryl- oder Alkylarylrest, eine -O-Acryloyl, -N-Acryloyl- oder Epoxigruppe ist.

Besonders der niedrige Preis und die leichte Zugänglichkeit substituierter Phosphonsäuren sind für das erfindungsgemäße Verfahren von entscheidender Bedeutung, da breite Variationen der Alkyl- und Arylreste zahlreiche spezifische Anwendungen ermöglichen.

Die funktionell Gruppe R: wird für Copolymerisation (Acryloyl- oder Vinylgruppe), Aktivierung mit bifunktionellen Verbindung·, τ (Dialdehyden, Bisdiazoverbindungen, Carbodiimiden, Carbonyldiimidazol, Dicarbonsäurechloriden, Chinonen

u. a.) im Fall von ω-Aminogruppen oder für direkte Kopplung (z. B. Diazophosphonsäuren) genutzt.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

10g Hydroxylapatit werden in 50ml einer 6%igen Lösung von gem. Vinylbisphosphonsäure in Wasser suspendiert, nach 1h abfiltriert und gewaschen. Anschließend wird eine Lösung von 0,5g Acrolein und 0,5g Acrylsäure in 50 ml Wasser zugegeben, nach 2h abfiltriert und der feuchte Träger durch Bestrahlung mit einer Polymerschicht überzogen (⁶⁰Co-QUeIIe, 10⁶ rad). Nach Waschung mit Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 6,8) werden 100mg Meerrettichperoxidase-Antikörper (Kaninchen) in 50ml Puffer zugegeben.

In 24 h bei 4°C ist die Immobilisierung beendet. Das Produk; wird zur Reinigung von Peroxidase genutzt.

Beispiel 2

10g poröses Glas werden mit einer Lösung von 2g Titantetrachlorid in 25 ml Tetrachlormethan 2 h behandelt, mit Tetrachlormethan, Aceton und Wasser gewaschen und anschließend mit 50ml einer 6%igen Lösung von 3-(4-Aminophenyl)-propan-1,1-bisphosphonsäure funktionalisiert. Das Produkt wird in eiskalter 10%iger Salzsäure 0-4⁰C) suspendiert, mit einer Lösung von 200mg Natriumnitrit in 2 ml kalter Salzsäure versetzt und nach 30min eiskalter verdünnter Salzsäure und Eiswasser gewaschen. Anschließend wird das Glas in eine Lösung von 200mg Glukoseoxidase in Acetatpuffer (0,1 mol/l, pH 5,6) gebracht und 24 h bei 4^CC geschüttelt. Danach wird der Überschuß an Enzym vollständig ausgewaschen und das Produkt in einem analytischen Reaktorzur Glukosebestimmung eingesetzt.

Beispiel 3

10g makroporöser mit Glutaraldehyd vernetzter Polyvinylalkohol werden in einer Lösung von 2g Tetraethoxyzirkonat in 100ml Toluen5h auf 80°C erwärmt, nach Abkühlung mit Toluen, Aceton, Ethanol und Wasser gewaschen und anschließend mit 50ml einer 5%igen Lösung von 2-Aminoethan-1,1-bisphosphonsäure 2h gerührt. Nach Waschen mit Wasser und Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 7,0) wird die Aminogruppe mit Chinonüberschuß (3mmol/l in o. g. Puffer) umgesetzt. Das Produkt wird gründlich gewaschen und mit 20ml einer Lösung von Penicillinacylase (100Einheiten/ml) 10h bei Raumtemperatur gerührt, gewaschen (H₂O, Puffer) und zur Spaltung von Penicillin G eingesetzt.

In Betracht gezogene Druckschrift: EP-PS 218506

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß ein schwerlöslicher Feststoff der Metallionen -ausgenommen Aluminium-Ionen -in der Matrix oder in einer Zwischenschicht enthält, die mit Phosponaten schwerlösliche Verbindungen oder stabile Komplexe bilden, mit einer bifunktionellen Verbindung umgesetzt wird, die als funktionell Gruppen eine oder gegebenenfalls zwei geminale Phosphonsäuregruppen und eine funktioneile Gruppe hoher chemischer Reaktivität enthält, die anschließend direkt oder nach chemischer Modifizierung mit dem Biomakromolekül direkt oder nach dessen chemischer Modifizierung reagiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomakromoleküle Enzyme, Antigene, Antikörper oder Nukleinsäuren eingesetzt werden,

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als schwerlöslicher Feststoff Metalloxide, -salze, Gläser oder organische Polymere eingesetzt werden.