DD301459A7 - Process for the immobilization of biomacromolecules - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekülen. Erfindungsgemäß wird ein schwerlöslicher Feststoff, der Metallionen, ausgenommen Al-Ionen, in der Matrix oder in einer Zwischenschicht enthält, mit einer bifunktionellen Verbindung umgesetzt, die als funktionelle Gruppen eine oder gegebenenfalls zwei geminale Phosphonsäuregruppen und eine funktionelle Gruppe hoher chemischer Reaktivität enthält.The invention relates to a method for the immobilization of biomacromolecules. According to the invention, a sparingly soluble solid containing metal ions, excluding Al ions, in the matrix or in an intermediate layer is reacted with a bifunctional compound containing as functional groups one or optionally two geminal phosphonic acid groups and one functional group of high chemical reactivity.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekülen auf schwerlösliche Feststoffe. Anwendungsgebiet der Erfindung ist der Einsatz der Produkte in der Soffwandlung (Biotechnologie), Trennung (Affinitäts-, Immunchromatographie) und Analytik (Festphasendiagnostik).The invention relates to a method for the immobilization of biomacromolecules on sparingly soluble solids. The field of application of the invention is the use of the products in bulk conversion (biotechnology), separation (affinity, immunochromatography) and analytics (solid-phase diagnostics).
Es ist bekannt, daß Biomakromoleküle an schwerlösliche Feststoffe durch Adsorption, Ionenaustausch oder kovalonte Bindung immobilisiert werden. Die letztere Methode ist besonders gut zur Erzeugung stabiler Bindungen geeignet. Kovalente Bindung erfolgt nach einer chemischen Modifizierung (Aktivierung) des Feststoffs und/oder der zu immobilisierenden Verbindung. Als Feststoffe werden natürliche Stoffe (Mineralien, Chitin u.a.) und syn'hetische anorganische Stoffe (Glas, Silikate u.a.) oder organische Polymere eingesetzt. Für kontinuierliche technisch durchgeführte Prozesse werden anorganische Feststoffe als Trägermaterialien aufgrund ihrer guten mechanischen Eigenschaften ausgewählt. Sie erfordern jedoch als ersten Schritt der Immobilisierung in der Regel eine Funktionalisierung durch reaktionsfähige Überzüge.It is known that biomacromolecules are immobilized on poorly soluble solids by adsorption, ion exchange or kovalente bonding. The latter method is particularly well suited to the generation of stable bonds. Covalent bonding occurs after a chemical modification (activation) of the solid and / or the compound to be immobilized. As solids, natural substances (minerals, chitin, etc.) and synethetic inorganic substances (glass, silicates, etc.) or organic polymers are used. For continuous, technically performed processes, inorganic solids are selected as support materials because of their good mechanical properties. However, as a first step of immobilization they usually require functionalization by reactive coatings.
Es sind Verfahren zum Aufbringen organischer Beschichtungen auf organische oder anorganische Feststoffe bekannt, die unter Verwendung von bifunktionellen Silanen zu einer Funktionalisierung führen. Dabei wird ein Silan der allgemeinen Formel (R1O)3SiR2ImItR, einem Alkyl-, R2 einem Vinyl-, γ-Aminopropyl-, Epoxi-Alkyl-SH- oder anderem Rest) in organischer oder wäßrig organischer Lösung eingesetzt und das Primärprodukt unter Bildung von C-O-Si-, Metall-O-Si und/oder Si-O-Si-Bindungen bei erhöhter Temperatur kondensiert. Beides, die Verwendung organischer Lösungsmittel und Kondensation bei erhöhter Temperatur sind relativ kostenaufwendig ebenso wie die Herstellung der Silane (U. DESCHLER, P.KLEINSCHMIT u. P. PANSTER Angew. Chemie 9811986] 237-253).Methods are known for applying organic coatings to organic or inorganic solids which result in functionalization using bifunctional silanes. Here, a silane of the general formula (R 1 O) 3 SiR 2 ImItR, an alkyl, R 2 is a vinyl, γ-aminopropyl, epoxy-alkyl-SH or other radical) in organic or aqueous-organic solution is used and condensing the primary product to form CO-Si, metal-O-Si and / or Si-O-Si bonds at elevated temperature. Both, the use of organic solvents and condensation at elevated temperature are relatively expensive as well as the production of silanes (U.D. DESCHLER, P. KLEINSCHMIT and P. PANSTER Angew. Chemie 9811986] 237-253).
Die Immobilisierung von Biomakiomolekülen an derart silanisierte Träger erfolgt durch direkte Kopplung (z.B. Reaktion von Aminogruppen des Biomakromoleküls mit iEpoxi >ilan) nach Modifizierung der Überzugsschicht (z. B. γ-Aminopropylsilan durch bifunktionelle Verbindungen wie Dialdehyde, Karbodimide, Chinone u. a.) oder nach Modifizierung des Biomakromoleküls (z. B. Perjodatoxidation von Glykoproteinen zu aldehydhaltigen Proteinen, Einführung von polymerisierbaren Doppelbindungen u.a.). Nachteil des bekannten Verfahrens ist der mehrstufige Prozeß der Silanisierung und Kondensation. Aus EP 218506 sind Aluminium-Verbindungen bekannt, die mit funktioneilen Phosphatgruppen versehen sind und Träger für Biomoleküle sind. Ihre Herstellung ist aufwendig.Immobilization of biomakiomolecules to such silanized carriers is effected by direct coupling (eg reaction of amino groups of the biomacromolecule with iEpoxiilane) after modification of the coating layer (eg γ-aminopropylsilane by bifunctional compounds such as dialdehydes, carbodimides, quinones, etc.) or after modification of the biomacromolecule (eg, periodate oxidation of glycoproteins to aldehyde-containing proteins, introduction of polymerizable double bonds, etc.). Disadvantage of the known method is the multi-stage process of silanization and condensation. EP 218506 discloses aluminum compounds which are provided with functional phosphate groups and are carriers for biomolecules. Their production is complicated.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomakromolekulen zu entwickeln, das die Primärfunktionalisierung eines Trägermaterials durch einfaches Behandeln mit einer wäßrigen Lösung des Funktionalisierungsreagenz bei großer Vielfalt der funktionellen Gruppen ermöglicht.The object of the invention is to develop a method for the immobilization of biomacromolecules, which allows the primary functionalization of a carrier material by simply treating with an aqueous solution of the functionalizing reagent with a large variety of functional groups.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Erfindungsgemäß wird ein schwerlöslicher, mehrwertige Metallionen - ausgenommen Al-Ionen - enthaltender Feststoff mit einer bifunktionellen Verbindung behandelt, die eine oder zwei geminale Phosphonsäuregruppen und eine funktioneile Gruppe hoher chemischer Reaktivität enthält, wobei diese Gruppe anschließend direkt oder nach chemischer Modifizierung mit dem Biomakromolekül direkt oder nach dessen chemischer Modifizierung reagiert. Als Feststoffe werden Metalloxide, -salze, Gläser oder organische Polymere benutzt. Als Metallionen kommen dabei solche in Frage, die mit Phosphonsäuren schwer lösliche Verbindungen oder stabile Komplexe bilden und a priori in der Matrix enthalten oder als Zwischenschicht aufgebracht sind. Biomakromoleküle sind vorzugsweise Enzyme, Antigene, Antikörper oder Nukleinsäuren, gegebenenfalls auch Polysaccharide. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Immobilisierung von Biomakromolekülen nach direkter Beschichtung vonAccording to the invention, a sparingly soluble, polyvalent metal ion except Al-ion-containing solid is treated with a bifunctional compound containing one or two geminal phosphonic acid groups and a functional group of high chemical reactivity, which group then directly or after chemical modification with the biomacromolecule directly or reacts after the chemical modification. The solids used are metal oxides, salts, glasses or organic polymers. Suitable metal ions are those which form compounds or stable complexes which are sparingly soluble with phosphonic acids and which are contained a priori in the matrix or are applied as an intermediate layer. Biomacromolecules are preferably enzymes, antigens, antibodies or nucleic acids, optionally also polysaccharides. The inventive method is suitable for the immobilization of biomacromolecules after direct coating of
Metalloxiden und -salzen, z. B. Silikaten, Phosphaten u.a. oder nach Behandlung von nicht metallhaltigen anorganischen Stoffen wie Siliziumdioxid oder organischen Polymeren, z.B. Zellulose mit rrotallorganischen Verbindungen, Salzen, Oxysalzen, Metallhalogeniden oder -oxyhalogeniden zur Aufbringung funktioneller Beschichtungen auf diese Stoffe. Als bifunktionelle Phosphorsäurederivate werden Verbindungen der allgemeinen FormelMetal oxides and salts, e.g. For example, silicates, phosphates and the like. or after treatment of non-metal-containing inorganic materials such as silica or organic polymers, e.g. Cellulose containing organic organotin compounds, salts, oxysalts, metal halides or oxyhalides for applying functional coatings to these substances. As bifunctional phosphoric acid derivatives are compounds of the general formula
5' H2PO3-CH-R2 5 'H 2 PO 3 -CH-R 2
genutzt, wobei R, = -H oder -PO3H2 und R2 ein -OH, -NH2 oder -SH substituierter Alkyl-, Alkylen-, Aryl-, Alkylenaryl- oder Alkylarylrest, eine -O-Acryloyl, -N-Acryloyl- oder Epoxigruppe ist.wherein R, = -H or -PO 3 H 2 and R 2 is an -OH, -NH 2 or -SH substituted alkyl, alkylene, aryl, Alkylenaryl- or alkylaryl, an -O-acryloyl, -N -Acryloyl or epoxy group is.
Besonders der niedrige Preis und die leichte Zugänglichkeit substituierter Phosphonsäuren sind für das erfindungsgemäße Verfahren von entscheidender Bedeutung, da breite Variationen der Alkyl- und Arylreste zahlreiche spezifische Anwendungen ermöglichen.In particular, the low price and easy accessibility of substituted phosphonic acids are of critical importance to the process of this invention, as broad variations of the alkyl and aryl radicals allow numerous specific applications.
Die funktionell Gruppe R: wird für Copolymerisation (Acryloyl- oder Vinylgruppe), Aktivierung mit bifunktionellen Verbindung·, τ (Dialdehyden, Bisdiazoverbindungen, Carbodiimiden, Carbonyldiimidazol, Dicarbonsäurechloriden, ChinonenThe functional group R: is used for copolymerization (acryloyl or vinyl group), bifunctional compound activation, τ (dialdehydes, bisdiazo compounds, carbodiimides, carbonyldiimidazole, dicarboxylic acid chlorides, quinones
u. a.) im Fall von ω-Aminogruppen oder für direkte Kopplung (z. B. Diazophosphonsäuren) genutzt.u. a.) In the case of ω-amino groups or for direct coupling (eg., Diazophosphonsäuren) used.
Ausführungsbeispieleembodiments
10g Hydroxylapatit werden in 50ml einer 6%igen Lösung von gem. Vinylbisphosphonsäure in Wasser suspendiert, nach 1h abfiltriert und gewaschen. Anschließend wird eine Lösung von 0,5g Acrolein und 0,5g Acrylsäure in 50 ml Wasser zugegeben, nach 2h abfiltriert und der feuchte Träger durch Bestrahlung mit einer Polymerschicht überzogen (60Co-QUeIIe, 106 rad). Nach Waschung mit Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 6,8) werden 100mg Meerrettichperoxidase-Antikörper (Kaninchen) in 50ml Puffer zugegeben.10 g of hydroxyapatite are dissolved in 50 ml of a 6% solution of gem. Vinyl bisphosphonic acid suspended in water, filtered off after 1 h and washed. Subsequently, a solution of 0.5 g of acrolein and 0.5 g of acrylic acid in 50 ml of water is added, filtered off after 2 h and the wet carrier is coated by irradiation with a polymer layer ( 60 Co-QUeIIe, 10 6 rad). After washing with phosphate buffer (0.1 mol / l, pH 6.8), 100 mg of horseradish peroxidase antibody (rabbit) are added in 50 ml of buffer.
In 24 h bei 4°C ist die Immobilisierung beendet. Das Produk; wird zur Reinigung von Peroxidase genutzt.In 24 h at 4 ° C, the immobilization is completed. The product; is used for the purification of peroxidase.
10g poröses Glas werden mit einer Lösung von 2g Titantetrachlorid in 25 ml Tetrachlormethan 2 h behandelt, mit Tetrachlormethan, Aceton und Wasser gewaschen und anschließend mit 50ml einer 6%igen Lösung von 3-(4-Aminophenyl)-propan-1,1-bisphosphonsäure funktionalisiert. Das Produkt wird in eiskalter 10%iger Salzsäure 0-40C) suspendiert, mit einer Lösung von 200mg Natriumnitrit in 2 ml kalter Salzsäure versetzt und nach 30min eiskalter verdünnter Salzsäure und Eiswasser gewaschen. Anschließend wird das Glas in eine Lösung von 200mg Glukoseoxidase in Acetatpuffer (0,1 mol/l, pH 5,6) gebracht und 24 h bei 4CC geschüttelt. Danach wird der Überschuß an Enzym vollständig ausgewaschen und das Produkt in einem analytischen Reaktorzur Glukosebestimmung eingesetzt.10 g of porous glass are treated with a solution of 2 g of titanium tetrachloride in 25 ml of carbon tetrachloride for 2 h, washed with carbon tetrachloride, acetone and water and then with 50 ml of a 6% solution of 3- (4-aminophenyl) propane-1,1-bisphosphonic acid functionalized. The product is suspended in ice-cold 10% hydrochloric acid 0-4 0 C), treated with a solution of 200mg of sodium nitrite in 2 ml of cold hydrochloric acid and washed after 30min ice-cold dilute hydrochloric acid and ice water. Subsequently, the glass is placed in a solution of 200 mg glucose oxidase in acetate buffer (0.1 mol / l, pH 5.6) and shaken at 4 C for 24 h. Thereafter, the excess of enzyme is completely washed out and the product is used in an analytical reactor for glucose determination.
10g makroporöser mit Glutaraldehyd vernetzter Polyvinylalkohol werden in einer Lösung von 2g Tetraethoxyzirkonat in 100ml Toluen5h auf 80°C erwärmt, nach Abkühlung mit Toluen, Aceton, Ethanol und Wasser gewaschen und anschließend mit 50ml einer 5%igen Lösung von 2-Aminoethan-1,1-bisphosphonsäure 2h gerührt. Nach Waschen mit Wasser und Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 7,0) wird die Aminogruppe mit Chinonüberschuß (3mmol/l in o. g. Puffer) umgesetzt. Das Produkt wird gründlich gewaschen und mit 20ml einer Lösung von Penicillinacylase (100Einheiten/ml) 10h bei Raumtemperatur gerührt, gewaschen (H2O, Puffer) und zur Spaltung von Penicillin G eingesetzt.10 g of macroporous glutaraldehyde crosslinked polyvinyl alcohol are heated to 80 ° C. in a solution of 2 g of tetraethoxyzirconate in 100 ml of toluene, washed, after cooling with toluene, acetone, ethanol and water, and then with 50 ml of a 5% solution of 2-aminoethane-1,1 -bisphosphonic stirred for 2h. After washing with water and phosphate buffer (0.1 mol / l, pH 7.0), the amino group is reacted with excess quinone (3 mmol / l in buffer). The product is washed thoroughly and stirred with 20 ml of a solution of penicillin acylase (100 units / ml) for 10 h at room temperature, washed (H 2 O, buffer) and used to cleave penicillin G.
In Betracht gezogene Druckschrift: EP-PS 218506Document contemplated: EP-PS 218506
Claims (3)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DD30458087A DD301459A7 (en) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | Process for the immobilization of biomacromolecules |
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DD30458087A DD301459A7 (en) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | Process for the immobilization of biomacromolecules |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DD301459A7 true DD301459A7 (en) | 1993-02-04 |
Family
ID=5590434
Family Applications (1)
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DD30458087A DD301459A7 (en) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | Process for the immobilization of biomacromolecules |
Country Status (1)
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DD (1) | DD301459A7 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7589070B2 (en) * | 2001-06-15 | 2009-09-15 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Surface modification for improving biocompatibility |
-
1987
- 1987-07-03 DD DD30458087A patent/DD301459A7/en unknown
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US7589070B2 (en) * | 2001-06-15 | 2009-09-15 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Surface modification for improving biocompatibility |
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