DD294567A5 - Verfahren zur erfassung klassenspezifischer antikoerper unter verwendung monoklonaler antikoerper - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung klassenspezifischer Antikoerper unter Verwendung monoklonaler Antikoerper. Es ist die Aufgabe gestellt, die Anwesenheit und/oder die Konzentration isotypspezifischer Antikoerper gegen multideterminante Antigene humanpathogener Togaviren in Fluessigkeiten unter alleiniger Verwendung monoklonaler Antikoerper hoher Spezifitaet als immunologisches Reagens zu bestimmen. Die Aufgabe wird geloest, indem der monoklonale Antikoerper SIFIN IgM - 11 G 4 mit Antigenbindungsstellen zu Substrukturen humaner Immunglobuline als immobilisierter Fangantikoerper und die gegen Antigendeterminanten von Togaviren gerichteten enzym-markierten monoklonalen Antikoerper SIFIN-Rub B 1 - 12 F 10, SIFIN-Rub B 2 - 18 D 10, einzeln oder in Kombination eingesetzt, als Nachweisantikoerper dienen.{Immundiagnostik; Enzymimmunoassay; Antikoerper; Isotyp; monoklonaler Antikoerper; immunologisches Reagens; RNS-Viren; Togaviren}

Description

-2- 294 567 Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung klassenspezifischer Antikörper unter Verwendung monoklonaler Antikörper. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Konzentration isotypspezifischer Antikörper gegen bedeutsame Antigendeterminanten des Rubellavirus in Flüssigkeiten. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Eine Röteln-Infektion während der Frühschwangerschaft kann zu Bildungsfehlern und Entwicklungsstörungen beim Embryo, zum Abort bzw. zur Geburt geschädigter Kinder mit verschiedenen Mißbildungen bzw. Defekten (z. B. an Auge, Ohr, Herz, im Zentralnervensystem u.a.) führen.

Die Diagnose einer Rötelninfektion wird meist mit Hilfe des Hämagglutinationshemmungstestes - oder sehr aufwendig in Kombination mit physikochemischen Trennverfahren, der Komplementbindungsreaktion, dem Hämolyse-in-Gel-Test, mittels Immunfluoreszenztechnik, Radio- oder Enzymimmunoassay (H. U₁ Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, Vol.X, Weinheim 1986, S. 319) gestellt.

Eine schnelle Diagnose von Rötelnprimoinfektionen wird dann ermöglicht, wenn im Assaysystem die nach einer Röteln-Primoinfektion gebildeten Röteln-lgM-Antikörper möglichst frühzeitig spezifisch und zuverlässig reproduzierbar erfaßt werden.

Die klassischen Methoden der Röteln-Serologie wie Hämagglutinationshemmungstest, Komplementbindungsreaktion, Hämolyse-in-Gel-Test sind zeit- und arbeitsaufwendig und zum Teil relativ unempfindlich. Dies führte zur Entwicklung von Radioimmunoassays (z.B. P.P. Morteimer u.a. J. Hyg. Camb. 86,139 [1981 ]), die allerdings den entscheidenden Nachteil besitzen, daß mit radioaktivem Material gearbeitet werden muß; die Tracer instabil sind, spezielle Gerätetechnik erforderlich ist; in Speziallaboratorien gearbeitet werden muß und andere interferierende Faktoren falsch positive Ergebnisse anzeigen können

(J. M. Best u. a. J. Virol. Methods 8,99 [1984]; P. Morgan-Capner u.a. J. Hyg. 90,407 (1983)).

In indirekten Enzym-Iinked immunosorbentassays wurden relativ hohe Raten störender Einflüsse festgestellt (H. Champsaur u. a.

J. elin. Microbiology 26,328 [1988]).

Bei der enzymimmunologischen Erfassung der anti-Röteln-lgM-Antikörper unter Einsatz polyklonaler Antikörper als Fang- bzw. als Detektionsantikörper (J. A. Diment und S. M. Chantier Lancet 1981,394; J. B. Kurtz und A. Malic, J. Clin. Pathol. 34,1392 [1981); M.Vejtorp, Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B 123 [1981]; G.Gerna u.a. J. Clin. Microbiology 25,1033 [1987]; M.Vejtorp in:

H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, Vol.X., Weinheim 1986, S.319) wurde eine relativ hohe Rate falsch positiver Ergebnisse festgestellt (z. B. J. M. Best, J. Virol. Methods 8,99 [1984]; M.A. Chernesky u. a. J. Clin. Microbiol. 20,400 (1984];

B. Forghani, C. K. Myoraku und N.J. Schmidt, J. Clin. Microbiol. 18,652 [1983]).

Andere Autoren ermittelten weitere Störfaktoren (M.Vejtorp Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B 89,123 (1981 ]; M. Isaak und R.A. Payne J. Med. Virol. 10,55 [1982]).

Die polyklonalen Antikörper werden nach konventionellen Immunisierungsverfahren erzeugt. Der Organismus bildet stets relativ große Mengen Antikörper gegen andere Begleitproteine, die dann im Test unspezifisch reagieren können.

Die entsprechenden Antikörperpopulationen mit der erforderlichen Spezifität können erst durch aufwendige spezielle zeitraubende, mehrstufige Reinigungsverfahren und nur mit geringer Ausbeute bei Verlust von Antikörpern mit hoher Affinität isolier; werden.

Trotz aufwendiger Reinigungsoperationen können noch relativ starke immunologische Kreuzreaktionen mit anderen interferierenden Faktoren auftreten, wodurch Empfindlichkeit und Treffsicherheit des Testsystems vermindert werden können.

Die mittels konventioneller Verfahren hergestellten Antiseren sind nicht identisch reproduzierbar zu gewinnon. Auch bei Einsatz humaner Antikörper als Detektionsantikörper treten Unterschiede im Antikörpergehalt und in der Affinität auf; interferierende Faktoren können Störungen hervorrufen. Geeignete Seren sind schwer zu finden; sie sind aufwendigen Prüfverfahren zu unterziehen.

Bei Einsatz polyklonaler Antikörper ist das Tastsystem schlecht standardisierbar; die Eigenschaften der Testkits werden chargenabhängig. Die „background'-Extinktion ist meist durch unspezifische Bindungen erhöht, wodurch wiederum Empfindlichkeit und Treffsicherheit nachteilig beeinflußt werden.

Auch bei Kombination von monoklonalem Antikörper und polyklor, Jem Antikörper werden die aufgeführten Nachteile nicht überwunden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein verbessertes analytisches Verfahren unter alleiniger Verwendung monoklonaler Antikörper als immunologische Reagenzien zu entwickeln und einen kommerziellen Testkit mit stabilen, lagerfähigen Reagenzien bereitzustellen, mit dem zuverlässig reproduzierbare Befunde erzielt und empfindlich, spezifisch, kostengünstig die isotypspezifische Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration von Antikörpern gegen Togaviren erfolgt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als bevorzugte Ausführungsform die monoklonalen Antikörper W mit anti-isotypischen Determinanten einzeln oder als Kombination als Fangantikörper zur Immobilisierung eingesetzt werden, deren Hybridzellklone im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR (Liste vom 31.12.1988) unter der Nummer ZIM 02 55 hinterlegt sind

Der immobilisierte monoklonal Antikörper W wird mit einer Probe der Flüssigkeit in Kontakt gebracht, die einen zweiten

Antikörper X enthält, dessen Anwesenheit oder Konzentration zu bestimmen ist und der Rezeptoren zu den effizienten Determinanten von W und gleichzeitig Determinanten zu diagnostisch bedeutsamen Epitopen der Virusantigene Y von Togaviren besitzt.

Der festphasengebundene binäre Komplex aus erstem und zweitem Antikörper wird gleichzeitig mit einem Komplex aus Antigen Y und einem oder mehreren der enzymmarkierten monoklonalen Antikörper Z gegen verschiedene Epitope des Antigens Y, die als Datektionsantikörper eingesetzt werden und deren Hybridoma unter den Nummern ZIM 0505 (pr), ZIM 0506 (pr) im Zentralinstitut für Molekularbiologie hinterlegt sind, oder mit enzymmarkierten Spaltprodukten der monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht.

Auf bekannte Art und Weise wird did festphasengebundene Enzymaktivität gemessen. Das Maß der Enzymaktivität ist der Antikörperkonzentration der Probe proportional. In einer anderen Ausführungsweise wird der festphasengebundeno binäre Komplex aus erstem und zweitem Antikörper nacheinander mit dem Antigen Y und dann mit einem oder mehreren der enzymmarkierten Detektionsantikörper umgesetzt.

Anschließend wird die festphasengebundene Enzymaktivität ermittelt. Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß der immobilisierte Fangantikörper gleichzeitig mit der Probe, die X enthält, dem Antigen Z und den enzymmarkierten Detektionsantikörpern umgesetzt wird und nach dem Auswaschen der nicht an den festen Träger gebundenen Substanzen in bekannter Weise die festphasengebundene Enzymaktivität bestimmt wird.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Fangantikörper verwendeten monoklonalen Antikörper können an einem der üblichen Trägermaterialien, wie sie in Immunoassays eingesetzt werden, immobilisiert werden. Zu diesen Trägern gehören Materialien aus Glas, aus Papier, das aus Zellulose oder Zellulosederivaten gefertigt wurde, aus Polyethylen, Polystyren, Polypropylen oder aus anderen geeigneten Stoffen.

Die Technik zum Fixieren der Antikörper ist dem Fachmann bekannt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Detektionsantikörper eingesetzten monoklonalen Antikörper können auf bekannte Art und Weise mit Enzymen wie Peroxidase, Phosphatase, Galaktosidase u.a. kovalent verbunden werden. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigen sich im Vergleich zum Einsatz von polyklonalen Antikörpern, wie in Tabelle 1 aufgeführt ist.

Beim Einsatz von monoklonalen Antikörpern wurde die diagnostische Bewertung aufgrund äußerst niedriger „Background"-Werte und kaum bemerkbarer Kreuzreaktivitäten erheblich erleichtert und sicherer.

Dadurch, daß es nicht notwendig ist, permanent Tiere mit aufwendig zu gewinnendem Virusantigen zu immunisieren, tritt eine bedeutende Zeit- und Materialeinsparung ein.

Die gleichbleibenden Eigenschaften der monoklonalen Antikörper ermöglichen außerdem eine gute Standardisierung des Testsystems, eine stabile industrielle Massenproduktion der Testkits und eine bedeutend verbesserte und sichere Röteln-Diagnostik.

Ausführungsbelsplel

1. Herstellung von polyklonalem antl-Rubella-Antlserum

In Anlehnung an J. Strauss (J. Acta Virol. 14,485-490 (197O]) wurden Kaninchen „Deutsche Riesen (grau) X, helle Großsilber", die ein Gewicht von 1,5 bis 2,0 kg hatten, intraokulär mit dem Überstand des auf Vero-Zellen propagierten Röteln-Virusstammes „Judith" dreimalig immunisiert. Nach 30,60,120 Tagen wurde intraokulär geboostert. Nach 10 Monaten wurden die Antiseren gewonnen. Im Hämagglutinationshemmungstest wurde mit Taubenerythrozyten ein durchschnittlicher Titer von 1:1024 ermittelt.

Zur Absorption unspezifisch reagierender Faktoren wurden die Antiseren unter Anwendung des Danysz-Phänomens mit dem Überstand von Zellkulturen, die nicht mit dem Virusstamm infiziert waren, versetzt. Nach Inkubation bei 37⁰C und Zentrifugation wurde auf bekannte Art und Weise durch Caprylsäurefällung und lonenaustauschchromatographie die Immunglobulinfraktion gewonnen. Diese wurde nach R.M. Wilson und P.K. Nakane in: Immunofluorescence and related staining techniques eds. W. Knapp u.a. Press Amsterdam 1978, S.215 mit Meerrettichperoxidase markiert.

2. Nachwels von IgM-Antikörpern gegen Rubella-Vlrut

In die Vertiefungen von Polystyren-Platten wurden jelOOMl einer Lösungvon 1,8 10~⁷ Mol/l SIFIN IgM 11 G4inCarbonatpuffer (0,05 Mol/l, pH 9,6) pipettiert.

Nach Inkubation über 16h bei 4°C wurde abgesaugt und mit Phosphat (0,01 Mol/I)-Tween (0,5g/l)-Puffer (pH 7,2) gewaschen.

In die Vertiefungen der Reihen A, B, E, F der Platte wurden je 100μΙ anti-Röteln-lgM-negativen Serum, das mit 100 Volumenanteilen Phosphat-Tween(5g/I)-Puffers verdünnt wurde, pipettiert.

Die Vertiefungen der Reihen C, D, G, H der Platte wurden mit je 100μΙ eines anti-Röteln-lgM-positiven Serums, das von einem klinisch frisch erkrankten Patienten stammte und mit 100 Volumenteilen Phosphat-Tween-Puffer verdünnt ist, beschickt.

Nach Inkubation und Waschen werden die Platten entsprechend folgendem Schema weiter belegt:

Reihen A 2-12; C 2-12; E2-12; G 2-12: je 100 μΙ Rubella-Antigen Reihen B 2-12; D 2-12; F 2-12; H 2-12:je10^IKontrollantigen

Hierfür wurden ein Teil einer Röteln-Antigen-Lösung (HA-Titer 1:64) mit 20 Teilen Phosphat-Protein-Tween-Puffer verdünnt. In analoger Weise wurde ein Kontrollantigen, das aus nichtinfizierten Zellkulturen gewonnen wurde, mit Phosphat-Protein- ' Tween-Puffer (5g Tween und 10ml Serum vom Kalb/Liter) verdünnt.

Es wurde bei 37⁰C 2 h inkubiert und anschließend gewaschen. Danach wurden gemäß folgendem Schema je 100 μΙ einer Lösung von polyklonalem anti-Röteln-POD-Konjugat in Phosphat-Protein-Tween-Puffer, dem 10% inaktiviertes Serum vom Kaninchen und 10%Serum vom Kalb zugemischt waren, bzw. je 100 μΙ einer Lösung des mit Peroxidase markierten Antikörpers SIFIN-Rub-B 1-12 F10 (150Mg/Liter) in Phosphat-Protein-Tween-Puffer pipettiert. ·

je 10O μΙ polyklonales anti-Rubella-POD-Konjugat

Schema: A 2-12 B 2-12 C 2-12 D 2-12 E 2-12

G 2-12 ^ Je100M'POD-markierterSIFIN-Rub-B1-12F10 H 2-12

Nach Inkubation 2h bei 37⁰C wurde abgesaugt, gewaschen die Inkubation mit o-Phenylendiamin-Lösung (je 100μ|; 100mg/100ml in Phosphat/Citrat-Puffer 0,1 Mol/l, pH 5,0) über 30 min bei 25⁰C ausgeführt, mit Schwefelsäure (1 Mol/l) (je 100μΙ) gestoppt und die Extinktion bei 492 nm ermittelt.

Die Meßergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt:

Tabelle

Reihe Mittelwert der Extinktion

A	0,386 ±0,09
B	0,311 ± 0,07
C	0,806 ±0,08
D	0,233 ± 0,05
E	0,065 ± 0,02
F	0,070 ± 0,02
G	1,53 ±0,07

3. Nachweis von IgM-Antikörpern gegen Röteln-Virus in Patientenseren (Blutspender, Schwangere nach Röteln-Virus-Kontakt; Kinder, die an Röteln erkrankten)

Entsprechend den unter 2. angeführten Ausführungen wurden 20 Patientenseren geprüft, wobei anstelle des anti-Röteln-lgM-negativen und des anti-Röteln-IgM-positiven Serums die Patientenseren eingesetzt wurden. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle

Ergebnisse der Prüfung von Patientenseren

Serum Extinktionen

polykonalesanti-Röteln-POD monoklon.SIFINB1-12FPOD

Röteln- Kontroll- Röteln- Kontroll-

Antiger antigen Antigen antigen

1	0,788	0,242	0,895	0,011
2	0,435	0,108	0,589	0,021
3	1,232	0,289	1,588	0,040
4	1,866	1,016	1,114	0,036
5	0,948	0,153	1,110	0,027
6	1,268	0,133	>2,0	0,052
7	1,176	0,135	>2,0	0,067
8	0,405	0,120	0,705	0,032
9	0,955	0,135	1,130	0,005
10	0,823	0,125	1,526	0,025
11	0,432	0,132	0,418	0,032
12	0,417	0,325	0,120	0,052
13	0,215	0,208	0,035	0,010
14	0,503	0,493	0,025	0,015
15	1,553	1,466	0,140	0,078
16	0,267	0,240	0,005	0,004
17	0,139	0,109	0,013	0,010
18	0,400	0,146	0,440	0,029
19	0,525	0,287	0,043	0,035
20	0,243	0,222	0,021	0,020

Claims (8)

1. Verfahren zur Erfassung klassenspezifischer Antikörper unter Verwendung monoklonaler Antikörper, insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Konzentration isotypspezifischer Antikörper gegen multideterminante Antigene humanpathogener Togaviren in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologische Reagenzien im Assay eingesetzte Antikörper alleinig monoklonal Antikörper sind, wobei der an eine Festphase gebundene Antikörper mit anti-isotypischen Determinanten SIFIN lgM-11 G 4, der Rezeptoren zu Antigenbindungsstellen von SubStrukturen humaner Immunglobuline besitzt, als monoklonaler Fangantikörper und die monoklonalen Antikörper SIFIN-Rub B 1—12 FIO, SIFIN-Rub B 2-18 D10 einzeln oder als Kombination oder daß Spaltprodukte oder Kombinationen von Spaltprodukten dieser Antikörper als Nachweisantikörper eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper folgende Stufen umfaßt:

a) Umsetzung der Probe mit dem nachzuweisenden klassenspezifischen Antikörper X, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und gleichzeitig Determinanten zu Epitopen der Virusantigene von Y von Togaviren besitzt, mit dem festphasenfixierten monoklonalen Antikörper W auf bekannte Art und Weise;

b) Entfernung nicht gebundener Bestandteile und Einwirkung des Virusmaterials Y oder Einwirkung von Spaltprodukten des Virusmaterials Y, das Epitope zum monoklonalen Nachweisantikörper Z (SIFIN-Rub B 1-12 F10; SIFIN-Rub B 2-18 D10) besitzt;

c) Entfernung nicht gebundener Bestandteile, Einwirkung enzymmarkierter Nachweisantikörper Z oder enzymmarkierter Antikörperfragmente von Z oder einer Kombination enzymmarkierter Antikörper Z oder einer Kombination enzymmarkierter Antikörperfragmente Z, die Determinanten zu Y aufweisen; und M; " ^station des gebundenen Enzymanteils auf bekannte Art und Weise,

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper folgende Stufen umfaßt:

a) Umsetzung einer Probe, in der der klassenspezifische Antikörper X, der Rezeptoren zu Determinanten von W und Y hat, nachzuweisen ist, mit dem immobilisierten monoklonalen Antikörper W auf bekannte Art und Weise;

b) Entfernung nicht gebundener Bestandteile und Einwirkung einer Mischung aus Virusmaterial Y oder aus Spaltprodukten von Y und enzymmarkierten Antikörper Z oder enzymmarkierter Antikörperfragmente Z oder einer Kombination enzymmarkierter Antikörper Z oder einer Kombination enzymmarkierter Antikörperfragmente Z;

c) Entfernung nichtgebundener Bestandteile und Manifestation des gebundenen Enzymanteiles auf bekannte Art und Weise.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper in folgender Weise erfolgt:

Kontakt eines immobilisierten monoklonalen Antikörpers W mit einer Mischung, die aus einer Probe, die den nachzuweisenden Antikörper X enthält, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und zu Y besitzt, einer Virussubstanz Y oder eines Spaltproduktes der Virussubstanz Y und dem enzymmarkierten monoklonalen Nachweisantikörper Z oder dem enzymmarkierten Fragment des Antikörpers Z oder einer Kombination enzymmarkierter Antikörper Z oder einer Kombination enzymmarkierter Fragmente der Antikörper Z besteht und Manifestation des gebundenen Enzymanteiles auf bekannte Art und Weise.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die monoklonalen Nachweisantikörper SIFIN-Rub B 1-12 F10; SIFIN-Rub B 2-18 D10 mit einem Enzym markiert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Meerrettichperoxidase ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym alkalische Phosphatase ist.

8. Testpackung zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Konzentration isotypspezifischer Antikörper gegen multideterminante Antigene humanpathogener Togaviren in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß sie Bestandteile für Immunoassays enthält und die als immunologische Reagenzien fungierenden Antikörper alleinig monoklonale Antikörper sind, wobei die an eine feste Phase gebundenen Antikörper, die anti-isotypische Eigenschaften besitzen, SIFIN-IgM G4 als monoklonale Fangantikörper und die monoklonalen Antikörper SIFIN-Rub B 1—12 FIO, SIFIN-Rub B 2-18 D10 einzeln oder als Kombination als mcnoklonale Nachweisantikörper eingesetzt werden.