DD293048A5

DD293048A5 - Verfahren zur herstellung eines arzneimittels zur therapie von granulomatoes-fibrosierenden lungenerkrankungen

Info

Publication number: DD293048A5
Application number: DD33833890A
Authority: DD
Inventors: Beate Voigt; Heinz Seidel; Dietmar Miethe; Hermann Reutgen; Helmut Luther; Horst Eckert; Ingrid Sehrt; Burkhard Stoffer
Original assignee: Adw Institut Fuer Biotechnologie,De; Forschungsinstitut Fuer Lungenerkrankungen Und Tuberkulose,De
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1991-08-22

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von granulomatoes-fibrosierenden Lungenerkrankungen. Erfindungsgemaesz wird chemostatisch erzeugte Biomasse fakultativ methylotropher Bakterienstaemme auf einem heterotrophen Substrat zur Ubichinonakkumulation so weiter vermehrt, dasz der Substrateintrag immer groeszer ist als tatsaechlich wachstumsbedingt verbraucht werden kann. Anschlieszend werden aus der Biomasse in bekannter Weise die Ubichinone abgetrennt und mit ueblichen Hilfs- und Traegerstoffen zu einem Arzneimittel aufbereitet.{Arzneimittel; granulomatoes-fibrosierende Lungenerkrankungen; fakultativ, methylotrophe Bakterienstaemme; Kultivierung; Ubichinon; Substrateintrag; Ubichinon-Akkumulation}

Description

erfindungsgemäßen Arzneimittel grundlegend von allen bisher bekannten Präparaten, die für eine Therapie von granulomatösfibrosierenden Lungenerkrankungen vorgeschlagen wurden. Die so erhaltenen Ubichinone können mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen vermischt und zur Prophylaxe und Therapie von granulomatös-fibrosierenden Lungenerkrankungen eingesetzt werden. Die Applikationsformen können dabei unterschiedlich sein, es kommen Emulsionen, Kapseln, Spray, Tabletten oder Liposomen in Frage

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Der Ubichinon-10 enthaltende Bakterienstamm Acetobacter methanolicus IMET11402 wurde in einem für aerobe Kultivierung geeigneten Fermentor bei 30^cC unter ungeschützten Bedingungen gezüchtet. Der pH-Wert wurde durch NaOH bzw. HCI auf 4,0 konstant gehalten. Die Gelöstsauerstoff-Konzentration lag im Bereich von 20-40% des Sättigungswertes. Die Kultivierung erfolgte chemostatisch (C-Iimitiert) auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle bei einer Durchflußrate von 0,12 h~¹ auf einem Minimalmedium folgender Zusammensetzung (in mg/g BTS):

NH₄CI	600
KH₂PO₄	105
MgSO₄-7 H₂O	5
CaCI₂-2 H₂O	7
FeSO₄-7 H₂O	1,7
ZnSO₄-7 H₂O	0,15
MnSO₄-4 H₂O	0,28
CuSO₄-5 H₂O	0,26
Na₂MoO₄ -2 H₂O	0,08

Die so erzeugte Biomasse wurde in einem zweiten Kultivierungsschritt in einem für aerobe Bedingungen geeigneten Fermentor auf Glukose als C- und Energiequelle weiter vermehrt. Glukose wurde nach dem fed-batch-Prinzip zugesetzt. Dabei wurde die Zulaufrate für dieses Substrat so gewählt, daß diese größer als die wachstumsbedingte Verbrauchsrate für dieses Substrat war. Temperatur, pH-Wert und Gelöstsauerstoff-Konzentration bewegen sich im o.g. Bereich. Nach einem 1,5fachen Zuwachs wird die Biomasse abgetrennt und getrocknet. Der Gehalt an U-10 im Biomassetrockenprodukt wurde nach alkalischer Hydrolyse der Probe aus dem unverseifbaren Anteil über die Farbreaktion mit Cyanessigsäureethylester kolorimetrisch bestimmt (CRAVENS-Test).

Bei chemostatischer Kultivierung auf Methanol wurde ein Ubichinon-10-Gehalt von 0,130% ermittelt. Durch Anschluß der zweiten Kultivierungsphase auf Glukose wurde der Gehalt auf 176% erhöht. Das entspricht einer Steigerung um 35%. 1 kg der getrockneten Biomasse wurde 2mal mit je 3 kg Aceton/Wasser 9:1 (v/v) bei Raumtemperatur extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Wasserstrahlvolumen wurde der Extrakt mit 240ml 10%iger methanolischer KOH und 40ml 10%iger wäßriger Natriumdithionitlösung 30 Minuten am Rückfluß verseift. Nach Zugabe von 180 ml Wasser wurde die Seifenlösung 3mal mit 250ml η-Hexan extrahiert. Die vereinigten Hexanphasen wurden mit Wasser neutral gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Entfernen desn-Hexans wurde der Rückstand aus Aceton umkristallisiert. Es wurden 1,32g Ubichinon-10 erhalten. Ubichinon-10 war dünnschichtchromatrographisch rein.

Beispiel 2

Das gemäß Beispiel 1 gewonnene Ubichinon-10 wurde durch katalytischen Austausch mit Tritium markiert und für Verteilungsstudien bei Mäusen eingesetzt. Dazu wurde es in Erdnußöl gelöst und über Schlucksonde pro Maus 0,2 ml (= 7,7MBq/200μg Q10) appliziert. Während die Hauptmenge des markierten Produktes über die Fäces ausgeschieden wurde (ca. 60%), ergab sich nachstehende Verteilung für Lunge, Blut, Alveolar- und Peritonealmakrophagen nach 6,12 und 24Std., wobei die Angaben in DPM jeweils Mittelwerte aus 3 Tieren sind (vgl. Abb. 1).

Die Ergebnisse zeigen, daß bei oraler Applikation ein relativ hoher Anteil des Ubichinons in die Lunge und mit ca. 6% der Lungenaktivität auch in die Alveolarmakrophagen gelangt. Der höchste Einbau ist bei der Lunge nach 6Std. und bei Alveolar- und Peritonealmakrophagen nach 12Std. zu verzeichnen. Die Blutaktivität bleibt im untersuchten Zeitbereich nahezu gleich.

Beispiel 3

Mit Hilfe eines Killing-Testes nach REUTGEN u.a. wurde der Einfluß des Ubichinons auf wichtige Abwehrmechanismen der Lunge untersucht. Dazu wurden aus der BAL von Sarkoidosepatienten isolierte Alveolarmakrophagen eingesetzt. Getestet wurde der Konzentrationsbereich von 0 bis B\ig Q10 (= 0 bis 10~⁵M)/5x 10^s Zellen und ml. Erfaßt wurde nach 90minütiger Vorinkubation die Killingrate (KR) als Maß für die Beeinflussung (vgl. Tab. 1).

Tab.1: Einfluß von Ubichinon auf KR bei humanen Alveolarmakrophagen von Sarkoidosepatienten (Angaben sind Mittelwerte der Testung von jeweils 5 Patienten in % zum jeweiligen Kontrollansatz)

Ubichinon-Konzentration in μg/ml

0,5 2,0 8,0

mittlere

Killingrate 100 94 17 128

Die für die spezifische als auch unspezifische Abwehrfunktion der Lunge so eminent wichtige Killingrate ist ab > 2 pg/ml geringfügig und ab 8μg Ubichinon deutlich erhöht, was für eine erhöhte Aktivität bzw. Killingkapazität der Alveolarmakrophagen und damit für eine Optimierung der unspezifischen Abwehr der Lunge spricht.

Beispiel 4

Der Einfluß von Q10 auf die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten bei Alveolarmakrophagen (von Patienten unterschiedlicher Genese) wurde nach Aktivierung derselben mittels Hefezellwände (HZW) durch Messung der Chemilumineszenz erfaßt

Untersucht wurde der Konzentrationsbereich von 8 bis 16μg/ml und 10⁶ Zellen (= einer Ubichinon-Konzentration bis 2 χ 10"⁵M). Dabei wurde die Messung direkt nach der Q 10-Applikation als auch nach einer 90minütigen Vorinkubation der Alveolarmakrophagen mit dem Ubichinon vorgenommen (vgl. Abb. 2).

Die angeführten Ergebnisse zeigen, daß durch Konzentration von 4 μg Q10/ml (= 5 χ 10"⁶M) die Bildung der reaktiven Sauerstoffmetabolite reduziert werden kann. Dieser positive Effekt wird durch die Vorinkubation (offenbar wird dadurch die Aufnahme des Ubichinons durch die Zelle verbessert) noch verstärkt, so daß durch den Einsatz von 16pg Q 10/ml letztendlich die Sauerstoffmetaboliten-Konzentration der Alveolarmakrophagen drastisch, d. h. um die Hälfte gesenkt werden kann. Die Wirkung von Q10 wird u.a. auch darin gesehen, daß die Bildung größerer Mengen an toxischen Lipoperoxiden verhindert wird.

Beispiel5

Die als Aktivitätsmarkerfür Sarkoidose geltenden lysosomalen Enzyme wie Lysozym, N-acetyl-a-glucosaminidase (NAGA) und ß-Glucuronidase wurden ebenfalls unter Q10-Einfluß (10~⁶bis 10"⁵M) bei humanen Granulozyten gesunder Spender getestet.

Als Stimulatoren wurden N-formylmethionylleucylphenylalanin (FMLP) bzw. Calciumionophor A23187 eingesetzt.

Die quantitative Bestimmung der freigesetzten Enzyme wurde im Überstand sowie nach Lyse des Zellsedimentes

vorgenommen, wobei die Aktivitätsbestimmung der NAGA und a-Glucuronidase auf kolorimetrischem Wege und des Lysozyms mittels Lysoplate-Technik erfolgte.

Ein Einfluß von Ubichinon auf die durch FMLP oder lonophor A23187 induzierte Freisetzung von NAGA, ß-Glucuronidase und Lysozym war im getesteten Konzentrationsbereich nicht nachzuweisen. Desgleichen bewirkte es auch keine Veränderung der intrazellulären Aktivität der Enzyme. Daraus folgt, daß die genannten diagnostisch relevanten Aktivitätsmarker durch Ubichinon nicht negativ verändert werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von granulomatös-fibrosierenden Lungenkrankheiten durch Vermischen eines Wirkstoffes mit Hilfs- und Trägerstoffen, gekennzeichnet dadurch, daß eine chemostatisch erzeugte ubichinonhaltige Biomasse fakultativ methylotropher Bakterienstämme auf einem heterotrophen Substrat erzeugt und anschließend so weitervermehrt wird, daß das Substratangebot stets größer ist als wachstumsbedingt verbraucht werden kann, und anschließend aus der Biomasse in bekannter Weise die Ubichinone gewonnen und mit entsprechenden Hilfs- und Trägerstoffen vermischt werden.

Hierzu
2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Therapie von granulomatös-fibrosierenden Lungenerkrankungen geeignet ist. Sie kann in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie angewendet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Eine kausale Therapie bei granulomatös-fibrosierenden Lungenerkrankungen gibt es nicht. Angriffspunkte bisherigerTherapien sind die Frühveränderungen, die Granulomformation und die Prävention einer Fibrosierung. Als Mittel der Wahl werden Kortikosteroide verwendet (R.Christ, H.Eule, B.Wiesner, A.Weinecke, A.Ballin, E.Thomas, H.Eckert,Therapie der Sarkoidose, Z.Erkrank.Atemorg. 170,314(1988]; H.Hornbostel, W.Kaufmann, W.Siegenthaler [Hsg.], Innere Medizin in Praxis und Klinik, Bd. 1, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York [1984]). Kortikosteroide zeigen erhebliche Nebenwirkungen und sind bei einer Vielzahl anderer, gleichzeitig auftretender Erkrankungen koniraindiziert. Das gleiche gilt generell für immunsuppressive Substanzen. Antifibrotische Mittel (JP82/57474), die synthetisch nur mit erheblichem Aufwand zugänglich sind, werden in Mengen bis zu 5g/d als therapeutische Dosis verwendet.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die kostengünstige Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von granulomatös-fibrosierenden Lungenerkrankungen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, in einem Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von granulomatösfibrosierenden Lungenkrankheiten solche Wirkstoffe einzusetzen, die die Wirkung reaktiver Sauerstoffmetaboliten reduzieren, toxikologisch unbedenklich sind und bereits in geringer Dosis eine hohe Aktivität entwickeln. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zunächst unter Verwendung eines heterotrophen Substrats ein fakultativ methylotropher Bakterienstamm chemostatisch kultiviert wird. Anschließend erfolgt in einer zweiten Kultivierungsstufe die Weitervermehrung der Biomasse und die Akkumulation des Ubichionons, wobei in dieser Stufe das Substratangebot stets größer gehalten wird als wachstumsbedingt verbraucht werden kann. Der erforderliche Substratüberschuß wird dabei durch ein molares Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis von mindestens 30:1 charakterisiert. Das Ubichinon wird aus der Biomasse in bekannter Weise abgetrennt und mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zu einem Arzneimittel aufbereitet. Die Einstellung der genannten Bedingungen für die Herstellung der Ubichinon-haltigen Biomasse erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß nach der eigentlichen Anzuchtphase auf dem gegebenen Substrat nach dem fed-batch-Prinzip so weiterkultiviert wird, daß die Zulaufrate des Substrats stets größer als die wachstumsbedingte Verbrauchsrate eingestellt wird. In Abhängigkeit von den verwendeten Bakterienspezies kann diese Maßnahme weiter ausgestaltet werden. Bei Verwendung von Bakterien der Art Acetobacter methanolicus ist während der Akkumulationsphase durch Sauerstofflimitation zu regeln. Bei Verwendung von Bakterien der Gattung Methylobacillus ist es vorteilhaft, das Wachstum der Bakterien in der Akkumulationsphase etwa nach einer Verdopplung der initialen Biomassekonzentration durch die Stickstoffkonzentration zu limitieren. Durch die zweite Kultivierungsphase wird der Ubichinon-Gehalt in der Bakterienbiomassebis auf das Dreifache des ursprünglichen Wertes gesteigert.

Aus den ubichinonreichen Bakterienbiomassen werden ubichinonhaltige Extrakte in bekannter Weise, beispielsweise mittels Hochdruckextrakten oder unter Anwendung selektiver Lösungsmittelgemische isoliert. Aus den Extrakten werden die Ubichinone unter Verwendung bekannter Verfahren, beispielsweise Verseifung des Extraktes in Gegenwart eines Antioxidationsmittels und nachfolgender säulenchromatographischer Abtrennung gewonnen. Die so erhaltenen Ubichinone zeigen überraschend eine spezifische, den Krankheitsverlauf von granulomatös-fibrosierenden Lungenerkrankungen positiv beeinflussende Aktivität bei gegenüber vergleichbaren Mitteln wesentlich geringerem Stoffeinsatz ohne negative Nebenwirkungen wie z. B. Toxizität oder Immunsuppression. Da es sich bei den Ubichinonen um physiologische, körpereigene Stoffe handelt, die im Organismus ubiquitär vorkommen und keinerlei toxische Relevanz besitzen, unterscheiden sich die