DD276532A1

DD276532A1 - Verfahren zum nachweis von menschlichem wachstumshormon (hgh)

Info

Publication number: DD276532A1
Application number: DD32104688A
Authority: DD
Inventors: Silvia Hering; Bernhard Schlott; Michael Kasper; Guenter Butschak
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-10-25
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1990-02-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von menschlichem Wachstumshormon (hGH) in Fluessigkeiten, Geweben oder Zellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Biotechnologie, die Medizin, die Landwirtschaft und die biologische Grundlagenforschung. Erfindungsgemaess wird ein anti-hGH-Antikoerper an einer festen Phase adsorbiert und die zu messende hGH-haltige Fluessigkeit hinzugefuegt bzw. hGH-haltige Gewebeschnitte oder Zellen auf einer Oberflaeche fixiert, danach ein bispezifischer monoklonaler anti-hGH-anti-POD-Antikoerper im Gemisch mit POD hinzugefuegt, inkubiert, eine Substratloesung im Gemisch mit H2O2 zugegeben und in ueblicher Weise die Enzymaktivitaet gemessen. Beim Nachweis von hGH in Loesungen wird als Substrat Orthophenyldiamin (OPD) eingesetzt, beim Nachweis von hGH in Zellen und Geweben, die an Traegern fixiert sind, findet Diaminobenzidin (DAB) Anwendung. Der fuer das Nachweissystem eingesetzte bispezifische monoklonale anti-hGH-anti-POD-Antikoerper wird von der Zellinie IEZ (ZIM-Nr. 0287) oder IIIF10 (ZIM-Nr. 0288) produziert. Das erfindungsgemaesse Nachweissystem erlaubt einen schnellen und sicheren Nachweis von hGH in Fluessigkeiten und Geweben.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Biotechnologie, die Medizin, die Lendwirtschaft und die biologische Grundlagenforschung.

Charakteristik des bekannten Standos der Technik

Grundsätzlich sind seit der Etablierung der Hyhridomtechnik durch Köhler und Milstein (1975) gute Voraussetzungen für den Aufbau sensitiver und spezifischer Nachweismethoden für Biomoleküle in Flüssigkeiten und Geweben gegeben. Gegenüber polyklonalen Antikörpern aus tierischen Immunseren besitzen monoklonal Antikörper den Vorteil der engen Spozifität für ein bestimmtes Epitop des nachzuweisenden Antigens, was in den meisten Fallen der Spezifität des Tests zugute kommt. Da die monoklonalen Antikörper prinzipiell in gleichbleibender Qualität, in unbegrenzter Menge sowie über einen beliebigen Zeitraum reproduziert werden können, läßt sich die etablierte Testkonfiguration jederzeit standardgerecht erstellen. Demgegenüber sind bei der Verwendung polyklonalor Antikörper als Nachweisreaktive für jede neue Serumcharge aufwendige Re^; iigungs- und Standardisierungsarbeiten erforderlich.

Die genannten Vorteile monoklonaler Antikörper werden in immunchemischon Nachweisverfahren ausgenutzt, indem die Antikörper auf chemischem Wege mit Enzymen (POD, alkalische Phosphatase o. a.), mit Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Isotopen markiert werden. Die Menge an gebundenem Nachweisroaktiv (= markierter moAk) wird dadurch genau meßbar. Das ist die Voraussetzung für die Etablierung sensitiver Nachweismathoden.

Nach wie vor iiryJ-n für diese Zwecke auch polygonale Antikörper Verwendung. Für den Nachweis von hGH kamen bisher Radioimmuntests bzw. Enzym».irriL'ntests ( ) zum Einsatz, die die Kopplung oiner Testkomponente (entweder eines

monoklonalen ct-hGH-Anlikörpers oder von poiykicnalen a-hGH Antikörpern oder von hGH-Standardsubstanz) mit der entsprechenden Markersubstanz voraussetzen

Der Kopplungsvorgang kann Schwierigkeiten verursachen und das markierte Produkt ist häufig durch Nachteile belastet:

1. Für die chemische Kopplung ist hochreines Markerenzym erforderlich.

2. Eine Inaktivierung de» Antikörpers durch den Markierungsvorgang ist möglich.

3. Die Verwendbarkeit des markierten Materials ist zeitlich begrenzt (besonders bei Radioisotopen).

4. Chargenunterschiede zwischen verschiedenen Kopplungen treten auf.

5. Die Prozeduren der Markierung sowie dor Reinigung der markierten Substanzen verursachen zusätzlichen Aufwand. Diese Nachteile erschweren die Etablierung eines standardisierten Nachweisverfahrens für humanes Wachstumshormon.

Ziel der Erfindung

Das Ziel dor Erfindung besteht darin, ein Nachweisverfahren für menschliches Wachstumshormon in Flüssigkeiten und Geweben zu entwickeln, das einfacher und sicherer hinsichtlich der Herstellung der Nachweisreaktive sowie hinsichtlich der Anwendung ist als bishsr bekannte Verfahren.

Wesen der Erfindung

Erfindungsgemäß wird zum Nachweis von menschlichem Wachstumshormon (hGH) oin anti-hGH-Antikörper an einer festen Phase adsorbiert, anschließend trägt man die zu messende hGH-haltige Flüssigkeit auf oder die hGH-haltige Flüssigkeit wird auf einem Trägermaterial fixiert oder man fixiert hGH-haltige Gewebeschnitte oder Zellen auf einer Oberfläche, danach fügt man einen bispezifischen monoklonalen anti-hGH-anti-POD-Antikörper im Gemisch mit POD hinzu, inkubiert, trägt anschließend die Substratlösung (entweder Orthophenylendiamin |OPD) für hGH-haltige Flüssigkeiten oder Oiaminobenzidin [DA8| für hGH in Zellen und Geweben und im fixierten Zustand im Gemisch mit H₂O₂) auf und mißt in üblicher Weise die Enzymaktivität. Als anti-hGH-Antikörper wird ein monoklonaler Antikörper verwendet, der von der Zellinie A64-E/B12 (ZIM-Nr.0202) odor von der Zellinie IIA9 (ZIM-Nr.: 0289) produziert wird. Der orfindungsgemäß eingesetzte bispezifische monoklonal anti-hGH-anti-POD-Antikörper wird von der Tetradomlinie IE 7 (ZIM-Nr.0287) odor von der Tetradomlinie IHF10 (ZIM-Nr. 0288) sekretiert. Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß die erfindungsgemäß eingesetzten bispezifischen anti-hGH-anti-POD-moAk einu Brücke bilden zwischen dem nachzuweisenden Hormon - hGH - und dem Nachweisreaktiv- POD. Die durch den Antikörper gebundene Menge an POD ist der im Testobjekt vorhandenen Menge an h.GH direkt proportional. Die gebundene POD setzt das Substrat OPD bzw. DAB unter Verwendung von H₂O₂ in ein farbiges Oxidationsprodukt um, wobei die Intensität der Färbung proportional zur Menge an gebundenem POD ist. Beim Nachweis von hGH in Lösungen wird als Substrat OPD eingesetzt, das nach der Reaktion als farbige Lösung vorliegt, deren Extinktion gemessen wird.

Wird hGH in Zellen und Geweben und auf Trägermaterialien wie Filterpapier nachgev\ iesen, wird durch die gebundene POD das Substrat Diaminobenzidin unter Farbumschlag am Reaktionsort fixiert und dadurch eine Lokalisation und semkjuantitative Bestimmung von hGH im Gewebe oder auf Trägermaterialien ermöglicht

Der Vorteil dieser Nachweismethode für hGH im Vergleich zu bekannten Verfahren besteht darin, daß

- der Aufwand für dia Kopplung der Antikörper mit POD und die Reinigung des markierten Antikörpers entfällt;

- aufgrund der spezifischen Bindung zwischen a-POD und POD kein hochreines Markerenzym erforderlich ist;

- die bisperifischen Antikörper jederzeit „chargentreu" reproduziert werden können, keine Unterschiede in der Qualität der Nachweisreaktive auftreten können, (wie bei verschiedenen chemischen Kopplungen) und das Testverfahren deshalb besser standardisierbar ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren läßt sich humanes Wachstumshormon in Flüssigkeiten, Zellen und Geweben schnell und sicher nachweisen, wob6i die Herstellung der Nachweisreaktive und ihre Anwendung unkomplizierter und weniger aufwendig sind als bei bisher genutzten Verfahren.

Ausführungsbeispiele

1. Zwelteltanblndungstett zum Nachweis von hGH In Flüssigkeiten

Anti-hGH-Antikörper der Zellinie A64-E/B12 (ZIM-Nr.0202) oder der Zellinie IIA9 (ZIM-Nr.0289) läßt man über Nacht an die Oberfläche von Multitestplatten oder Tablettenblistern adsorbieren. Pro Reaktionsgefäß werden IuOμΙ gereinigter Antikörper (10-100yil/ml PBS) inkubiert. Denach wird mit Leitungswasser 6-6mal gewaschen und die hGH-haltige Testsubstanz bzw. Eichsubstanz wird für eine Stunde bei 37⁰C inkubiert, danach wird wieder gewaschen. Anschließend wird gereinigter bispezifischer Antikörper der Linie IE 7 (ZIM-Nr. 0287) oder der Linie IHFIO(ZIM-Nr. 0288) in einer Verdünnung von 1:50 bis 1:250 in PBS mit 10% Serum im Gemisch mit POD (25ng/ml) aufgetragen, wieder eine Stunde bei 3/'C inkubiert und gewaschen. Für die Substratreaktion werden je 100μΙ des Gemisches aus 0,5mg Orthophenylendiamin und 10μΙ 10%igo Wasserstoffperoxidlösung in 1 ml Phosphat-Citratpuffer (pH 5,0) aufgetragen. Anhand der Extinktionswerte der Eichkurve wird die hGH-Menge in den Testlösungnn ermittelt.

2. Dot-Blot zum Nachwels von hCH auf Nitrocellulosepapler

hGH-haltige Flüssigkeit (Eichlösung und Tostlösung) wird zu 0,6-1 μΙ auf Nitrocellulosefilter getropft. Freie Bindungsstellen auf dem Filterpapier werden anschließend durch eOminütige Inkubation in 5% Magermilchpulverlösung (in PBS) abgesättigt, danach wird in Waschpuffer gewaschen. Anschließend wird bispezifischer Antikörper der Linie IE 7 (ZIM-Nr.O287) oder HIF10 (ZIM-Nr. 0268) in einer Verdünnung von 1:50 bis 1:100 (PBS mit 10% FKS) im Gemisch mit POD aufgetragen, danach werden die Filterstücken mehrfach in Waschpuffer gewaschen. Die Nachweisreaktion erfolgt durch Inkubation des Dots mit einem Überschuß an Diaminobenzidin-Lösung im Gemisch mit H₂O₂.

3. Nachwels von hGH In menschlichen Hypophysen

Kryostatschnitte (4 \im dick) von menschlichem Hypophysenmaterial werden auf Glasobjoktträger aufgetragen und mit 1 % Zisge-Normalserum in PBS überschichtet. Danach wird für 10min in PBS gewaschen und für 30 min in reinem Methanol mit 1% H₂O₂ (30%ig) blockiert, dann wieder in PBS gewaschen.

Die Schnitte werden dann für 30-45min mit dem bispezifischen Antikörper IE 7 oder HIFIO überschichtet, danach wird 3x mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgt die beschichtung mit PODLÖsung (10μρ POD pro ml PBS), die nach 30min abgewaschen wird (5 χ 5min). Die Substratreaktion erfolgt mit Diaminobenzidine (50mg/100ml PBS) im Gemisch mit H₂O₂ (ΙΟμΙ/ml, 30%ig). Nach 8-10min können die Schnitte im Lichtmikroskop ausgewertet werden. Die angefärbten Zellinseln sind hGH-positiv.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von menschlichem Wachstumshormon (hGH), gekennzeichnet dadurch, daß man einen anti-hGH-Antikörper an einer festen Phase adsorbiert und anschließend die zu messende hGH-haltige Flüssigkeit auftränt oder hGH-haltige Gewebeschnitte oder Zellen auf einer Oberfläche fixiert, danach einen bispezifischen monoklonalen anti-hGH-anti-POD-Antikörper im Gemisch mit POD hinzufügt, inkubiert, eine Substratlösung aufträgt und in üblicherweise Enzymaktivität mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als anti-hGH-Antikörper einen monoklonalen Antikörper einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als monoklonalen anti-hGH-Antikörper den von der Zellinie A64-E/B12 (ZIM-Nr. 0202) oder den von der Zellinie IIA9 (ZIM-Nr.0289) produzierten Antikörper einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als bispezifischen monoklonalen anti-hGH-anti-POD-Antikörper den von der Zellinie IE7 (ZIM-Nr.0287) oder den von der Zellinie IIIF1O(ZIM-Nr.O288) produzierten Antikörper einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß beim Nachweis von hGH in Flüssigkeiten die bubstratlösung Orthophenylendiamin (OPD) im Gemisch mit H₂O₂ enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß beim Nachweis von hGH in Gewebeschnitten oder Zellen die Substratlösung Diaminobenzidin (DAB) im Gemisch mit H₂O₂ enthält.