DD263540A1 - Analytisches element zur bestimmung von transaminasen in waessrigen loesungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung von Transaminasen in waessrigen Fluessigkeiten. Sie ist auf dem Gebiet der medizinischen Labordiagnostik und Biochemie anzuwenden. Das in transparente Traegerschichten eingelagerte Nachweissystem erkennt Glutamat mittels Glutamatoxidase und erreicht seine Spezifitaet durch den Zusatz von 2-Oxoglutarat und das Aminosaeuresubstrat fuer die zu bestimmende Transaminase. Die Zusaetze sind in einer grossporigen Aufnahmeschicht fuer makromolekulare Substanzen, getrennt vom einheitlichen Glutamatnachweissystem, angeordnet.

Description

Anwendungsgebiet

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung von Transaminasen in wäßrigen Flüssigkeiten. Die Erfindung wird angewendet auf dem Gebiet der medizinischen Laboratoriumsdiagnostik und der Biochemie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Transaminasebestimmungen haben seit vielen Jahren einen festen Platz in der medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Insbesondere spielen Transaminasebestimmungen in der Diagnostik und Therapiekontrolle von Leber- und Herzkrankheiten eine g.oße Rolle.

Die beiden in diesem Zusammenhang wichtigsten Transamina^en sind die Alaninaminotransferase (ALAT) (EC 2.6.1.2.), früher als Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) bezeichnet, und die Aspartataminotransferase (ASAT) (EC 2.6.1.1.), die früher als Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) bezeichnet wurde. Die Alaninaminotransferase katalysiert die Transaminierung von 2-Oxoglutarat und Alanin zu Glutamat und Pyruvat und die Aspartataminotransferase katalysiert die Transaminierung vor 2-Oxoglutarat und Aspartat zu Glutamal und Oxalacetat:

ALAT 2»jOxoglutarat + Alanin Glutamat + I^ruvat

ASAT 2-Oxoglutarat + Aspartat ^—.—± Glutamat + Oxalacetat

Eine direkte Verfolgung der Reaktion und damit eine unmirtelbare Enzymaktivitätsbestimmung ist nur für die Aspartataminotransforase durch die spektrofotometrische Verfolgung der Oxalacetatbildung bei 280nm bekannt. Alle anderen Transaminasebestimmungen beruhen auf der Bestimmung der Reaktionsprodukte in einer nachfolgenden Indikatorreaktio.i.

Bei der Bestimmungsmethode nach REITMAN und FRAENKEL (Amer. J. Clin. Pathol. 28 [19561 56) werden die bei der Reaktion gebildeten Ketone, also Pyruvat und Oxalacelat, mit Dinitrophenylhydrazin zu den entsprechenden Hydrazonen umgesetzt, die fotometrisch bestimmt werden. Diese anfänglich weit verbreitete Methode weist aber Fehlbestimmungen bis zu 20% auf. In den weitaus meisten Fällen werden die Produkte der Primärreaktion, also das Oxalacetat, Pyruvat oder Glutamat durch enzymatisch katalysierte Reaktionen bestimmt. Hierzu werden sowohl Dehydrogenasen als auch Oxidasen benutzt.

Bei der Bestimmung des Oxalacotats wird nach KARMEN (J. Clin. Invest. 34 [19551131) Malatdehydi ogenase eingesetzt und der mit der Oxidation von Oxalacetat zu Malat verbundene Verbrauch von r 1'Jziertem Nicotinamiddinucleotid (NADH2) bei 340nm messend verfolgt.

In ähnlicher Weise erfolgt die Bestimmung des Pyruvats mit Hilfe von La :' atdehydrogenase nach WROBLEWSKI und LADUE (Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 91 [19561 598). Ein Verfahren, dem diese Reaktion zugrunde liegt, wurde in der DE-PS 3026854 beschrieben.

Statt der en*gehenden Ketone Pyruvai und Oxalacetat könnte auch das eingesetzte Keton 2-Oxog'utarat bestimmt werden. Die Abnahme der Konzentration des 2-Oxoglutarats als Maß für die Bestimmung derTransaminaseaktivität zu benutzen ist wegen der gelingen Abnahme im Verhältnis zum notwendigen großen Überschuß jedoch ungünstig. Aber auch die in der

DD-PS 145326 beschriebene Bestimmung der 2-Ox jglutarat-Zunahme, wenn man die Transaminierung in umgekehrter Richtung führt, ist zur Transaminasebestimmung ungeeignet, weil die dann als Substrate benötigten Substanzen, wie zum Beispiel das Oxalacetat, vielleicht unbeständig sind.

Zur Transaminasebestimmung wurde auch die Bestimmung des Glutamats ausgenutzt (LIPPI und GUIDI, Clin. Chim. Acta 28 j [1970] 431). Als Hilfsenzym wurde in dem gekoppelten enzymatischen Test Glutamatdehydrogenase verwendet. Das

entstehende NADH₃ kann dann entweder wieder bei 340 nm im sogenannten „Optischen Test" oder nach Reaktion m t einem Tetrazoliumsalz wie in der DE-PS 2932748 boschrieben, bestimmt werden.

Von den üxidasen, die zur Bestimmung der Transaminasen in gekoppelter enzymatischer Reaktion zur Anwendung kommen, ! wurde bis in die jüngste Zeit nur Pyruvatoxidase eingesetzt. Damit aber mit der Pyruvatoxidase, die nur eine Pyruvatumsetzung

; katalysieren kann, nicht nur Alaninaminotransferase, sondern auch Aspartataminotransferase bestimmt werden kann, muß

! deren Reaktionsprodukt, das Oxalacetat, in einer vorgeschalteten Reaktion in Pyruvat umgewandelt werden. In der

DE-PS 2911481 wird dazu eine Oxalacetatdehydrogenase benutzt.

Eine weitere Möglichkeit, um mit der Pyruvatoxidase beide Transaminasen bestimmen zu können, besteht in der Verwendung von Alaninsulfinsäure als Substrat der Aspartataminotransferaäe, da hierbei sofort Pyruvat entsteht. Bei der Oxidation des Pyruvats durch Einwirkung der Pyruvatoxidase wird unter anderem Wasserstoffperoxid gebildet, das in einer weiteren gekoppelten enzymatischen Reaktion mittels Peroxidace ein Chromogen zu einem Farbstoff oxidiert. Dieser Farbstoff ibt dann der eigentliche Indikator der Transaminasebestimmung.

Eine ausführliche Kritik der zum Teil komplizierten, teuren und langwierigen Verfahren wurde in der DE-PS 32 21730 gegeben. Kürzlich wurde von KAMEi, ASANO und NAKAMURA (Chem. Pharm. Bull. 34119861409) eine weitere Methode zur Transaminasebestiriimung veröffentlicht. Bei dieser Methode wird das bei der Transaminierung entstandene Glutamat mittels einer Glutamatoxidase, die aus Streptomyces violacens gewonnen wurde, oxidiert. Das dabei entstehende Wasserstoffperoxid wird zur Oxidation von Homavanillinsäure benutzt, und das Produkt spekfofluorimetrisch bestimmt. Diese Methode ist auf Grund ihrer Reaktionsschritte günstig, weil sie ohne zusätzliche Verfahren beide Transaminasen zu bestimmen gestattet. Die fluorimetrische Auswertung schließt aus apparativ-technischen Gründen jedoch tune breite Anwendung dieser Bestimmungsmethode aus.

Die hier erwähnten und weitere Bestimmungsmethoden sind Küvettentests. Viele von ihnen lassen sich gut automatisierten und gestatten eine effektive Bestimmung von großen Analysenserien in medizinisch-diagnostischen Laboiatorien. Neben diesen Großserien besteht aber auch ein erhebliches Interesse an Transaminasebestimmungen bei Einzelproben und Kleinserien, bei denen das Ergebnis kurzfristig zur Verfügung steht. Diese Forderungen treten zum Beispiel bei Hepatitiden im Zusammenhang mit epidemiologischen Fragestellungen auf, wo zumeist ein sofortiger ärztlicher Handlungsbedarf besteht. Hierfür bieten sich sogenannte „Trockenchemische"-Verfahren in Form von Teststreifen an.

Nachdem die Entwicklung der Festphasen-Technik in den letzten Jahrzehnten stark vorangetrieben wurde und sich anfänglich meist auf den Nachweis niedermolekularer Analyte beschränkte, zeigt eine neuere Zusammenstellung von U3EER (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 23119Π5) 645), daß zunehmend auch hochmolekulare Bestandteile von Flüssigkeiten mit der Festphasen-Technik bestimmt werden.

Einige der für Küvettentests ausgearbeiteten Transaminasebestimmungsmethoden wurden auch mit mehr oc* :r weniger gutem Erfolg bei Teststreifen anwendet. Außer bei der von SANDFORD et al. (Clin. Chem. 28 (1982) 1605) vorgeschlagenen Methode, die zur Bestimmung der Alaninaminotransferase die Absorptionsänderung bei 340nm ausnutzt, wird bei allen anderen Methoden Pyruvatoxidase in Verbindung mit Peroxidase und einem Chromogen eingesetzt. Methoden dieser Art wurden von WALTER et al. für die Bestimmung der Alaninaminotransferase (Clin. Chem. 2911983) 1168) und der Aspa.tataminotransferase (Clin. Chem. 29 [1983] 1267) beschrieben.

Bei der Aktivitätsbestimmung der Aspartataminotransferase mußte der Pyruvatoxidasts-Reaktion noch eine Decarboxylierung des Oxalacetats zu Pyruvat mittels Oxalacetatdecarboxylase vorgeschaltet werden.

Die gleichen enzymatischen Reaktionen werden auch von KATSUYAMAet al., beschrieben in der DE-PS 3222707, zur Bestimmung derTransaminascaktivitäten benutzt.

Sogar die Aspartataminotransferasehestimmung mit Alaninsulfinsäure als Substrat, die wegen des bei der Reaktion entstehenden Schwefeldioxids viele Probleme hervorruft, wurde, wie die DE-PS 3221730 aufweist, auf Teststreifen zu adaptieren versucht.

Nachteilig boi diesen, mit Teststreifen durchgeführten Transaminasebestimmungen ist, daß für die Aspartataminotransferasebestimmung ein zusätzliches Enzymsystem benötigt wird, das den Teststreifen nicht nur verteuert, sondern auch die ohnehin schwierig zu optimierenden enzymatisch gekoppelten Reaktionen weiter verkompliziert.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist ein analytisches Element, das unkompliziert eine schnelle Bestimmung von Transaminasen unmittelbar am Ort der Probenahme, zum Beispiel beim Patienten, ermöglicht und dessen reproduzierbare Herstellung dadurch vereinfacht ist, daß für den Nachweis verschiedener Transaminasen das gleiche Enzymsystem veiwendet wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein analytisches Element für die Bestimmung von Transaminasen zu schaffen mit einem für alle Transaminasen einheitlichen Enzymsystem verbunden mit der schnellen Bestimmungsmöglichkeit am Ort der Probenahme mit nur geringen apparativ-technischem Aufwand.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein analytisches Element, bestehend aus einer oder mehreren makromolekularen Trägerschichten, in die das Reaktions- und Nachweissystem eingearbeitet ist und die gegebenenfalls auf einer Stützschicht angeordnet sind.

Das Reaktionssystem enthält Glutamatoxidase, 2-Oxoglutarat sowie das für die zu bestimmende Transaminase spezifische Aminosäuresubstrat.

Als Nachweissystem wird ein an sich bekanntes Nachweissystem für Wasserstoffperoxid oder Ammoniak benutzt. Des weiteren ist wichtig, daß mindestens eine Schicht des Träger«-ystems eine großporige Aufnahmoschicht ist, in die die zu bestimmende Transaminase eindringt.

Zur Transaminasebestimmung wird von uns erfindungsgemäß die Bestimmung des Glutamats durch oxydative Desaminierung mittels Glutamatoxidase (GLOD) eingesetzt:

GLOD Glutamat + O₂ + H₃O -> 2-Oxoglutarat + NHo + HgO₂

Diese Reaktion ist für die Anwendung auf Teststreifen besonders vorteilhaft. Einerseits entsteht bei der Reaktion 2-Oxoglutarat, das in dem erfindungsgemäßen analytischen Element wieder als Substrat für die Tronsaminierung benutzt wird (Recycling), so daß seine Konzentration vorteilhaft im analytischen Element gering gehalten werden kann und andererseits entsteht Wasserstoffperoxid, das in bekannter Weise, zum Beispiel mit Hilfe von Peroxidase zur Oxidation eines Ch omogens dient. Die am Ende der ganzen Reaktionskette gebildete Menge an Farbstoff ist proportional, und damit Maß, der zubestimmenden Transaminaseaktivität. Die Konzentration des Farbstoffes wird entweder spektralfotometrisch oder durch Farbvergleich mit einer Farbtafel ermittelt.

Eine vorteilhafte Möglichkeit der Gewinnung von Glutamatoxidase ist die Isolierung aus Streptomyces endus, die in der DD-PS 240919 beschrieben wurde. Die anschließende Immobilisierung des Enzyms im anc-ytischen Element kann in der großporigen Schicht oder einer darunterliegenden Schicht erfolgen.

Die Spezifität des analytischen Elements für verschiedene Transaminasen wird nur durch die unterschiedlichen Aminosäuresubstrate der Transaminasen bestimmt. Es ist vorteilhaft, diese sowie 2-0>:oglutarat in der großporigen Aufnahmeschicht unterzubringen und den anderen Teil des Reaktions- und Nacnweissystems in darunterliagenden Schichten. Auf diese Weise kann die Herstellung der analytischen Elemente für verschiedene Transaminasen hinsichtlich der Enzymbereitatellung im Teststreifen una der Beschichtung vereinheitlicht werden und nu r die Aufnahmeschicht muß bei der Herstellung differenziert behandelt werden.

Eine Voraussetzung für die Transaminasebestimmung ist, daß die Transaminasen in den Teststreifen eii^'ingen können, dazu muß die Aufnahmeschicht des Teststreifens genügend großporig sein. Wie wir entdeckten, können bei Vt-rwendung von Agarose mit bestimmten Additiven, insbesondere Saccharose, großporige und gleichmäßig transparente, trockene Gelschichten erhalten werden, die sich als Aufnahmeschicht für Festphasen-Tests eignen. Die gleichmäßige Transparenz der Teststreifen gestattet es, zur Auswertung der Meßergebnisse herkömmliche Durchlichtfotometer einzusetzen, so daß keine speziellen Auswertegeräte benötigt werden. Für den Teststreifenhersteller entsteht außerdem der Vorteil, daß sich, unter Verwendung von Agarose mit Additiven, Teststreifen mit gleichbleibenderen Eigenschaften produzieren lassen, als zum Beispiel bei Verwendung von Papier als Reagenzträger.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen analytischen Elements ist, daß die Bestimmung von Transaminasen in wäßrigen Flüssigkeiten schnell und ohne aufwendige Auswertetechnik erfolgen kann un-.i Jali su-h durch die Ausstattung der Teststreifen mit den gleichen Enzymen die Herstellung von Teststreifen für verschiedene Transaminasebestimmungen wesentlich vereinheitlichen läßt.

Ausführungsbeispiel

— Herstellung eines analytischen Elements zur Bestimmung von Alaninaminotransferase im Serum oder im Plasma Auf einer Acetylcellulose-Unter lage, die als Stützschicht dient und mit einer in der Filmtechnologie üblichen Haftschicht versehen ist, wird eine 7%ige Gelatinelösung aufgebracht, die auf einen pH-Wert zwischen 4,5 und 4,9 eingestellt ist und entsprechende Zusätze an, in der Filmtechnologie übliche Emulgatoren und vernetzende Reagenzien enthält. Vor dem Aufbringen auf den Schichtträger werden, wie zum Beispiel in der EP-PS 160847 beschrieben, der Gelatinelösung noch Peroxidase und o-Tolidinhydrochlorid sowie 800U Glutamatoxidase, gewonnen aus Streptomyces endus, in 100 ml Gelatinelösung zugesetzt. Auf die Gelatineschicht wird eine weitere Schicht, bestehend aus 2% Agarose-Lösung und 10Gew.-% Saccharose als Aufnahmeschicht aufgebracht, in die zusätzlich BOmmol Alanin und lOmmol 2-Oxoglutarsäure pro 100ml eingearbeitet sind. Zur Herstellung des Agarose-Sols werden 1g Agarose und 1g Dextran, dessen relative Molmasse etwa 40000 beträgt, in 100ml Wasser gegeben und auf etwa 97 ⁰C erhitzt. Anschließend wird die homogene Lösung auf weniger als 42 ⁰C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden Detergentien sowie Alanin und 2-0:<oglutarat eingearbeitet. Die Viskosität des Agarose-Sols beträgt beim Filmguß nicht mehr als 15cP. Die Trocknung des Agarose-Gels erfolgt bei Raumtemperatur.

Zur Bestimmung der Transaminaseaktivität werden 10μΙ Seruin oder Plasma auf einer Reaktionsfläche von 0,5cm² aufgebracht. Nach einer Einwirkzeit von 10 Minuten wird der entstandene Indikatorfarbstoff bei 625nm mit einem Durchlichtfotometer bestimmt.

Claims (7)

1. Analytisches Element zur Bestimmung von Transaminasen in wäßrigen Lösungen, bestehend aus einer oder mehreren makromolekularen Trägerschichten, in welche das Reaktions- und Nachweissystem eingearbeitet ist und die gegebenenfalls auf einer Stützschicht angeordnet sind, gekennzeichnet dadurch, daß das Reaktionssystem Glutamatoxidase, 2-Oxoglutarat sowie ein für die zu bestimmende Transaminase spezifisches Aminosäuresubstrat enthält, das Nachweissystem ein an sich bekanntes Nachweissystem für Wasserstoffperoxid oder Ammoniak ist und mindestens eine Trägerschicht des Schichtsystems eine großporige Aufnahmeschicht ist, in die die zu bestimmende Transaminase eindringt.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Glutamatoxidase aus Streptomyces endus gewonnen wird.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das spezifische Aminosäuresubstrat Alanin ist.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das spezifische Aminosäuresubstrat Aspartat ist.

b.

Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Schichtsystem, insbesondere die großporige Aufnahmeschicht, mindestens nach der Nachweisreaktion transparent ist.

6. Anaiytisches Element nach Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Schichtsystem nach der Nachweisreaktion durch Entfernen der großporigen Aufnahmeschicht durchsichtig ist.

7. Analytisches Element nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die großporige Aufnahmeschicht aus Agarose mit Additiven besteht.