DD263079A5

DD263079A5 - Verfahren zur Verbesserung der Expression von Eukaryontenprotein

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Publication number: DD263079A5
Authority: DD
Publication date: 1988-12-21

Abstract

In dem erfindungsgemaessen Verfahren zur Verbesserung der Expression von Eukaryontenprotein fuehrt man in die kodierende Sequenz der cDNA eines Eukaryontengens mindestens ein im entsprechenden Gen natuerlich vorkommendes Intron ein, kloniert diese cDNA in Prokaryonten, gewinnt die klonierte cDNA daraus und fuehrt die gegebenenfalls in eine Eukaryontenzelle ein, welche die cDNA in das gewuenschte Protein uebersetzt.

Description

Hierzu 8 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Expression von Eukaryontenprotein, wobei man cDNA eines Eukaryontengens in Prokaryonten kloniert, die klonierte cDNA daraus gewinnt und gegebenenfalls dieselbe in eine Eukaryontenzelle einführt, welche die cDNA in das gewünschte Protein übersetzt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Expression von Eukaryonten-DNA in tierischen oder menschlichen Zellkulturen kann von vielen Faktoren abhängen. Entscheidend hierfür können Promotor-Enhancer-Elemente, Terminationssequenzen und Polyadenylierungssequenzen und zellspezifische Faktoren sein. Diese zellulären Faktoren und DNA-Strukturen spielen eine Rolle in der Übersetzung von DNA in mRNA. Dabei ist es bei Eukaryontenzeilen und damit auch beim Menschen mit wenigen Ausnahmen so, daß die RNA im Zellkern als Vorläufer-RNA synthetisiert wird. Diese Vorläufer-RNA enthält, wie die Ursprungs-DNA, Teile, die Informationen exprimieren und Teile, die keine Information tragen und alslntrons bezeichnet werden. Die Vorläufer-RNA wandert durch den Kern und wird dann im Cytoplasma durch einen Vorgang, der als „Spleißen" bezeichnet wird, in eine meist kürzere Form durch Herausschneiden der Introns und Wiederverknüpfung der dabei gebildeten neuen Enden in eine mRNA überführt, die nun ein Protein mit katalytischen öder strukturellen Eigenschaften kodieren kann. Auch diese Übersetzung der mRNA in das Protein kann von Faktoren wie Messenger-Stabilität, Konformation der RNA oder Qualität der Nukleotide zur Initiation und gegebenenfalls auch der Termination der Proteinsynthese abhängig sein. Es ist nun sehr wünschenswert, die Expression beeinflussen zu können, um auf diesem Weg die Synthese der gewünschten Proteine steigern zu können.

Es war schon bekannt, in eine cDNA außerhalb der kodierenden Region und zwar am Ende ein Intron anzuhängen. Eine Wirkung auf die Expression des Genprodukts wurde dabei nicht festgestellt. Weiterhin tritt bei manchen Hefen ein Gen auf, das in einigen Stämmen ein Intron enthält und in anderen nicht. Es wurde deshalb versucht, das intronhaltige Gen aus einem Hefestamm in einen anderen Hefestamm einzuführen, der dieses entsprechende Gen ohne Intron enthält. Dabei wurde festgestellt, daß die Expression verschlechtert wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens mit dessen Hilfe die Expression von Eukaryontenprotein beeinflußt werden kann, so daß auf diesem Wege die Proteinsynthese verbessert wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Technologie zur Verbesserung der Proteinsynthese zu entwickeln, insbesondere um die Expression von Eukaryontenprotein zu beeinflussen.

Dieses Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zur Verbesserung der Expression von Eukaryontenprotein7 wobei man cDNA eines Eukaryontengens in Prokaryonten kloniert, die klonierte cDNA daraus gewinnt und gegebenenfalls dieselbe in eine Eukaryontenzelle einführt, welche die cDNA in das gewünschte Protein übersetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in die kodierende Sequenz der cDNA ein im entsprechenden Gen natürlich vorkommendes Intron eingeführt wird.

Überraschenderweise zeigt sich, daß nicht nur die bekannten Faktoren die Genexpression beeinflussen können, sondern, daß es vielmehr möglich ist, mit der Einführung eines Introns in eine kodierende cDNA eine Steigerung der Expression und damit der Proteinsynthese zu bewirken.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man die das gewünschte Protein kodierende cDNA in an sich bekannter Weise her z. B. unter Verwendung der entsprechenden mRNA. Diese cDNA, die ein zu synthetisierendes Protein kodiert, wird in an sich bekannter Weise in einem Prokaryonten kloniert. Dazu wird die cDNA mit Hilfe eines Plasmidvektors in den Prokaryonten eingeführt. In die das gewünschte Protein kodierende cDNA, die eine Kopie der entsprechenden mRNA ist, wird jedoch vor Einführung in die Prokaryontenzelle ein Intron insertiert, das in dem das gewünschte Protein kodierenden Gen der Eukaryontenzelle natürlich vorkommt. Das oder die Introns werden z. B. aus einer Genbank einer eukaryontischen Zelle über Hybridisierung mit einem Teil der cDNA gewonnen. Der Vektor, der die cDNA einschließlich des Introns trägt, wird in dem Prokaryonten kloniert. Die klonierte DNA wird dann gewonnen und kann gegebenenfalls in eine Eukaryontenzelle eingeführt werden. In der Eukaryontenzelle exprimiert dann die von der DNA abgeleitete mRNA das gewünschte Protein. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es auch möglich, in die das gewünschte Protein kodierende cDNA mehrere Introns einzuführen, die in der das gewünschte Protein kodierenden natürlich vorkommenden DNA enthalten sind. Bevorzugt ist es, ein oder mehrere Introns des das Protein kodierenden Gens in die entsprechende cDNA zu insertieren, so daß das oder die Introns sich in der cDNA an derselben Stelle befinden, an der sie auch in dem natürlichen Gen liegen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt unter Verwendung einer cDNA, die die Proteinase tPA kodiert. Dazu wird entweder ein Plasmid verwendet, das das tPA-Gen enthält oder die tPA kodierende cDNA wird in bekannter Weise über mRNA gewonnen. Ein oder mehrere Introns, die das tPA-Gen in natürlichen Eukaryontenzellen enthält, werden in diese tPA-cDNAeinligiert. Die Plasmide, die die tPA-cDNA mit einem oder mehreren Introns enthalten, stellen die für die Expression in Eukaryonten benutzten Shuttle-Vektoren dar. Diese Shuttle-Vektoren werden in Eukaryontenzellen transferiert und exprimieren dann tPA. Überraschenderweise ist die Expression von tPA in Eukaryontenzellen, die tPA kodierende Plasmide mit Introns enthalten, bei weitem höher als die vergleichbarer Eukaryontenzellen mit tPA kodierenden Plasmiden ohne Introns.

Bevorzugt wird in die das Protein tPA kodierende cDNA das Intron C einligiert. Die Sequenz dertPA-cDNA ist bekannt und wurde von Pennicaetal (Nature 1983,301, 214-221) publiziert. In dieser publizierten Sequenz liegt ein Intron, nämlich das von Ny et al (Proc. Natl.Acad. Sei., 81,5355,1984) beschriebene Intron C zwischen der in der cDNA angegebenen BgI Il Schnittstelle an Pos. 187 und der Pst I Schnittstelle an Pos. 204. Aus dieser Beschreibung ergibt sich, daß Intron Can beiden Seiten von Exon-Sequenzen umgeben ist, nämlich zur 5'-Richtung hin von Exon-Sequenzen, die eine BgI Il-Spaltstelle kodieren und zum 3'-Ende hin von Exon-Sequenzen, die eine Pst !-Schnittstelle enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Intron C über die auch im Gen enthaltenen BgI II- und Pst !-Schnittstellen in die cDNA ernligiert in an sich beka η nter Weise.

Um die Intronsequenz für tPA zu erhalten, wird bevorzugt in bekannter Weise über mRNA eine cDNA-Sequenz hergestellt, die den als tPA bezeichneten Tissue Plasminogen Activator codiert. Durch Spaltung mit einer Restriktionsendonuklease wird aus dieser tPA-cDNA ein beliebiges Fragmentgewonnen, oder ein solches, das durch die Pst I Schnittstelle an Pos. 204 und Pos.618 der von Pennica et al. publizierten Sequenz charakterisiert ist. Dieses Fragment wird in einen Plasmidvektor ligiert. Der Plasmidvektor wird dann in einen Wirtsstamm transformiert und dann in bekannter Weise selektioniert, beispielsweise über Resistenzgene. Ein derartig selektionierter Wirtsstamm, der das Plasmid mit dem tPA-cDNA-Fragment enthält, wird dann mit einem Lambda-Phagenlysat infiziert (R. M. Lawn et al. Cell 15 [1978] 1157). Es wird dabei ein Lambda-Phagenlysat verwendet, in dessen DNA vorher genomische DNA aus menschlichen Zellen einligiert wurde. Die Vorgehensweise erfolgt exakt nach der von Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrook, J. in: „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory 1982, S.353-361 beschriebenen Methode. Die nach dem in vivo Rekombinisationsereignis enthaltenen Phagen können nur durch Oligonukleotide, die von der tPA-cDNA abgeleitet wurden, charakterisiert werden. Das im vorliegenden Fall isolierte Teilfragment des tPA-Gens wird mit Eco Rl gespalten und das resultierende 9kb große Fragment in den ebenfalls mit Eco Rl gespaltenen Plasmidvektor pBR 322 ligiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pBT 72, = DSM 3609. Aus diesem Plasmid kann dann durch Restriktionsendonukleasen wiez. B. BgI Il und Pst I der etwa 2,0kb große dem Intron C entsprechende Teil des tPA-Gens inklusive der angrenzenden Exonstrukturen herausgeschnitten werden und für die weitere Klonierung verwendet werden. Dieses so gewonnene Intron C-Fragment wird dann in eine in bekannter Weise gewonnene cDNA, die tPA kodiert, eingefügt. Bevorzugt wird dieses Intron an seiner im Gen vorkommenden Position inseriert. Dazu wird die tPA-cDNA an der entsprechenden Stelle durcrf dieselben Restriktionsendonukleasen wie das Intron C mit seinen angrenzenden Exonstrukturen gespalten, also z.B. BgI Il an Pos. 187 und Pst I an Pos. 204 und das in oben beschriebener Weise gewonnene Intron C dann eingefügt. Alternativ kann, falls die Sequenz des einzufügenden Introns bekannt ist, letzteres auch synthetisch hergestellt und in das Verfahren eingesetzt werden.

Zur Gewinnung einer tPA-Sequenz mit Intron wird bevorzugt das Plasmid pBT 95 (DSM 3611) verwendet. Dieses Plasmid besteht aus einem Plasmidvektor und trägt dietomplette cDNA-Sequenz, die zur Kodierung von tPA notwendig ist einschließlich des Signalpeptids.

In dieses Plasmid pBT 95 wird das Intron C in an sich bekannter Weise ligiert. Ein Plasmid, das sowohl die tPA kodierende Sequenz als auch das Intron C enthält, ist das erfindungsgemäße Plasmid pBT 94 (DSM 3610).

Aus dem Plasmid pBT 94 kann durch Spaltung mit Restriktionsendonkleasen wie z. B. Xba I und Hind III die tPA kodierende Sequenz mit Intron leicht in an sich bekannter Weise herausgespalten und umkloniert werden. Sofern das Intron eine der beiden Restriktionserkennungsstellen erkennt, kann das Plasmid unter limitierenden Bedingungen gespalten werden oder die Erkennungsstelle im Intron vorher zerstört werden, z. B. durch Auffüllen der überstehenden Enden mit allen vier Triphosphasten in Gegenwart von DNA-Polymerase.

Zur Expression von tPA in Eukaryontenzellen wird ein Plasmid-Shuttle-Vektor verwendet. In diesen Shuttle-Vektor, der alle Funktionen trägt, um sowohl in Prokaryontenzellen als auch in geeigneten Eukaryontenzellen vermehrt zu werden, wird bevorzugt das aus pBT 94 erhaltene Fragment, das die gesamte tPA kodierende Sequenz und das Intron C trägt, einligiert. Die erhaltenen Plasmide werden zurTransfektion von Eukaryontenzellen verwendet. Besonders bevorzugt wird als Shuttle-vektor das erfindungsgemäße Plasmid pBT 102 (DSM 3612) verwendet, das sowohl die gesamte tPA kodierende Sequenz mit dem Intron C als auch die für die Expression in Eukaryontenzeilen notwendigen Gene enthält. Neben diesen für die transiente Expression geeigneten Vektoren können auch Vektoren verwendet werden, die für die stabile Integration in Eukaryonten DNA geeignet sind.

DieTransfektion der Eukaryontenzellen erfolgt in an sich bekannter Weise. Mit den erfindungsgemäß verwendeten Vektoren, die die gesamte tPA kodierende Sequenz einschließlich des Introns C tragen, werden ausgezeichnete Ergebnisse bei der Expression erhalten. Zum Vergleich wurde in denselben Shuttle-Vektor das Plasmid pBT 95, das die gesamte tPA kodierende Sequenz ohne Intron enthält, ligiert. Auch dieses Plasmid wurde in Eukaryontenzellen transferiert. Dabei ergaben sich für die Expression weitaus schlechtere Ergebnisse.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Expression von Eukaryontenprotein bedeutend zu verbessern. Weiterhin werden erfindungsgemäß Plasmide zur Verfugung gestellt, die zur Herstellung von tPA mit hohen Ausbeuten geeignet sind.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. In der beiligenden Zeichnung zeigen:

Rg. 1: das Plasmid pBT 95, welches die komplette cDNA, ligiert in pHC 79, enthält,

Fig.2: das Plasmid pBT94, welches,zusätzlich zu den Sequenzen aus pBT95,das Intron Centhält,

Fig. 3: das Plasmid pBT 102, welches für die Expression in Eukaryonten geeignet ist und die tPA-cDNA sowie Intron C enthält,

Fig.4: das Plasmid pBT 103; analog pBT 102, jedoch ohne Intron,

Fig.5: das Plasmid pKCR-tPA_lr

—*

Fig.6: das Plasmid pKCR-tPA₂

Fig.7: das Plasmid pSVßG und seine Herstellung Fig.8: das Plasmid pSVßc und seine Herstellung Fig.9: das Plasmid RßG ref Fig. 10: Si^mapping mit einer aus Plasmid pßcg gewonnenen Probe

Die Fragmentgrößen in den Plasmiden sind nicht maßstabgerecht dargestellt. Außerdem sind nur die für die Klonierung relevanten Erkennungssequenzen angegeben.

Beispiel 1

Isolierung eines tPA Gen-Fragments

Nach der von Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrook, J. in: „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory 1982, S. 353-361 beschriebenen Methode wird über ein in vivo Rekombinationsereignis aus der Maniatis Genbank (R. M. Lawn, E. F. Fritsch, R. C. Parker, G. Blake and T. Maniatis, Cell 15 [1978], 1157) ein Lambda-Phagen gewonnen, der einen Teil des tPA-Gens kodiert. Dazu wird ein DNA-Fragment dertPA-cDNA, vorzugsweise das etwa 400Bp große durch die Pst I Schnittstelle an Pos.204 und Pos. 618 charakterisierte Fragment isoliert und in den von B. Seed (Nuc. Acid Res., 11,2427,1983) beschriebenen und ebenfalls mit Pst I gespaltenen Vektor Pi An 7 ligiert. Dieser einen Teil der tPA-cDNA enthaltende Vektor wird in einem E.coli-Stamm (W3110, P3) transformiert, in dem auf Erhalt dieses Plasmidsselektioniert werden kann. Nach Überinfektion mit λ-Phagen, in die zuvor Teile des menschlichen Genoms einligiert wurden (R. M. Lawn, E. F. Fritsch, R. C. Parker, G. Blake and T. Maniatis, Cell 15 [1978], 1157), kann es zu einem Rekombinationsereignis zwischen einem Teil des tPA-cDNA enthaltenden Plasmidsund einer λ-DNA kommen. Bevorzugt findet ein solches Rekombinationsereignis über homologe Sequenzen, z. B. tPA-Sequenzen, statt. Im vorliegenden Fall konnten aus der Maniatis Genbank (R. M. Lawn, E. F. Frisch, R. C. Parker, G. Blake and T. Maniatis, Cell 15 [1978], 1157) Phagen isoliert werden, die einen Teil des tPA-Gens enthalten. Das Prinzip der Klonierung eines Genfragments über ein in vivo Rekombinationsereignis ist in Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambook, J. in: „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory 1982, S. 353-361 beschrieben. Die so erhaltene λ-DNA wird mitEco Rl gespalten. Durch Hybridisierung mit Oligonukleotiden, die der Pos. 390-410 bzw. 609-627 der von Pennica et al. publizierten Sequenz (Nature 1983, 301, 214-221) entsprechen, kann ein 9kb großes Eco R I-Fragment charakterisiert und in das mitEco Rl gespaltene Plasmid pBR322 kloniert werden; dabei erhält man pBT72, DSM 3609. Aus diesem Plasmid kann durch Spalten mit BgI Il und Pst I ein etwa 2kb großes Fragment erhalten werden, das aus dem Intron C und zusätzlich aus den angrenzenden Exonsequenzen besteht, die eine BgI Mund Pst I Erkennungssequenz besitzen.

Beispiel 2

Klonierung von tPA-kodierenden Sequenzen mit Intron

Das Plasmid pBT 95, DSM 3611 (Fig. 1) wird hergestellt, indem die gesamte tPA-cDNA in das Plasmid pHC 79 ligiert wird. Aus Gründen der Umklonierbarkeit wurden an die Enden kommerziell erhältliche Polylinkerregionen aus pUC 12 ligiert. Ebenso können andere Polylinker verwendet werden, dieRestriktionserkennungssequenzen enthalten, welche weder in Intron noch in der cDNA vorkommen.

Das Plasmid pBT95 wird mit Pst I teilweise und mit BgI Il vollständig gespalten. Das nach Beispiel 1 erhaltene, etwa 2kb große Fragment, welches das Intron C vollständig enthält, wird in das gespaltene Plasmid pBT 95 ligiert. Das resultierende Plasmid ist pBT 94 (DSM 3610), (Rg. 2).

Beispiel 3

Konstruktion von tPA kodierenden Plasmiden zur Expression in Eukaryontenzellen:

Zur Expression in Eukaryontenzellen wird Plasmid pA-11-SVL₂ (DSM 3614) verwendet (Gruß et al, in: „Eukaryotic Viral Vectors" Gluzman Herausgeber, S. 13-18, Gold Spring.Harbor Laboratory, 1982). Dieses Plasmid trägt im wesentlichen Sequenzen des SV40-Virus, die späten Funktionen zwischen der Barn HI-Schnittstelle an Position 282 und 2469 wurden deietiert. Ein mit Eco RI gespaltener und mit Xba I-Linkern versehener Vektor pBR 322 wurde in die Tag-Schnittstelle von pA-11 -SVL₂ an Position 4675 •ligiert. Der erhaltene Vektor trägt somit alle Funktionen um sowohl in E.coli-Zellen als auch in geeigneten Eukaryontenzellen, wie z.B. CV-1 verwendet zu werden. Plasmid pA-11-SVL₂ wird mit Bam Hl gespalten, die Enden mit DNA-Polymerase und den

4Triphosphaten glatt gemacht. In diese nun glatten Enden werden die ebenfalls auf gleiche Weise glatt gemachten Enden der mit Hind III- und Xba l-gespaltenen Fragmente aus pBT94 bzw. pBT95, die die für tPA kodierende DNA enthalten, wobei pBT94 zusätzlich noch in die tPA kodierende Sequenz das Intron C einligiert hat, ligiert. Die resultierenden Plasmide tragen die Bezeichnung pBT102 (DSM 3612), Fig. 3 mit Intron C bzw. pBT103 (DSM 3613) (Fig.4). Diese beiden Vektoren werden zum Vergleich der tPA-Expression in CV-1-Zellen verwendet. Vor der Transformation werden pBT102 bzw. pBT103 mit Xba I gespalten und in Konzentrationen von etwa 1 μ9/| religiert. Durch diese Manipulation wird die Region, die das große T-Antigen des SV40 kodiert, wieder hergestellt. Die religierten Plasmide können zur Transfektion von CV-1-Zellen verwendet werden, da sie das große T-Antigen kodieren.

Dieses T-Antigen istfürdieextrachromosomale Replikation dieser Vektoren essentiell. Zur Transfektion werden 4 χ 10⁴CVi-Zellen auf kleinen Petri schalen ausgebracht. Am folgenden Tag werden die Zellen vor der Transfektion mit serumfreiem Medium (z. B. D-HEM-Medium) gewaschen. Die religierten Plasmide werden zusammen mit DEAE-Dextran auf die Zellen gegeben und 3 Stunden bei 37°C inkubiert (Sompayrac, L M. and Danna, K. J. 1981 Proc. Natl. Acad. Sei U. S.A. 78,7575-7578). Nach Waschen und Zugabe von frischem Medium kann nach 40stündiger Inkubation der Gehalt an tPA im Kultur-Überstand im ELISA-Test bestimmt werden. Die Anzahl dertransfizierten und tPA-produzierenden Zellen wird mittels Immunstaining bestimmt Dazu werden die entsprechenden Petrischalen mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen und nach Fixierung mit Formaldehyd mit 0,2% Triton X 100 lysiert. Darauf wird mit Peroxidase gekoppelten, gegen tPA gerichteten Ziegen-lgG, inkubiert. Die gebundenen Antikörper werden dann durch die Peroxidase-spezifische Färbereaktion visualisiert. Im Mikroskop wird die Anzahl dertPA-produzierenden Zellen bestimmt.

Tabelle I zeigt die tPA-Expression im transienten System durch Plasmide, die nur die cDNA enthalten (pBT 103), bzw. die cDNA mit einem Intron enthalten (pBT 102).

Tabelle 1

Experiment 1 Experiment 2

Ko — —

pBT102 2,4 2,92

pBT103 1,32 1,545

Die Einheiten sind angegeben in Adsorptionseinheiten bei 405 nm. Kontrolle: Keine Transfektion mit dem Vektor. Den Daten der Tabelle ist zu entnehmen, daß mit Plasmid pBT102 nahezu die doppelte Expressionsrate erhalten wird.

Beispiel 4

Konstruktion der Expressions-Vektoren

Das Plasmid pKCR^nl (Herstellung vgl. Beispiel 5), welches den frühen SV40-Promotor, daran anschließend das Kaninchen-ß-Globin-Gen und danach 2 Polyadenylierungsstellen enthält, wurde zwischen dem SV40-Promotor und dem ß-Globin-Gen mit Bam H1 geschnitten, die Enden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdünn-Darm dephosphorysiert und das lineare Molekül durch zweimaliges Auf reinigen in Low melting Agarose isoliert. Die tPAc-DNA und das Mini-Gen wurden mit Xba und Hind III aus den rekonstituierten Plasmiden pBT94 bzw. pBT95 herausgeschnitten, die Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA Polymerase und vier Deoxynucleosid-triphosphaten eingefüllt und anschließend auf Low melting Agarose gereinigt.

Äquimolare Mengen von t-PA c-DNA und t-PA Mini-Gen wurden mit dem oben beschriebenen Vektor-Fragment mit T4 Ligase inkubiert und anschließend in E.coli HB101 (DSM 1607) transferiert. DNA von Miniplasmid-Präparationen wurde durch Restriktions-Analyse auf t-PA Insertionen überprüft.

Es wurden Plasmide mit cDNA, bzw. Minigen in syn, als auch in anti-Orientierung zum frühen Promotor von SV40 isoliert.

—> Plasmid pKCR-tPAi: tPAcDNA in syn Orientierung zum frühen Promotor von SV40

<— Plasmid pKCR-tPA,: tPAcDNAin anti Orientierung zum frühen Promotor von SV40

Plasmid pKCR-tPA₂: tPA Minigen in syn Orientierung zum frühen Promotor von SV40

Plasmid pKCR-tPA₂: tPA Minigen in anti Orientierung zum frühen Promotor von SV40 Transkription nach Einführen der Expressions-Plasmide in Säuger-Zellen

tPA cDNA und tPA Mini-Gen enthalten jeweils am 5'-Ende sieben Nucleotide untranslatierte Region. Sowohl cDNA als auch Mini-Gen haben keine Polyadenylierungs-Stelle. Im Falle des tPA cDNA Expressions-Vektors starten die Transkripte auf dem frühen Promotor von SV40, laufen in dietPAcDNA, dann wird das große Intron von Kaninchen-ß-Globin herausgespleißt. schließlich terminieren sie an einer der beiden Polyadenylierungsstellen (siehe Fig. 5). Im Falle des tPA Minigen Expressions-Vektors werden die Transkripte zusätzlich in dertPA Region gespleißt (siehe Fig. 6). Expression von tPA nach Einführen der Expressions-Plasmide in COS-Zellen COS-Zellen sind Affen-Zellen, die konstitutiv das große T-Antigen von SV40 synthetisieren (2). Plasmide, welche einen Replikations-Ursprung von SV40 besitzen, vermehren sich in diesen Zellen (2). Die oben beschriebenen Expressions-Plasmide wurden mit der DEAE-Dextran Methode (3) in COS-Zeilen eingeführt und dietPA Konzentration in den Kultur-Überständen sechs Tage nach der Konzentration durch ELISA = Enzyme Linked Immunoadsorbant Assay bestimmt.

DieTransfektionen mit den einzelnen Expressions-Plasmiden wurden jeweils achtfach durchgeführt. Es zeigte sich eine sehr gute Reproduzierbarkeit der einzelnen Transfektionen.

Expressions-Vektor	Absorption bei 405 nm
pKCR-tPA,	0,7-0,75
pKCR-tPA,	0,05
pKCR-tPA₂	1,2-1,25
pKCR-tPA₂	0,05

Bei diesen Experimenten wurden jeweils 10⁵ Zellen mh^g DNA transferiert.

Die Experimente zeigen, daß durch Einführung eines Introns in die tPA cDNA gesteigerte Expression von tPA auftritt.

(1) O'Hare, K., Benoist, C, Breathnach, R., 1981 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,1527-1531

(2) Gluzman,Y., 1981 Cell 23,175-182

(3) Lai,C.Y., Nathans, D., 1974 Virology 60,466-475

Beispiel 5

Der Einfluß von Introns auf die Expression von Kaninchen-ß Globinmessenger RNS in Säugerzellen.

In diesem Beispiel wird die Konstruktion von eukaryotischen Expressions-Vektoren für Kaninchen ß-Globin c-DNS und die genomische Sequenz von Kaninchen ß-Globin beschrieben. Die Expression der erwähnten Sequenzen erfolgte unter der Kontrolle des Simian Virus 40 frühen Promotors. Die Expressions-Pläsmide wurden zusammen mit einem Referenz-Plasmid in Affennieren-Zellen transferiert und die Globin-Transkripte durch S 1-mapping bestimmt. Bei Vergleich von genomischem Exressions-Plasmid und c-DNS Expressions-Plasmid zeigt sich ein etwa 10facher Unterschied in der Menge der Globin Transkripte.

1) Konstruktion von PlasmidpSVßG (Fig.7)

a) Ausgangsplasmide:

Plasmid Z-pcRI/RchrßG-1 ist ein Plasmid, dessen Sequenz und Restriktionsschnittstellen in Science 206 (1979), 337-344 beschrieben sind.

pkCR ist ein Plasmid, dessen Konstruktion in Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981), 1527-1531 beschrieben ist und das aus den dort beschriebenen, sequenzierten Elementen von pBR322, SV40 und dem Kaninchen-ß-Globin-Gen besteht.

b) Konstruktion:

Ausz-cRI/RchrßG-1 wurde das Stück des ß-Globin-Gens, welches von der Pvu Il (-10) Schnittstelle bis zur BgI Il Schnittstelle in der 3'-untranslatierten Region reicht, hergestellt, die Enden mit Klenow-Enzym eingefüllt und das Fragment auf einem Low-melting-Agarose-Gel über Vergleich mit den erwarteten Restriktionsenzymspaltmustern isoliert (Fig. 7 b).

pkCR wurde mit Bam HI und Sal I geschnitten, die Enden mit Klenow-Enzym eingefüllt und das in Figur 7a gekennzeichnete Fragment auf einem Low-melting-Agarose-Gel nach Indentifizierung über Restriktionsenzymspaltmuster identifiziert und isoliert.

Die beiden so erhaltenen Fragmente wurden mit T4-Ligase behandelt und in E. coli HB101 (DSM 1607) transferiert. Aus den erhaltenen Kolonien wird das Plasmid pSVßG über Restriktionsenzymspaltmuster identifiziert und isoliert (Fig.7c).

In diesem Expressions-Plasmid ist die genomische Sequenz des Kaninchen ß-Globin-Gens (beginnend mit Position -10) mit dem frühen Promotor von Simianvirus SV40 fusioniert.

Die Promotor-Elemente des Kaninchen ß-Globin-Gens sind bei dieser Fusion nicht mehr vorhanden. Die Termination der Transkripte erfolgt durch die Polyadenylierungsstelle des Kaninchen ß-Globin-Gens.

2) Konstruktion von Plasmid pSVßc (Fig.8)

a) Ausgangsplasmide: pkCR (vgl. Beispiel 5a)

pßcg: Plasmid, welches die Kaninchen ß-Globin c-DNS und zusätzliche Sequenzen bis maximal zur Position -100 der 5'-untranslatierten Region des Kaninchen ß-Globin-Gens enthält. Es ist also ein Hybrid aus genomischen Sequenzen der untranslatierten Region und der c-DNS des Kaninchen ß-Globin-Gens. Die Konstruktion erfolgt in der Weise, daß die vollständige ß-Globin c-DNS Sequenz, vgl. Cell 10, 571-585 (1977), und ein Teil der 5'-genomischen Sequenz des ß-Globin-Gens (Sequenz vgl. Science 206 [1979], 337-344) bis mindestens über die Pvu Il (-10) Schnittstelle, aber maximal bis zur Position-100 ligiertwird.

b) Konstruktion

pkCR wurde mit Eco Rl partiell gespalten, die Enden mit NucleaseSI behandelt, mit T₄-ügase religiert, in E.coli HB101 transferiert und das Plasmid pkCR Δ über Restriktionsenzymspaltmuster identifiziert und isoliert (Fig. 8a).

pkCRA wurde mit Bam HI und Sal I geschnitten, die Enden mit Klenow-Enzym eingefüllt und das größere der beiden Fragmente auf einem Low-melting-Agarose-Gel isoliert. Aus Plasmid pßcg wurde das ß-Globin c-DNS-Fragment von Pvu Il (-10) bisHhal (Cell 10, 571-585) isoliert. Dieses Fragment enthält die gesamte 3' untranslatierte Region des Kaninchen ß-Globin Gens. Diese beiden Fragmente wurden mitTi-Ligase behandelt und in E. coli HB101 transferiert. Aus den erhaltenen Kolonien wurde Plasmid pSVßc über Restriktiontsenzymspaltmuster identifiziert und isoliert.

In Plasmid pSVßc ist also ein genomisch c-DNS Kaninchen ß-Globin Hybrid mit dem frühen Promotor von SV40 an der Position -10 von Kaninchen ß-Globin fusioniert. Das Expressins-Plasmid enthält keine Introns. Es wird die Polyadenylierungsstelle von Kaninchen ß-Globin verwendet.

3) Vergleich von pSVßg und pSVßc

Die Fusion der ß-Globin Sequenzen mit dem frühen Promotor von Simian Virus 40 erfolgt in beiden Fällen an Position -10 von Kaninchen ß-Globin (+1 bezeichnet den Start der Transkripte). In beiden Fällen wird für die Termination die Polyadenylierungsstelle des Kaninchen ß-Globin Gens verwendet. pSVßg enthält die beiden Introns des Kaninchen ß-Globin Gens, pSVßc enthält keine Introns.

4) Transfektion von pSVßg und pSVßc in Säugerzellen

Als Referenz-Plasmid wurde das in Fig. 9 dargestellte Plasmid verwendet. Die Bezeichnung ist RßGref. Es enthält das Kaninchen ß-Globin Gen in die Bam HI Stelle von pBR₃₂₂ inseriert. In Exon I befindet sich eine Insertion von sieben Basen-Paaren. Es wurden 10Mg pSVßgund 10Mg RßGref gemischt und parallel dazu 10MgpSVßcund 10Mg RßGref und nach der Kalzium-phosphat Präzipitations-Methode (Virulogy 52[1973], 456-467) in jeweils 2 χ 10⁶ Affennieren-Zellen (CV 1) transferiert. Die Zellen wurden 50 Stunden nach der Transfektion geerntet und RNS nach Standardmethode (Biochemistry 24 [1979] 5294-5299) isoliert.

5) S1-mapping

Das S 1-mapping wurde nach Standard-Methode durchgeführt (Nucl. Acids Res. 7 [1979] 1175-1193) Präparation der Probe: pßcg (vgl. Fig. 10) ist ein Plasmid, welches einen Hybrid aus Sequenzen der untranslatierten Region des Kaninchen ß-Globin Gens bis zur Pst-Stelle bei -100 und die gesamte J<aninchen ß-Globin c-DNS enthält, pßcg wurde mit Bam HI geschnitten und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Kälber-Dünndarm dephosphatiert. Die Enden wurden mit Polynukleotid-Kinase und γ²Ρ ATP kinasiert, mit Pst I nachgeschnitten und das interessierende 450 bp Bam H I-Pst Fragment auf einem Low-melting Agarose Gel isoliert. 50000cpm der endmarkierten Probe wurden mit jeweils 20 Mg RNS hybridisiert (Bedingungen in 5 beschrieben). Die Hybride wurden mit 3OU S1 Nuklease behandelt und anschließend auf einem 4% Polyacrylamid-Gel mit 7 Μ Harnstoff aufgetrennt und das Gel mit Röntgen-Film exponiert. Die Probe und die erwarteten geschützten Fragmente sind in Fig. 10 dargestellt. Für die Globin Transkripte beider Epressions-Plasmide wird ein geschütztes Fragment von 360 Basen-Paaren erwartet. Wegen der Insertion von sieben Basen-Paaren in Exon I des Kaninchen ß-Globin Gens im Referenz-Plasmid wird ein wesentlich kürzeres geschütztes Fragment erwartet.

Claims

1. Verfahren zur Verbesserung der Expression von Eukaryontenprotein, wobei man cDNA eines Eukaryontengens in Prokaryonten kloniert, die klonierte cDNA daraus gewinnt und gegebenenfalls dieselbe in eine Eukaryontenzelle einführt, welche die cDNA in das gewünschte Protein übersetzt, dadurch gekennzeichnet, daß in die kodierende Seuqenz der cDNA ein im entsprechenden Gen natürlich vorkommendes Intron eingeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in die kodierende Sequenz der cDNA mehrere im entsprechenden Gen natürlich vorkommende Introne eingeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Intron an der Stelle in die cDNA einführt, welche die Stelle korrespondiert, die im entsprechenden Gen dieses Intron aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete cDNA das Protein tPA codiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Intron C einführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in das Plasmid pBT95, das die komplette tPA-cDNA einschließlich des Gens für das Signalpeptid enthält, das Intron C einligiert und das so erhaltene Plasmid pBT 94 in die Eukaryontenzelle einführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Plasmid pBT 94 die komplette tPA-cDNA, die das Intron Centhält, in das Plasmid pA-11-SVL₂ einligiert und das so erhaltene Plasmid pBT 102 in die Eukaryontenzelle einführt.