DD261219A1 - Verfahren zur gewinnung von metachondrien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Zuechtung von Metachondrien (veraenderte Organelle transformierter Zellen) durch Behandlung von Zellsuspensionen mit organischen Loesungsmitteln sowie Belueftung und Bebruetung in einem geeigneten Naehrmedium. Dieser Befund muss als Verifizierung der Endosymbionten-Hypothese gewertet werden. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Biologie und die Medizin.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Metachondrien sowie ihre Züchtung in einem geeigneten Nährmedium. Unter Metachondrien sind veränderte Mitochondrien transformierter Zellen — etwa Tumorzellen menschlicher bzw. tierischer Herkunft oder überalteter Hefezellen — zu verstehen. Die Gewinnung von Metachrondrien aus Zellsuspensionen erlaubt den Schluß auf das Vorliegen von Tumoren im Organismus

Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Biologie und die Medizin.

Charakteristik der bekannten Lösungen

Für die Kanzerogenese werden derzeit zweierlei Einflüsse geltend gemacht: zum einen solche, die eine primäre Umwandlung der normalen Zelle in einen präkanzerösen Zustand verursachen (Initiation), zum anderen solche, die eine Umwandlung der präkanzerösen in eine manifest kanzeröse Zelle bedingen (Promotion). Innerhalb des Spektrums von Tumorzellen unterscheidet man verschiedene Grade der Abweichung vom normalen Zellverhalten (S. M. Rapoport, Medizinische Biochemie, VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1983, S.718).

Solange der Initialvorgang der Krebsentstehung unaufgeklärt ist, wird man sich nach Ebeling und Tanneberger bei der Bewertung der dem Krebs vorausgehenden Zeil- und Gewebsveränderungen auf die beim Menschen empirisch und am Versuchstier experimentell erworbenen Kenntnisse stützen müssen. Eine Störung der Membranstruktur wäre einer von mehreren Schritten, in denen eine Zelle maligne alterieren könne. Hinzukommen müßten Änderungen am Zellgenom durch Rückwirkung von Primärveränderungen auf das genetische Substrat (Beiträge und Behandlung bösartiger Neubildungen, VEB Gustav Fischer Verlag Jena 1981).

Nach Graffi handelt es sich bei der Tumorbildung um einen komplexen Prozeß, bei dem man mehrere qualitativ verschiedene Phasen unterscheiden könne. Die Tumorbildung werde durch einen spezifischen Initialvorgang eingeleitet (Bildung einer Tumorkeimanlage), der aus der direkten Wirkung von Kanzerogenen auf die Zelle resultiere. Diese Kanzerogene würden ausschließlich im Cytoplasma, speziell in den Mitochondrien und Mikrosomen, gespeichert. Der Schlüssel zum Krebsproblem sei in der Zelle zu suchen. Beim Krebs handele es sich um eine Neubildung menschlichen undtierschen Gewebes, das durch schrankenloses Wuchern zur Zerstörung der ursprünglichen Gewebe und Organe und schließlich zum Tod des Individuums führe. Graffi kam zu der Schlußfolgerung, daß der malignen Zellentartung nicht eine Gen- oder Chromosomenmutation zugrunde liege, sondern eher mutative Veränderungen der cytoplasmatischen Mitochondrien und Mikrosomen (Schweiz. Med. Wochenschrift, S.871, 970).

Nach Butschak dient als Kriterium der Malignität lediglich das Verhalten der Zellen in einem Wirtsorganismus. Jede Krebszelle zeige gegenüber ihrer normalen Ausgangszelle mehr oder weniger große biochemische und morphologische Differenzen. Jede gesunde Körperzelle könne unter dem Einfluß verschiedener endogener oder exogener Noxen ihre normale Funktion verlieren und sich zur Krebszelle entwickeln (Biochem. Grundlagen der Teilung und Differenzierung von Normal-und Tumorzellen, VEB Verlag G. Fischer Jena 1976, S. 251-255).

Ein endgültiger Nachweis einer Änderung am genetischen Code als Grundelement der Kanzerisierung ist nach Schmähl nicht bewiesen (Maligne Tumoren-Entstehung, Wachstum, Chemotherapie, Editio Cantor Aulendorf 1980). Wenn die Kanzerisierung jedoch einmal eingetreten sei, könne sie medikamentös oder durch andere Therapieformen nicht mehr beeinflußt werden, „denn wir kennen keine Pharmaka, die in der Lage währen, Veränderungen am genetischen Apparat zu reparieren oder gar zu normalisieren".

Barzala stellte fest, daß sich sowohl zwischen den Mitochondrien als auch im Cytoplasma freiliegende Granula und Partikelchen befinden, die auf chemischem und physikalischem Weg isoliert werden können, deren Herkunft jedoch ungeklärt sei. Er hielt sie für Nukleinsäuren. Das Elektronenmikroskop zeigte, daß sie aus einer Anhäufung von mehr oder weniger reifen Partikeln bestehen (Med. Klinik Nr.36 [1962], 1547-1550).

Kleber hatte eine etwa 3 Tage alte Hefekultur beobachtet und in vielen Zellen ein bis vier kreisrunde Körperchen erkannt, die in Form, Größe und Lagerung völlig den Sarzinen glichen. In älteren Zellen, in denen man vielfach nur noch einen ganz dünnen Plasmabelag sehen konnte, war die Vakuole oft ganz mit solchen kokkenartigen Gebilden vollgestopft. Den Beweis, daß es sich um selbständige lebensfähige zelluläre Gebilde handele, konnte Kleber nicht erbringen, weil er kein Nährmedium fand, auf dem die Gebilde entwicklungsfähig gewesen wären. Er hielt es für wahrscheinlich, daß es sich bei den Biersarzinen um als alternden und in Auflösung begriffenen Hefezellen entstandene Organismen handele (Brauwissenschaft H. 7, Juli 1953, S. 107-114). Schon Schanderl hatte „Über die natürliche und künstliche Verwandlung von Schimmelpilzen und Hefen in Bakterien" berichtet und die sich im Innern der Hefezelle hin und her bewegenden kokkenförmigen Gebilde für Mitochondrien gehalten (Mikroskopie 6 [1951 ],

S. 146). Er hatte, wie auch schon Baltatu (Z. Bact. Il Bd. 101 [1939], S. 196), beobachtet, daß sich die ausgetretenen „Granula" zu selbständiger Entwicklung ablösen.

Die Rolle von Bakterien und mikrobieller Stoffwechselreaktionen bei der Entstehung von Tumoren, beispielsweise die Bildung von Carcinogenen aus Metaboliten der Gallensäuren durch Intestinalbakterien, ist häufig beschrieben worden (M. Knoke, H. Bernhardt, Mikroökologie des Menschen, Akademie Verlag Berlin 1985, WTB Band 220; J. Jeljaszewicz et. al." Bacteria and Cancer, Academic Press, London 1982; S. M. Finegold, Anaerobic Bacteria in Human Disease, Akademie Press, New York 1977, S. 587).

Eine seit langem bekannte Tatsache ist ferner die Gegenwart von Bakterien in Tumorgeweben. So weisen F. B. Seibert et al. darauf hin, daß vielerorts das Vorkommen von Bakterien in Tumoren beschrieben worden sei und daß sie selbst aus Gewebeproben und aus dem Blut von Krebspatienten Bakterien isoliert hätten (Bacteria in Tumors, Transactions of the New York Academy of Sciences, Ser. II, Vol.34,1972, S. 504-533). Auch die Auflösung von Blutzellen krebskranker Personen und die Isolierung der Zellinhaltsteile ist beschrieben worden (E.Schubert und G. Müller, Zschr. inn. Med. 15 [1960] Heft 13, S. 636, VEB Georg Thieme, Leipzig, S. 1-5). In der genannten Veröffentlichung von Seibert et al. wird weiterhin berichtet, daß Bakterien innerhalb des Tumorzellcytoplasmas und auch des Kerns beobachtet worden seien und deshalb ein Angriff von Bakterien auf die Chromosomen zur Erklärung des Geschehens in der transformierten Zelle zu erörtern wäre (a.a.O., S. 529-531). Über das Wesen und die Funktion der Mitochondrien des Zellplasmas und über die Endosymbionten-Hypothese ist nach H. Kleinig und P. Sitte (Zellbiologie, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1984, S. 269ff., 435ff.) folgendes bekannt: Mitochondrien sind meist längliche Organelle in der Größenordnung von 0,2-bis 1 pm mal 2 bis 8 pm, entsprechen also der Größe von Bakterien. Die äußere Mitochondrienmembran enthält ein porenbildendes Protein (mitochondriales Porin), das durch Proteasen kaum angreifbar ist und Ähnlichkeiten mit den bakteriellen Porinen in der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien besitzt. Die innere Membran ist durch insgesamt weniger Phospholipid, durch das Vorkommen von Cardiolipin — einem Phospholipid, das sonst nur noch in Bakterien zu finden ist—und durch das Fehlen von Cholesterol gekennzeichnet. Mitochondrien besitzen ein eigenes Genom, das die genetische Information für die mitochondrialen RNAs und für einige Proteine trägt. Deshalb werden Mitochondrien auch als semiautonome Organelle bezeichnet. Neben dem eigenen Genom hat man auch Prozesse der Replikation, Transkription und Translation in Mitochondrien gefunden. Schließlich sind die Mitochondrien auch am Ca⁺⁺-Haushalt der Zelle beteiligt. Bei Zellvermehrung tritt auch Mitochondrienvermehrung ein (durch Zweiteilung). Für die Mitochondrien wurde postuliert, daß sie in der Zelle nicht de novo entstehen können. 1890 formulierte R. Altmann die Endosymbionten-Hypothese in allgemeiner Form. Das wesentliche Postulat dieser Hypothese ist, daß die autoreduplikativen Plastiden und Mitochondrien Abkömmlinge ehemals freilebender Einzeller sind, die auf einer früheren Evolutionsstufe als Cytosymbionten in den Zellverband eingeschleust und nach und nach zu Organellen „domestiziert" worden sind. 1970 wurde die Endosymbionten-Hypothese von L. Margulis neu formuliert. Als phyletische Vorläufer der Plastiden galten dabei Cyanobakterien, während die Mitochondrien von aeroben Bakterien abstammen sollen. Die Eingliederung der später zu Organellen evoluierten prokaryotischen Cytosymbionten soll in einer einer sehr frühen Stufe der Zellevolution erfolgt sein. Die wesentlichen Argumente zugunsten der Endosymbionten-Hypothese sind:

— Cytosymbiosen sind bei rezenten Organismen nicht selten.

— Mitochondrien und Plastiden sind innerhalb des Eucyten ständig von einem nichtplasmatischen Kompartiment umgeben. Diese Situation entspricht der bei rezenten Cytosymbiosen, in denen der Symbiont innerhalb der Wirtzelle gewöhnlich ebenfalls von zwei nichtfusionierenden Membranen umgeben ist, deren innere der Plasmamembran des Symbionten entspricht, während die äußere von der Plasmamembran der Wirtzelle abstammt.

— Dementsprechend sind die inneren Membranen der Mitochondrien und Plastiden anders zusammengesetzt als typische Eucytenmembranen (Cardiolipin-Gehalt wie bei Bakterien).

— Das genetische System der Plastiden und Mitochondrien weicht stark vom nucleocytoplasmatischen der Eukaryoten ab und weist viele Bezüge zum prokaryotischen auf.

— Die Atmung der Prokaryoten ist im Prinzip der mitochondrialen sehr ähnlich (S.293).

— Die rRNAs der Plastoribosomen sind nächstverwandt den rRNAs von Cyanobakterien, jene der Mitochondrien in der phyletischen Nachbarschaft phototropher Bakterien (Sequenzvergleich).

Alle diese Befunde können durch die Endosymbionten-Hypothese zwanglos erklärt werden. Allerdings gibt es auch einige Fakten, die ihr widersprechen. Unter ihnen wiegt die Tatsache am schwersten, daß die Organelle nur einen kleinen Teil ihrer Proteine selbst herstellen können.

Wörtlich schreiben H.Kleinig und P.Sitte (a.a.O., S.436f.): „Mitochondrien und Plastiden besitzen innerhalb des Eucyten also nur begrenzte Autonomie, sie sind ,semi-autonom'. Die Hoffnung, diese Organelle außerhalb der Zelle in künstlichen Nährmedien vermehren und damit die Endosymbionten-Hypothesen etwa direkt verifizieren zu können, ist irreal."

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, Metachondrien aus transformierten Zellen zu isolieren und anhand ihres Auftretens der medizinischen Praxis eine Methode zur Erkennung von Tumormarkem zu Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung und Züchtung eines neuen Objektes, das in transformierten Zellen entsteht, zu entwickeln und das neue Objekt in der Tumordiagnostik zu verwenden. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Zellsuspensionen, die Tumorzellen enthalten, mit Lösungsmitteln behandelt und in ein Nährmedium gebracht werden. Diese Lösung wird unter sterilen Bedingungen belüftet und bebrütet. Das Nährmedium, in das die Zellsuspensionen gebracht werden, besteht aus einem Fleischwasser-Lactose-Glucose-Gemisch. Aus der bebrüteten und belüfteten Lösung werden Farbpräparate nach GRAM angefertigt. In ihnen läßt sich der Prozeß des Auflösens der Zelle und das Heraustreten der Metachondrien unter dem Mikroskop beobachten. Ihre Vermehrung gelingt in dem angegebenen Nährmedium.

In der transformierten Zelle, d.h. in Tumorzellen menschlicher und tierischer Herkunft sowie in überalterten Hefezellen, vollzieht sich die Umwandlung der Mitochondrien von semiautonomen in autonome Gebilde. Die derart entstandenen veränderten Zellinhaltsteile, aus Mitochondrien hervorgegangenen, nennen wir Metachondrien (meta—das der Verändern ng unterliegende, chondros — das Korn).

Da diese Gebilde alle Forderungen an eine Eigenständigkeit aufweisen, liegt der Schluß nahe, die Endosymbionten-Hypothese bewiesen zu haben. Diese Metachondrien verhalten sich, als hätten sie — derzeit als Funktionsglied in der Zelle, aber in der Evolution als domestizierte Bakterien in den Dienst der Zelle gestellt — ihre Eigenständigkeit zurückgewonnen (reevoluierte Mitochondrien).

Ein Name für die neuen Gebilde macht sich deshalb erforderlich, weil sie sich innerhalb des Cytoplasmas bilden. Sie sind eigentlich „veränderte Mitochondrien", die ihre Eigenständigkeit erreichen und nach dem Austritt aus der Zelle als Bakterien (Kokken) auftreten. Da aber der Satz gilt: „Die Zelle wird als kleinste lebens- und vermehrungsfähige Einheit, als Elementarorganismus, aufgefaßt" (H. Kleinig und P. Sitte, Zellbiologie, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1984, S.3), sind bislang eigenständige Prokaryoten innerhalb einer Zelle nicht denkbar. Demnach sind die Metachondrien bis zu ihrem Austritt aus der Zelle wirklich Zellinhaltsteile, veränderte Organelle. Die Feststellung, Organelle außerhalb der Zelle in künstlichen Nährmedien vermehren und damit die Endosymbionten-Hypothese verifizieren zu können, sei irreal (H. Kleinig und P.Sitte, a.a.O.,S.436f.), bleibt insofern unangetastet, als es sich bei den Metachondrien um „veränderte" Organelle handelt. Auch Seibert et al. hatten Bakterien in Tumorzellen beobachtet, auch innerhalb des Cytoplasmas. Sie hielten sie jedoch für Eindringlinge, die die Zellwand passiert haben müssen (Bacteria in Tumors, Transactions of the New York Academy of Sciences, Ser. II, Vol. 34 [1972], S. 529). Daß die wiederholt beschriebene Anwesenheit von Bakterien in Tumoren bisher wenig Aufmerksamkeit erregt hat, führen sie auf eine von Seiten der Fachwelt vermutete Sekundär-Infektion zurück (a. a. 0., S. 524). Die Annahme der Bildung von Metachondrien aus Mitochondrien in der transformierten Zelle steht mit der Endosymbionten-Hypothese durchaus im Einklang. Auch verdient die Tatsache Erwähnung, daß die Tumorzelle eine verminderte Zahl von Mitochondrien besitzt (S. M. Rapoport, Medizinische Biochemie, VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1983, S.718). Da weder die Mutationstheorie noch die Gentheorie für die Bildung und Entwicklung von Tumorzellen zufriedenstellende Ergebnisse geliefert haben, steht nunmehr eine Reevolutionstheorie der Mitochondrien, nach der sich eine somatische Zelle zur Tumorzelle entwickelt, zur Diskussion.

Was von der Tumorzelle gesagt ist, läßt sich auch auf gealterte und in diesem Sinn transformierte Hefezellen übertragen. Die von Kleber und anderen in derartigen Hefezellen beobachteten kokkenförmigen Gebilde sind demnach „veränderte Mitochondrien", die schließlich ihre Eigenständigkeit erreichen und als Pediokokken auftreten.

Eine Arbeit von Gordienko (Sonderdruck: Kunststoffe 39, H. 2) gab Anlaß, Versuche mit Zellsuspensionen und Lösungsmitteln anzustellen und das Quellverhalten von Normal- und von Tumorzellen zu beobachten:

Unter sterilen Bedingungen wird eine Zellsuspension mit organischen Lösungsmitteln, wie Dioxan, Aceton, Methanol oder Ethnaol sowie mit einem Indikator versetzt. Derart vorbereitete Proben werden in ein Lactoseboullion-Glücose-Gemisch (Nährmedium) gebracht und unter sterilen Bedingungen belüftet (Luft mit 4,3% CO2 und 10,5% O2) und bebrütet. Aus den daraus bereiteten Farbpräparaten nach GRAM wird, wenn die Zellsuspension Tumormarker enthielt, der Prozeß des Auf lösens der Zelle und das Heraustreten von Metachondrien beobachtet. Bei Proben, z. B. Blutproben, von gesunden oder anders kranken Personen ist es nicht möglich, diesen Prozeß zu wiederholen und einen Stoffwechsel und ein Wachstum zu erreichen. Die Stoffwechseluntersuchungen von den Proben aus Lösungsmittel und Zellsuspension zeigen bei transformierten Zellen eine Gärung und keine Atmung, wohingegen aus den Proben, die das Nährmedium enthalten, nach der Belüftung eine intensive Atmung auftritt. Durch die Veränderung der Mitochondrien wird als erstes die Atmung (Atmungsenzyme) aktiviert. Bei der weiteren Umstellung beginnt die Gärung sich zu entwickeln. Es vollzieht sich der Übergang vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel (E. Schubert und G. Müller, Zsch. inn. Med. 15 [1960], H. 13, S. 636,1-5). Je mehr der Stoffwechsel CO₂ abspaltet, um so mehr wird das Wachstum der Metachondrien angeregt. Gärungsstoffwechsel ließ sich nach Belüftung nicht oder nur ganz schwach nachweisen. Es ist auffallend, daß bei den Proben von Krebskranken die Isolierung und Züchtung von Metachondrien durchgeführt werden kann. Sie zeigen einen Gärungs- und Atmungsstoffwechsel, wie bei bestimmten Prokaryoten. Bei den Metachondrien tritt außer der Glykolyse eine dritte energieliefernde Reaktion ohne NAD auf, die für die bioenergetischen Prozesse der Zelle von Wichtigkeit ist. (E.Schubert ...,a.a.O.). Die energieliefernde anoxygene Reaktion ohne NAD ist bioenergetisch bemerkenswert: NAD ist in der Reaktionskette des enzymatischen Zuckerabbaues, dem Hauptenergieprozeß der Zellen, so wesentlich, weil es als dehydrierendes Coferment fungiert, ohne dessen elektronenübertragende Tätigkeit kein Katabolismus und damit auch kein Spaltungsstoffwechsel vorstellbar ist.

Nach WINDISCH ist die Vermehrung und die Phosphataufnahme bei den mycetischen Gärungszellen an O2 gebunden. Ihr anaerobes Wachstum und ihre Fähigkeit, einen anaeroben Phosphatwechsel über die Zellmembran aufrecht zu erhalten, läßt sich nur mit dem Vorhandensein eines anoxygenen Energiepotentials erklären (Biol. ZbI.4 [1958], 479).

Durch die Metachondrien ist der Sauerstoff für den dritten Abbauweg verantwortlich. Ohne den Sauerstoff geht der Abbau der Brenztraubensäure nicht bis zum Diacetyl. Für die Entwicklung der Metachondrien ist die Kohlensäure von Bedeutung. Wir fanden bei den ersten Untersuchungen eine Gärung; in den Metachondrien ist bis dahin noch kein ATP abgebaut worden. Nach Belüftung mit steriler atmosphärischer Luft wird der energiereiche Phosphatvorrat der Metachondrien verbraucht und die Atmung in Gang gesetzt.

Nach WEINFÜRTNER ergab sich, daß die Pediokokken relativ sauerstoff-tolerant sind. Sogar Sauerstoff-Konzentrationen von 8000 Gamma O₂/l, wie sie durch Dauerbegasung mit reiner Luft in einem Medium erhalten werden, wirken noch nicht absolut vermehrungssistiierend. Der wichtigste Punkt ist, daß die Pediokokken unbedingt CO₂ zur Vermehrung benötigten. Dabei genügen sogar so niedrige C0₂-Konzentrationen, wie sie durch die Luft in das Medium gelangen (Brauwissenschaft 8 [1955] S. 195).

Durch Oxydation des Acetoins entsteht Diacetyl. Für den Abbau der Brenztraubensäure über Acetaldehyd und Acetoin zum Diacetyl ist unbedingt Sauerstoff erforderlich. Ist dieser Sauerstoff nicht vorhanden, geht der Abbau nurbis zum Acetoin. Beiden Stoffwechseluntersuchungen wurde festgestellt, daß die größte Ausbeute von Diacetyl bei Anwesenheit von Sauerstoff erreicht wird.

Die Metachondrien bilden auch Milchsäure. Die Proben nach der Belüftung zeigen, daß anstelle des Gärungs- ein Atmungsstoffwechsel einsetzt und das Wachstum der Metachondrien im Nährmedium beginnt.

Durch den Abbau ATP-ADP und anorganisches Phosphat in den Metachondrien und im Plasma wird der jeweilige Stoffwechsel in Gang gesetzt. Das sind jene Momente, die das Wachstum der Metachondrien bestimmen können. Die Beschleunigung und Förderung des Wachstums der Metachondrien ist abhängig von dem angebotenen Nährboden bzw. von den Wachstumsstoffen.

Mikroaufnahmen der Metachondrien

Metachondrien der Tumorzellen eines Karzinoms am oberen Gaumendach

Metachondrien der Tumorzellen eines Magen-Karzinoms

Abb. 3:

Metachondrien der Tumorzelle eines Lungen-Karzinoms

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Folgende Patienten wurden untersucht:

Krebsfälle

Anzahl

Gesamt

Mangan-Ca,

Darm-Ca.

Ascites-Tm.

Lungen-Ca.

Ca. Ii. Oberkiefer

Portio-Ca.

Vulva-Ca.

Vulva-Sarkom

Scheiden-Ca.

Andere Krankheitsfälle

Myodegeneratio cordis

Myokardinsuffizienz

Mitralvitium-Hypertonie

Myokardschaden,)

pernic. Anaemie)

Gastritis

Chron. Gastritis

Chron. Cholecystitis u.)

Cholangitis)

fieberhafte Tonsilitis

Tbc.-pulmonum

Pyelitis

Parametritis

Ischias

Klinisch Gesunde

1 1 2 1 1

37

21

1 1 1 8

11

6 δ 5 1 1 10

27

58 2δ

Stoffwechsel der Metachondrien

2 GI-L₃-C-C

EAD-IL

on

NAD

oh:

Brenztraubensäure

Milchsäure

Citronensäurecyklus

- CO,

CH₃-C;

"II

ΈΤ

C-ClI

Acetaldehyd

CE.-CH-CC-Cil-³ I ³

OH

Acetoin.

CH₀-CO-CO-GIL J 3

Diacetyl

Die Metachondrien, die neu gebildet werden, werden nicht durch eine Mitoserhythmik der Zellklonierung weitergegeben, vielmehr verhalten sie sich beim Verlassen der Zelle wie selbständige Organismen.

Die Beziehung zwischen Tumorzelle und Metachondrien ist bioenergetischer Natur, die der Stoffwechselbildung und -wirkung enzymgenetischer Art.

Erst wenn durch den Stoffwechsel und den Einfluß der Zelle sowie der Zellumgebung die Funktionen derZellemitden Metachondrien permanent werden, entsteht das Malignitätskriterium der Zelle. Das Tumorwachstum setzt ständig einen Anteil Metachondrien voraus, die den Anfangsgrad für das Wachstum darstellen.

Die Energiegewinnung zur Vermehrung der Metachondrien erfolgt aus dem dritten Abbauweg ohne NAD mit der Abspaltung von Kohlensäure. Der dritte Abbauweg ohne NAD und die dabei gebildeten Stoffwechselprodukte der Metachondrien sind der Weg zur Bildung der Krebszelle. Es ist eine der nichtausdifferenzierten Zellen innewohnende Eigenschaft, unbeschränkt wachsen zu können, was durch den Stoffwechselvorteil der Metachondrien (reevoluierten Mitochondrien) gegeben ist.

Nach den heutigen Erkenntnissen über das Krebsgeschehen sind die Besonderheiten nicht bei den chemischen Elementen oder bei den anorganischen oder organischen Bestandteilen der Zelle oder bei dem Erhaltungsstoffwechsel zu suchen, sondern im übergeordneten Stoffwechsel.

Ein großer Kohlehydratverbrauch derTumorzelleistfürden Aufbau, die Entwicklung und den Stoffwechsel der Metachondrien erforderlich. Ihre ausgeprägte Wachstumstendenz betrifft nicht nur die Synthese von Kern- und Plasmabausteinen, sondern den Aufbau von neuen Organismen mit dem dazugehörigen Stoffwechsel (Reevoluierung der Mitochondrien).

Nach BAZALA (a.a.O.) verlieren die Zellen die Fähigkeit, ihren Sauerstoffgehalt auf normale Weise zu decken. Demnach kommt es zu Gärungsprozessen, den Vorstufen zur Entstehung von Tumorzellen. Unter bestimmten Bedingungen laufen diese Prozesse so intensiv, daß der gesamte Energiebedarf der Zelle aus Gärungsprozessen gedeckt wird. WARBURG entdeckte innerhalb des Tumorstoffwechsels eine verstärkte Glykolyse und eine verringerte Atmung, die er als den Kernpunkt des autonomen und das Umfeld zerstörenden Wachstums bezeichnete.

Demgegenüber stellten wir fest, daß eine Verringerung der Atmung nicht stattfindet, sondern der dritte Abbauweg eine erhöhte Gärung vortäuscht.

Bei der Tumorzelle ist der Gesamtumsatz an Kohlehydraten viel größer als bei der normalen Zelle. Auch bei Anwesenheit von Sauerstoff, das zeigen die Belüftungsversuche mit der Kompressorluft (4,3% CO₂ und 10,5% O₂), spaltet die Tumorzelle eine größere Menge Kohlehydrate im Milchsäure und Diacetyl, denn durch eine derartige Belüftung sind fakultiv anaerobe Verhältnisse geschaffen worden.

Die Atmung der Prokaryoten ist im Prinzip der mitochondrialen sehr ähnlich. Die Plasmamembran ist Sitz der Redox-Kette und ATP-Synthese. Die Protonen werden in den Raum zwischen Plasmamembran und Zellwand abgegeben. Die innere Membran muß das Cytoplasma der Mitochondrien bilden.

Die neugebildeten und isolierten Metachondrien sind in der Lage, sich wie selbständige Zellen zu verhalten, d. h., sie reagieren auf Reize, vollbringen Stoffwechselleistungen und pflanzen sich fort.

Als Ursache der Erhöhung der Desoxyribonuclei'nsäure in den Tumoren darf die Zellvermehrung des Gewebes angesprochen werden. Die Zunahme der Desoxyribonucleinsäure beruht nicht auf einer Zunahme der Zellen, sondern auf einer Veränderung von Mitochondrien in der Zelle.

Bei Bereitstellung einer größeren Menge Kohlensäure werden die Metachondrien in ihrer Entwicklung gefördert. Ist aber ein Überschuß von Sauerstoff vorhanden, so wird aus dem vorhandenen Acetaldehyd über Acetoin Diacetyl gebildet. Die Metachondrien entwickeln sich unter diesen Bedingungen zu selbständigen Organismen aus.

Das Leben, das Wachstum und die physiologischen Funktionen der Metachondrien gehen mit dem Stoffwechsel und den physiologischen Funktionen der Körperzelle überein. Für die Metachondrien ist das Zusammenleben mit den Zellen notwendig, da sie einige Wuchsstoffe nicht synthetisieren können, wie Thiamin und Riboflavin. Solange Brenztraubensäure durch die Körperzelle zu Acetaldehyd decarboxyliertwird, können die Metachondrien den bereits gebildeten Acetaldehyd zur weiteren Umwandlung in Ci-Verbindungen verwenden.

Das Wachstum der Metachondrien hängt von der Art des aktiven Stoffwechsels der Körperzelle ab. Es ist um so schwächer, je aktiver der Stoffwechsel ist. Je älter die Zelle wird und je weniger aktiv ihr Stoffwechsel ist, umso günstiger ist die Entwicklung der Metachondrien. Die Zellen entnehmen dem Medium stufenweise Stoffe, die für die Entwicklung der Metachondrien wichtig sind. Diese Stoffe sind von den Zellen verbraucht worden und lassen sich für das Leben der Metachon'drien in geeigneter Form aus den Zellen auslaugen.

Die Stoffe, die von der Zelle nicht abgebaut werden können, sind für die Metachondrien von Bedeutung, wenn die richtige Diffusionsgeschwindigkeit vorhanden ist. Die Körperzelle muß durch ihren Stoffwechsel die Stoffe für die Entwicklung und das Wachstum der Metachondrien vorbereiten. Das Medium, welches neben auslaugbaren Enzymen weitere in der Körperflüssigkeit lösliche Stoffe enthält, zeigt sich günstig für ihre Vermehrungsfähigkeit. Aufgrund der Desmolyse der Körperzelle werden ihnen Nährstoffe für die Ernährung geboten, die leicht diffundibel für sie sind.

Es hat den Anschein, daß das Leben der Metachondrien bis zu einem gewissen Grade von der Art des Stoffwechsels abhängt und zwar so, daß das Wachstum umso schwächer wird, je höher der Stoffwechsel im Medium ist.

Mitzunehmendem Grad der Autolyse werden das Wachstum, die Funktion und die Produktion derC₄-Verbindungen beiden Metachondrien gesteigert. Diese umgebildeten Körperzellen haben ein schnelleres, unkontrolliertes Wachstum.

Die Stimulation des Diacetylaufbaues hängt ab von der Aktivität des Stoffwechsels, der Anwesenheit von Wasserstoffakzeptoren sowie von Stoffen, die die Vermehrung der Metachondrien stimulieren. Die Vermehrungsenergie der Zelle steht im umgekehrten Verhältnis zur Konzentration der Diacetyllösung.

Nach KOCKOVA beeinträchtigt das Diacetyl das Wachstum und die Vermehrung der Zellen und beeinflußt ihren physiologischen Zustand. Die desinfizierende Wirkung von Diacetyl auf Körperzellen ist erheblich und ist mit einer konzentrierten Phenollösung zu vergleichen. Durch den Einfluß von Luftsauerstoff erhöht sich die Produktion von Diacetyl. Luftsauerstoff wirkt als Wasserstoffakzeptor bei den Oxydoreduktionsprozessen und unterstützt dadurch die Bildung von Diacetyl (Brauwissenschaft 9 [1956], S.73).

Gesunde Körperzellen haben während der Dauer ihrer intensiven, physiologischen Tätigkeit eine negative Ladung an der Oberfläche, das gleiche gilt für die Krebszelle. Setzt man voraus, daß die Metachondrien wie die Pediokokken (Kockova a. a. 0.) an der Oberfläche eine entgegengesetzte Ladung haben, setzen sie die negative Ladung an der Oberfläche der Zellen herab und fördern deren Agglutination.

Alle Befunde zeigen, daß die Metachondrien und Pediokokken transformierter Zellen direkt in der Zelle entstehen, ohne Infektion von außen. Die Auswirkungen dieser hier festgestellten metabolischen Differenzen zwischen Metachondrien und normalen und malignen Zellen für das biologische Verhalten der ganzen Zellen und die Deutung dieser Erscheinung für die Malignität lassen sich noch nicht abschätzen.

Ausführungsbeispiele

1. Allgemeine Vorschrift

Unter sterilen Bedingungen wird eine Zellsuspension mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dioxan oder Aceton sowie einem Indikator versetzt. Derart vorbereitete Proben werden in ein Fleischwasser-Lactose-Glucose-Gemisch gebracht und unter sterilen Bedingungen belüftet und bebrütet. Aus den daraus bereiteten Farbpräparaten nach GRAM wird der Prozeß des Auflösens der Zelle und des Heraustretens der Metachondrien beobachtet, wenn die Zellsuspension Tumormarker enthielt.

2. Blutuntersuchungen

Unter sterilen Bedingungen wird 1 ml Lösungsmittel und Blut in ein steriles Röhrchen mit 1OmI steriler Lactoseboullion und Glucose gebracht. Diese Röhrchen werden mit steriler atmosphärischer Luft 48 Stunden lang bei 37 Grad C belüftet. Die Kompressorluft enthält je 100 cm³ Luft 4,3 cm³ CO₂ und 10,5cm³ O₂. Bei jedem Ansatz wird eine Sterilitätsprobe mitdurchgeführt. Ebenfalls werden von diesen Proben Farbpräparate nach GRAM hergestellt. GJeichzeitig werden Stoffwechseluntersuchungen durchgeführt. Bei dem Blut von Krebskranken stellt sich nach kurzer Zeit der Belüftung eine Trübung ein, bei Proben von gesunden Personen dagegen nicht. Nach dieser Belüftung und Bebrütung werden Farbpräparate nach GRAM von den einzelnen Proben angefertigt und gleichzeitig Stoffwechseluntersuchungen durchgeführt. Bei den Farbpräparaten aus den trüben Proben von krebskranken Patienten kann man den Prozeß des Auflösens der Zellen und das Heraustreten der Metachondrien unter dem Mikroskop beobachten. Bei Proben von gesunden oder anders kranken Personen ist es nicht möglich, diesen Prozeß zu wiederholen und einen Stoffwechsel und ein Wachstum zu erreichen.

3. Milchsäurebestimmung

Bei 15 Krebsfällen lag der Milchsäuregehalt zwischen 0,607 und 0,964mg in 5 ml Blut oder zwischen 0,07 und 0,12%. Bei 23 Gesunden und Anderskranken lagen die Werte zwischen 0,450 mg und 0,977 mg bzw. 0,05 und 0,12 %. Der Vergleich zwischen 12 Ca-Fällen und Anderskranken zeigte folgendes Bild:

Ca-Fälle . Durchschnittlich 0,545mg und 0,06%

Anderskranke Durchschnittlich 0,359 mg und 0,04%

Beispiel 4: Tumorgewebe -

Steril entnommene Tumorgewebe werden in eine sterile physiologische Kochsalzlösung gebracht und bei 37⁰C zwei Wochen lang aufbewahrt. Dann wird ein Ausstrich der Extraktionslösung auf Blutnähragar bei 37⁰C bebrütet. Nach 24 Stunden lassen sich Bakterien feststellen.

Zur Kontrolle wurden sowohl von der Kochsalzlösung als auch von dem verwendeten Nährboden Sterilitätsproben angelegt.

Weiterhin wurden zur Überprüfung der Arbeitsweise der Tumorentnahme normale Gewebe gesunder Tiere in der gleichen Weise behandelt. In diesen Fällen wurden keine Bakterien beobachtet.

Folgende in der Tabelle aufgeführte Tumoren wurden untersucht:

Tumor

Chondrom Dimethyl-Carcinom Dimethyl-Sarcom Ehrlich-Carcinom FGS

FSD

Jensen-Sarcom Leber-Carcinom Plasmocytom

Sarcom I Sarcom Il

Walker-Carcinom Yoshida-Sarcom

Anzahl der untersuchten	Ergebnis
Tumoren
1	1 Tumor Kokken
4	4Tumoren Kokken
1	1 Tumor negativ
2	2Tumoren Kokken
4	3Tumoren Kokken -
	1 Tumor negativ
1	1 Tumor Kokken
2	2Tumoren Kokken
2	2Tumoren Kokken
4	1 Tumor Kokken
	2Tumoren Stäbchen
	1 Tumor negativ
1	1 Tumor negativ
4	1 Tumor Kokken
	3Tumoren negativ
19	16Tumoren Kokken
	2Tumoren Stäbchen
	1 Tumor negativ
4	4Tumoren Kokken

Claims (3)

1. Verfahren zur Gewinnung und Züchtung von Metachondrien, dadurch gekennzeichnet, daß Suspensionen transformierter Zellen mit Lösungsmitteln behandelt, in ein Nährmedium gegeben und unter sterilen Bedingungen belüftet und bebrütet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium aus einem Fleischwasser-Lactose-Glucose-Gemisch besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel wasserlösliche organische Lösungsmittel, wie Ethanol, Methanol, Dioxan oder Aceton und anorganische Lösungen, wie physiologische Kochsalzlösung, Verwendung finden.