DD252547A1

DD252547A1 - Selektives adsorbens zur bindung von lipoproteinen niedrieger dichte

Info

Publication number: DD252547A1
Application number: DD29424186A
Authority: DD
Inventors: Fritz Loth; Erasmus Behm; Dagmar Toewe; Horst Klinkmann; Bruno Ernst; Dieter Bertram
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-09-09
Filing date: 1986-09-09
Publication date: 1987-12-23

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Adsorbens fuer die selektive Entfernung von Lipoproteinen niedriger Dichte aus Blutplasma. Das Adsorbens soll eine hohe Adsorptionskapazitaet und Selektivitaet aufweisen, leicht verfuegbar kostenguenstig, sterilisierbar, regenerierbar und blutvertraeglich sowie in Suspension oder als Saeulenpackung einsetzbar sein. Erfindungsgemaess besteht das selektive Adsorbens aus perlfoermiger unmodifizierter Regeneratcellulose, die ein Gesamtporenvolumen von mindestens 2 cm3/g aufweist, wobei der Anteil an zugaenglichen Makroporen mit einem Eingangsquerschnitt von 20 bis 2 000 nm mindestens 10% des Gesamtporenvolumens betraegt. Die Anwendungsmoeglichkeiten der Erfindung liegen auf dem Gebiet der Medizin und Medizintechnik.

Description

eines unpolaren, die Cellulose nicht quellenden Lösungsmittels definiert, der nach Verdrängung des Wassers aus der feuchten Perlcellulose und Abschleudern des anhaftenden Lösungsmittels im Hohlraumsystem der Cellulose zurückgehalten wird. Der Anteil an zugänglichen Makroporen mit einem bestimmten Eingangsquerschnitt ergibt sich aus der Penetrierbarkeit von Quecksilber bei vorgegebenem Druck.

Es wurde festgestellt, daß bei bestimmten Regeneratcellulosen wie der erfindungsgemäß vorgeschlagenen chemisch unmodifizierten Perlcellulose in starkem Maße eine Bindung von LDL auftritt. Wesentliche Voraussetzung für diese Bindung der LDL ist, daß die in der Cellulosematrix befindlichen Makroporen auch zugänglich sind, d. h. einen bestimmten Mindesteingangsquerschnitt aufweisen. Überraschend hierbei ist jedoch, daß die wesentlich kleineren HDL und auch andere im Plasma vorhandene Proteine, die bei den erfindungsgemäßen Adsorbentien ebenfalls in stärkerem Maße in die Cellulosematrix eindringen können, nicht gebunden werden. Damit eine ausreichende Bindungskapazität für LDL erzielt wird, soll der Anteil an zugänglichen Makroporen einen Wert von 0,2cm³/g nicht unterschreiten. Höhere Werte begünstigen die Bindung und sollen erfindungsgemäß nach oben nicht begrenzt werden. Allerdings ergeben sich sowohl für das Gesamtporenvolumen als auch den Anteil an zugänglichen Makroporen gewisse Grenzwerte, die durch das Herstellungsverfahren und die Neigung der Cellulose zur Ausbildung kompakter übermolekularer Strukturen bedingt sind. Außerdem wird bei einem Gesamtporenvolumen > 5cm³/g die Perlcellulose zunehmend mechanisch instabiler, so daß der Einsatz solcher Produkte als Suspension zwar noch geeignet in Säulen aber nur bedingt möglich ist.

Die Teilchengröße der erfindüngsgemäßen Perlcelluloseprodukte kann im Bereich von 0,1 bis 3 mm liegen, wobei jedoch die Teilchengrößenfraktion von 0,1 bis 0,3 mm bevorzugt wird.

Zur Entfernung der LDL aus dem Blutplasma können die genannten Adsorbentien direkt im Plasma suspendiert oder als Packung in einer Säule angewendet werden, durch die das Plasma hindurchgepumpt wird.

In beiden Fällen wird die wasserfeuchte Ausgangsperlcellulose mit den geforderten Porositätswerten zunächst mit 0,15 M NaCI-Lösung oder mit phosphatgepufferter NaCI-Lösung (PBS) gewaschen und überschüssige Flüssigkeit, z. B. durch Zentrifugieren, wieder weitgehend entfernt. Dann bringt man die feuchte Perlcellulose mit dem lipoproteinhaltigen Plasma in Kontakt. Das kann in einfacher Weise so erfolgen, daß man die Perlcellulose im Plasma suspendiert und unter leichtem Schütteln 10 bis 120 min beispielsweise bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert. Dieses Verfahren findet vor allem bei analytischen und präpa rativen Arbeiten im klinischen La bor Anwendung, da auf diese Weise z. B. durch hohe Lipoproteingehalte getrübte Plasmen für analytische Untersuchungen geklärt oder LDL auch präparativ gewonnen werden können.

Für die Behandlung von Patienten mit familiärer Hypercholesterolämie wird die mit PBS vorbehandelte Perlcellulose in eine Säule oder auch andersartig gestaltete Vorrichtung gefüllt, die über einen Zu- und einen Ablauf verfügt, welche mit plasmadurchlässigen Membranen verschlossen sind. Das Plasma wird dann durch die Perlcellulosepackung gepumpt, wobei die Fließgeschwindigkeit vorzugsweise 5 bis 50 ml/min betragen soll. Die für eine ausreichende Bindung LDL benötigte Menge Adsorbens beträgtfür 11 Plasma etwa 200 bis 500g feuchte Perlcellulose.

Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Adsorbens besteht darin, daß es regenerierbar und damit mehrfach verwendungsfähig ist. Die Regenerierung kann in einfacher Weise durch aufeinanderfolgende Behandlung der mit LDL und Plasmaresten beladenen Perlcellulose mit 0,1 M Glycin-HCI-Puffer (pH2,8), 5 bis 6M Harnstofflösung und PBS erfolgen. Die regenerierten Produkte haben praktisch die gleiche Adsorptionskapazität wie beim erstmaligen Einsatz.

In den folgenden Beispielen sollen die erfindungsgemäßen Adsorbentien und ihre Anwendung näher beschrieben werden.

Beispiel 1

Wasserfeuchte Perlcellulose mit einem nach Verdrängung des Wassers durch Ethanol und Cyclohexan und Abschleudern auf einer Fritte bestimmten Cyclohexanrückhaltevermögen von 2,8g/g Cellulose, entsprechend einem Gesamtporenvolumen von 3,59cm³/g, und einem quecksilberporosimetrisch bestimmten Porenvolumen von 0,38cm³/g für Poren mit einem Eintrittsquerschnitt von 20 bis 2000 nm wird zunächst fünfmal mit der fünffachen Menge phosphatgepufferter 0,15 M NaCI-Lösung (pH!A) gewaschen und anschließend durch Zentrifugation (5min, 10000m/s²) sedimentiert. Nach Abdekantieren des Überstandes wird 1 g des Perlcellulosesedimentes, dessen Teilchengröße 0,15 bis 0,25 mm beträgt, in ein Röhrchen eingewogen und 2 ml eines lipoproteinhaltigen Mischplasmas hinzugegeben. Es folgen Inkubation bei 37°C während 30 min im Schüttelwasserbad, Zentrifugation der Perlcellulose und Analyse des überstehenden Plasmas.

Die Proteinbestimmungen erfolgten mit der üblichen Methode der einfachen radialen Immundiffusion nach MANCINI und Mitarbeiter. Da Mischseren vieler Einzelspender verwendet wurden, d.h. annähernd Werte der Normalbereiche angenommen werden konnten, erschien es ausreichend, die Werte im Serumpool vor und nach Inkubation zu vergleichen und die letztgenannten als Relativwerte der erstgenannten in % anzugeben. In dieser Weise wurden auch die Aproproteine der LDL (/3-Lipoprotein) und HDL (a_rLipoprotein) bestimmt. Die klinisch-chemischen Werte der Lipoproteine wurden nach dem Arzneibuch der DDR, D. L., 1985 bestimmt. LDL-Cholesterol wurde unter der Voraussetzung, daß die Triglyceridwerte im Normbereich liegen nach FRIEDEWALD, W.T., LEVY, R. I., und FREDRICKSON, D.S.: Clin Chem. 18 (1972)409-503 berechnet Zur Ermittlung eines Kontrollbereiches wurden jeweils Albumin, Transferrin, a₂-Makroglobulin und die Immunglobuline A, G und M mitbestimmt, von denen bekannt ist, daß sie nicht selektiv gebunden werden. Eine selektive Bindung wird nur dann angenommen, wenn die Werte einer Substanz des Serums unterhalb des Kontrollbereiches liegen.) Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammenfassend dargestellt (Probe 1/1).

Zum Vergleich wird eine Perlcellulose mit gleicher Teilchengröße aber einem Gesamtporenvolumen von 1,8cm³/g und einem Porenvolumen von 0,15cm³/g für Poren mit einem Eintrittsquerschnitt von 20 bis 2000nm in der vorstehend beschriebenen Weise mit PBS äquilibriert, mit Serum inkubiert und das Serum analysiert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 dargestellt (Probe 0).

Während bei der Probe 0 (Vergleichsprobe) kaum eine durch den Perlcellulosezusatz bedingte Herabsetzung der Werte für /3-Lipoprotein, LDL- und Gesamt-Cholesterol zu verzeichnen ist, tritt bei der Probe 1/1 im Vergleich zur Probe 0 eine deutliche Erniedrigung dieser Werte auf, die auf eine selektive Adsorption der LDL zurückzuführen ist.

Bestimmungen der Komplemerrtaktivitäten, des Fibrinogens und des Plasminogens zeigen keine bemerkenswerten Veränderungen nach Inkubationen von Serum oder Plasma mit Perlcellulose.

Beispiel 2

Analog Beispiel 1 wurde eine Perlcellulose gleicher Teilchengröße aber mit einem Gesamtporenvolumen von 2,5cm³/g und einem Porenvolumen von 0,27cm³/g für Makroporen mit einem Eintrittsquerschnitt von 20 bis 2000 nm (Probe 2) mit PBS vorbehandelt und mit Plasma in Kontakt gebracht. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 dargestellt. Es wurde eine signifikante und selektive Adsorption der LDL erzielt.

Beispiels

Die in Beispiel 1 zur Bindung von LDL bereits verwendete Perlcellulose (Probe 1 /1) wurde zwecks Regenerierung zunächst einmal mit PBS gewaschen, danach dreimal mit jeweils der fünffachen Menge an 0,1 M Glycin-HCI-Puffer (pH 2,8) 15 min bei 37^CC im Schüttelwasserbad behandelt, dreimal in gleicherweise mit 6 M Harnstofflösung inkubiert und schließlich dreimal mit jeweils der zehnfachen PBS-Menge gewaschen.

Die derart regenerierte Perlcellulose (Probe 1/2) wurde analog Beispiel 1.auf ihre LDL-Bindungsfähigkeit getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Nach der Inkubation wurde diese Probe ein weiteres Mal in der beschriebenen Weise regeneriert und mit Plasma in Kontakt gebracht. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 (Probe 1/3) dargestellt.

Sowohl die einmal als auch die zweimal regenerierte Perlcellulose zeigt praktisch die gleiche Lipoproteinadsorptionskapazität wie beim Ersteinsatz.

Beispiel 4 .

Analog Beispiel 1 wird Perlcellulose der Teilchengröße 0,2 bis 0,3 mm mit einem Gesamtporenvolumen von 4,2 cm³/g und einem Porenvolumen von 0,45cm³/g für Poren mit einem Eintrittsquerschnitt von 20 bis 2000 nm (Probe 4/1) mit PBS vorbehandelt. 1 g von diesem Adsorbens wird in eine Säule gefüllt, deren Boden mit einer plasmadurchlässigen Membran verschlossen ist.

Anschließend werden bei Raumtemperatur (22°) für die Dauer von 15 min 2,4 bzw. 6 ml Plasma durch die Säule gepumpt. Nach Beendigung des Umpumpens erfolgt die Analyse des Blutplasmas wie in Beispiel 1 beschrieben. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2, Spalte 4/1 dargestellt.

Spalte 4/2 enthält die jeweiligen Werte für dasselbe Produkt nach Regenerieren mit 25 ml Glycin-HCI-Puffer, 25 ml 5 M Harnstofflösung und 80ml PBS.

Während bei beiden Proben die/3-Lipoprotein-, Gesamt-Cholesterol- und LDL-Cholesterolwerte wiederum deutlich herabgesetzt sind, findet weder für a-i-Lipoprotein und HDL-Cholesterol noch für die zweiwertigen Metallionen Ca²⁺ und Mg²⁺eine merkliche Adsorption statt.

Tabelle 1: Inkubation von Perlcelluloseproben unterschiedlicher Porosität mit Blutplasma (30min, 37⁰C)

Adsorption

in % der Plasmawerte vor Behandlung mit Perlcellulose

Parameter	Probe 0	Probe 1/1	Probe 1/2	Probe 1/3	Probe 2
	(Vergleichsprobe)
Albumin	73 ±2	78 ±4	84 ±6	74 ±3	68±5
Transferrin	78 ±10	78 ±4	88 ±6	78 ±8	72 ±4
t*2-Macroglobulin	76±5	79 ±4	90 ±2	80 ±2	70 ±4
ß-Lipoprotein	71±4	24 ±5	32 + 5	23 ±5	34±6
Ct₁-Li poprotein	86 ±8	66±2	76 ±6	66 ±4	64±3
Gesamt-Cholesterol	68	21	34	23	32
LDL-Cholesterol	72	0	13	5	4
Triglyceride	76	55	43	44	68
HDL-Cholesterol	60	56	79	66	67
Kontrollbereiche	71-77-83		71-81-91		64-78-92

Tabelle 2: Perfusion von 2,4 bzw. 6ml Blutplasma durch eine mit 1 g feuchter Perlcellulose gefüllte Säule (15min, 22°C)

Parameter	Plasmamenge	Adsorption	Probe 4/2
	ml		24 ±7
		in % der Ausgangswerte	35 ±2
/3-Lipoprotein	2	Probe 4/1	53 ±1
	4	24 ±7	86 ±1
	6	41 ±3	95 ±1
a_rLipoprotein	2	58 ±3	97 ±1
	4	73 ±2	22
	6	78 ±6	37
Gesamt-Cholesterol	2	88 ±3	49
	4	25	0
	6 '	42	18
LDL-Cholesterol	2	54	30
	4	1
	6	21
32

Parameter	Plasmamenge	Adsorption	Probe 4/2
	ml		39
		in % der Ausgangswerte	57
Triglyceride	' 2 -	Probe 4/1	64
	4	38	90
	6	88	84
HDL-Cholesterol	2	99	95
	4	70	83
	6	90	85
Ca²⁺	2	90	85
	4	100	—
	6	100	—
Mg²⁺	2	135	85
	4	74
	6*	89
93

Claims

1. Selektives Adsorbens zur Bindung von Lipoproteinen niedriger Dichte auf Basis von Perlcellulose, gekennzeichnet dadurch, daß das Adsorbens unmodifizierte Perlcellulose ist, die ein Gesamtporenvolumen von mindestens 2cm³/g Trockenmasse aufweist, wobei der Anteil an zugänglichen Makroporen mit einem Eingangsquerschnitt von 20 bis 2000 nm mindestens 10% des Gesamtporenvolumens und der Teilchendurchmesser der Perlcellulose 0,1-0,3 mm beträgt.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Adsorbens für die selektive Entfernung von Lipoproteinen niedriger Dichte aus Blutplasma und ist im Bereich der Medizin und Medizintechnik anwendbar.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) spielen in der Pathogenese der Arteriosklerose eine entscheidende Rolle. Aus zahlreichen klinischen Studien ist bekannt, daß sich das Risiko einer Arteriosklerose mitzunehmendem LDL-Gehalt im Blutplasma erhöht, während zwischen der Höhe des Plasmaspiegels der Lipoproteine hoher Dichte (HDL) und dem Risiko der Entwicklung von Blutgefäßverkalkungen eine inverse Korrelation besteht.

Wegen der stark erhöhten LDL-Werte des Plasmas bei Patienten, die an familiärer Hypercholesterolämie leiden, ist hier das Arterioskleroserisiko besonders hoch. Diätetische und medikamentöse Behandlungen zeigen in diesen Fällen nicht die gewünschten Erfolge. Deshalb sind für diese Patienten Verfahren, mit deren Hilfe es gelingt, das Blutplasma von LDL zu befreien, von größter Bedeutung.

Bekanntlich wurden hierfür zunächst Plasmaaustauschverfahren sowie spezielle Plasmafiltrationstechniken angewandt, die jedoch den Nachteil besitzen, daß auch andere Plasmabestandteile, wie z. B. Immunglobuline und Gerinnungsfaktoren, entfernt werden, bzw. daß sie sehr teuer und aufwendig sind.

In jüngster Zeit wurden zur Entfernung von LDL aus dem Blutplasma jedoch selektive Adsorbentien entwickelt, die eine wesentliche Verbesserung der bekannten therapeutischen Verfahren ermöglichten. Dabei handelt es sich einerseits um spezifische Adsorbentien (Immunadsorbentien), die aus Agaroseperlen bestehen, an die kovalent gegen die LDL-Apoproteine gerichtete Antikörper gebunden sind (W. STOFFEL, Ch. BODE: Selective Removal of Low Density Lipoproteins, in „Selective Plasma Component Removal", Ed. A. A. Pineda, Futura Publishing Comp., Mount Kisco, New Yourk, 1984) und andererseits um ionisch modifizierte polymere Träger, wie z. B. Polyvinylalkohol-, Agarose- oder Celluloseperlen, die mit anionischen Polyelektrolyten, wie z. B. Heparin oder Dextransulfat, beschichtet sind (Y. HOMMA, Y. MIKAMI, H.TAMACHI, N. NAKAYA, H. NAKAMURA, G. ARAKI, Y. GOTO: Comparison of Selectivity of LDL Removal by Double Filtration and Dextran-Sulfate Cellulose Column Plasmapheresis. Atherosclerosis 60 [1986] 23-27; US-PS 4103685). Während der Nachteil der Immunadsorbentien vor allem in der aufwendigen Gewinnung und Fixierung der Antikörper und den dadurch bedingten hohen Preis der Produkte zu sehen ist, haben die ionisch modifizierten polymeren Träger den Nachteil, daß sie gleichzeitig auch zweiwertige Metallionen, wie z. B. Ca²⁺ und Mg²⁺ binden. Da diese bei therapeutischen Verfahren mit den genannten Adsorbentien wieder ersetzt werden müssen, kompliziert und verteuert das die Behandlung.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, Adsorbentien zur Entfernung von LDL aus Blutplasma aufzuzeigen, die leicht verfügbar und kostengünstig sind und allen sonstigen Anforderungen an die Eigenschaften derartiger Materialien gerecht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unmodifizierte poröse polymere Adsorbentien zu finden, die geeignet sind, selektiv und mit hoher Kapazität LDL aus Blutplasma zu binden. Die Adsorbentien sollen regenerierbar und sterilisierbar sein sowie Kugelform und eine hohe mechanische Festigkeit besitzen, um als Packung in einer Säule ein gutes Fließverhalten des Blutes oder Blutplasmas durch die Säule zu gewährleisten. Weiterhin sollen die Adsorbentien gut blutverträglich sein, d. h. plasmatische Systeme dürfen nicht beeinträchtigt werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß als selektives Adsorbens zur Bindung von LDL aus Blutplasma mechanisch stabile, kugelförmige, unmodifizierte, poröse Perlcellulose verwendet wird, die ein Gesamtporenvolumen von mindestens 2cm³/g Trockenmasse aufweist, wobei der Anteil an zugänglichen Makroporen mit einem Eingangsquerschnitt von 20 bis 2000nm mindestens 10% des Gesamtporenvolumens beträgt. Als Gesamtporenvolumen ist hierbei der Volumenanteil