DD249618A3

DD249618A3 - Verfahren zur Bestimmung der antiradikalen Aktivität von Stoffen

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Publication number: DD249618A3
Authority: DD
Publication date: 1987-09-16

Abstract

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die experimentelle und klinische Biochemie und Labordiagnostik. Mit der Erfindung wird das Ziel, Entwicklung eines einheitlichen Verfahrens zur Bestimmung sowohl der enzymatischen als auch der nichtenzymatischen antiradikalen Aktivitaet von biologischem Material, das schnell, einfach und sensitiv ist und eine Automatisierung des Messvorganges ermoeglicht, verfolgt. Die Erfindung gewaehrleistet es, ein neues Verfahren zu entwickeln, das zwei bekannte und vorteilhafte Methoden (fotochemische Methode der Erzeugung von Superoxidradikalen und die Chemolumineszenzmethode fuer ihren Nachweis) enthaelt, die bis jetzt auf Grund ihrer widerspruechlichen Durchfuehrungsbedingungen nur getrennt benutzt wurden. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, indem ein Teil der bestrahlten (Produktion der O 2-Radikale) Loesung kontinuierlich in das Chemoluminometer (Nachweis der O 2) abgesaugt wird. Fuer die Gewaehrleistung der dazu notwendigen Lebensdauer der Superoxidradikale wird die Messung bei stark basischem p H-Wert durchgefuehrt. Weiterhin ist das Verfahren durch die Anwendung eines chemolumineszenzfaehigen Farbstoffes, vorrangig von 3-Aminophthalsaeurehydrazid, sowohl fuer die Erzeugung als auch fuer den Nachweis der Superoxidradikale gekennzeichnet.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung wird angewendet auf dem Gebiet der experimentellen und klinischen Biochemie und Labordiagnostik, vorzugsweise für die Bestimmung der antiradikalen Aktivität in biologischen Materialien.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die freien Radikale spielen eine bedeutende Rolle bei ischämischen Gewebsschädigungen, bei Entzündungen, dem Alterungsprozeß und anderen physiologischen und pathologischen Prozessen (Age 7/1984, S. 9-16; Acta PhysioI. Scand.Suppl. 492,1980; Life Sei 34, 1984, S. 713-720). Die antiradikale Aktivität des biologischen Materials (z.B. Blutplasma, Zellysat usw.) ist bedingt durch enzymatische und nichtenzymatische Komponenten

Die Bestimmung der antiradikalen Aktivität erfolgt in zwei Etappen:

1. die Erzeugung von freien Radikalen und

2. ihr Nachweis mit einem Indikatorsystem, in dessen Resultat es zu einer von der Anwesenheit antiradikaler Substanzen abhängigen Veränderung eines Parameters (z. B. der optischen Dichte) kommt.

Eine besondere Bedeutung bei der Eliminierung einer der aktiven Sauerstoffspezies — den Superoxid radikalen — kommt der Superoxiddismutase (SOD) (OJ-O^-Oxidoreduktase, EC 1.15.1.1.) zu. Ihre Anwesenheit im zu untersuchenden Material führt gewöhnlich zur Hemmung der Testreaktion. Als eine Einheit der Enzymaktivität ist die Veränderung des registrierten Merkmals um 50% im Vergleich zu dem entsprechenden Wert in Abwesenheit von SOD definiert (J. Biol. Chem. 244,1969, 6049-6055).

Die bisher breiteste Anwendung fanden die enzymatische Erzeugung der O^ mit Xanthin-Oxydase (EC 1.2.3.2.) und als Indikatorreaktion die Reduktion des Cytochroms C (J. Biol. Chem. 244, 1969, 6049-6055).

Daneben sind für die Oi-Erzeugung die einfacheren und zuverlässigeren fotochemischen Methoden (Anal. Biochem. 44, 1971, 276-287; Anal. Biochem. 79, 553-560) und für ihren Nachweis die um einige Größenordnungen empfindlicheren Chemolumineszenzmethode bekannt (Photochem. Photobiol. 18,1973, 451-455).

Die Bestimmung der nichtenzymatischen Komponente der antiradikalen Aktivität erfolgt am Modell der Oxydation von Kohlenwasserstoffen, Fettsäuren, Säureäthern oder von Gemischen dieser Stoffe. Diese Methoden basieren auf verschiedenen Arten zur Bestimmung der Gesamtoxydationsgeschwindigkeit der Modellsysteme: nach dem Sauerstoffverbrauch, nach der Veränderung der Anzahl der Doppelbindungen im Substrat, nach der Anhäufung von Oxydationsprodukten (Hydroperoxiden), nach der Veränderung der Konzentration der untersuchten Antioxidantien.

In der Praxis wird die zu untersuchende Substanz (Inhibitor) dem Modellsystem vor Reaktionsbeginn zugesetzt und unter Standardbedingungen die Oxydation durchgeführt. Die Aktivität des Inhibitors ist charakterisiert durch den absoluten Wert der Induktionsdauer (Endzeitpunkt der Hemmung des Oxydationsprozesses) oder durch das Verhältnis der Induktionsperiode zur Induktionsperiode der Oxydation in Anwesenheit eines als Standard genommenen Inhibitors auf eine Konzentrationseinheit.

Die aufgezählten klassischen Methoden zur Bestimmung der nichtenzymatischen antiradikalen Aktivität sind sehr langwierig (Stunden), aufwendig und wenig empfindlich. Genauer und schneller sind die Methoden der Chemolumineszenz (CL). Dabei wird die antioxydative Aktivität der Verbindungen nach ihrer Fähigkeit beurteilt, die spontane CL der Lipide und ihrer Fraktionen sowie die durch verschiedene Einwirkungen (z. B. thermische, durch y-Strahlen, elektrolytische, durch Ultraschall usw.) erregte CLzuhemmen.lnderBiologiefanddie Elektrochemolumineszenz (ECL) (Nature, 138,1960, 961) breite Anwendung.

Bei der elektrolytischen Oxydation von Tyrosin werden auf der Anode seine freien Radikale gebildet, deren Rekombination eine Chemolumineszenz bewirkt.

Verschiedene Stoffe mit antioxidativer Aktivität führen bei ihren Zufuhr in das System zu einer Abnahme der CL-Intensität.

Neben dem Tyrosin-System ist das ECL-Natriumcitrat-Methanol-System bekannt (Zesz. nauk. politechn. szezecinskiej 122,1970,

Ein Mangel der ECL ist der Fakt, daß einige mit anderen Methoden nachgewiesene gute Antioxidantien die CL-Intensität nicht verringern und andererseits schwache Antioxidantien teilweise zu einer starken Cl-Verringerung führen können. Letzteres kann durch die räumliche Begrenztheit der oxydativen Reaktion auf der Anodenfläche und die Möglichkeit einer konkurrierenden Kooxydation der Untersuchungsstoffe erklärt werden.

Die Zunahme der CL in Anwesenheit einiger Substrate erfolgt, wenn der zu untersuchende Stoff selbst an der ECL-Reaktion teilnimmt oder mit einer größeren Effektivität strahlt als die rekombinierenden Radikale des Testsystems.

Ein weiterer Mangel der ECL-Systeme ist ihre unzureichende Sensitivität, da infolge der geringen Quantenausbeuten (für Methanol z. B. 10"¹¹) eine für ihre Registrierung ausreichende CL-Intensität erst bei großen Radikalkonzentrationen erreicht wird, was seinerseits große inhibitörkonzentrationen erfordert (in der Größenordnung von 10~³ bis 10~⁵mol/l). Die ECL-Methoden sind außerdem nicht ausreichend schnell — eine Messung dauert mehrere Minuten. Somit kann sowohl für die SOD-Bestimmung als auch für die Bestimmung der nichtenzymatischen antiradikalen Aktivität die Beseitigung der Unvereinbarkeit (widersprüchliche Bedingungen) der Erzeugung freier Radikale durch intensive Lichtbestrahlung mit der Chemolumineszenzmethode für ihren Nachweis (die vollkommenen Lichtausschluß bei der Registrierung fordert) im Vergleich mit den bekannten Verfahren mehrere wesentliche Vorteile aufweisen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein einheitliches Verfahren zur Bestimmung sowohl der enzymatischen als auch der nichtenzymatischen antiradikalen Aktivität von biologischem Material zu entwickeln, das schnell, einfach und sensitiv ist und eine Automatisierung des Meßvorganges ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die bekannten Nachteile dertechnischen Lösung zu beseitigen und ein neues Verfahren zu entwickeln, das zwei bekannte Verfahren vereint. ·

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Vereinigung einer einfachen, zuverlässigen und effektiven fotochemischen Methode zur Erzeugung freier Radikale mit einer sensitiven und schnellen Chemolumineszenzmethode ihrer Registrierung gelöst, welche brauchbar ist für eine automatische Bestimmung der anti radikal en Aktivität biologischen Materials.

Die Vorteile der Fotomethode für die Erzeugung der Radikale sind ihre Einfachheit, Schnelligkeit, Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Dosierung (letzteres wird durch Ein- und Ausschalten der Bestrahlung gewährleistet).

Die Chemolumineszenzmethode zum Nachweis der OJ zeichnet sich ihrerseits durch eine hohe Empfindlichkeit (Die Oxydation des Luminols wird begleitet von einer Quantenausbeute von 0,01), Schnelligkeit und Einfachheit des Registriervorganges (Der Ausgang des SEV ist direkt mit einem hochohmigen Schreiber verbunden.) aus. Für die Gewährleistung der Lichtisolierung bei der Messung der CL der bestrahlten Lösung ist die Registriervorrichtung räumlich vom Generierungssystem getrennt. Die wichtigste Anforderung an ein solches System ist eine schnelle Überführung der bestrahlten Lösung in eine CL-Mikromeßküvette (mit Hilfe einer entsprechenden Mikropumpe). Für die Gewährleistung der dazu notwendigen Lebensdauer der Superoxidradikale, die stark pH-abhängig ist, wird die Messung bei basischem pH-Wert von 10... 11 durchgeführt.

Zur Verringerung des Reagenzienverbrauchs wird die Lösung unmittelbar nach der CL-Messung wieder in die Bestrahlungsküvette zurückgeleitet, und das Volumen des Zirkulationssystems (abführende Röhrchen, Pumpe, Meßküvette) wird auf einem Minimum (etwa 10% des Gesamtvolumens der Lösung) gehalten.

Ausführungsbeispiele

1. Ausführungsbeispiel

Die Vorrichtung wurde nach dem auf Fig. 1 dargestellten Schema gebaut.

1 — Lichtquelle (Quecksilberlampe, 120W)

2 — Schirm für die Unterbrechung der Bestrahlung,

3—-Farbfilter mit dem Transmissionsmaximum bei 368nm,

4 — Bestrahlungsküvette,

5 — thermostatierende (mit H₂O dest.) Umhüllung der Bestrahlungsküvette, 6— Motor für die Mischung der Lösung während der Bestrahlung,

7 — Röhrchen für die Ansaugung des Untersuchungsgemisches in die Bestrahlungsküvette,

8 —Röhrchen für die Überführung des Materials aus der Bestrahlungsküvette in den Chemoluminometer, 9— Mikromeßküvette des Chemoluminometers,

10 —Chemoluminometer mit einem Sekundärelektronenvervielfacher M 12 FVC-51

11 —Mikroschlauchpumpe,

12 — Reagenzglas mit dem Untersuchungsgemisch,

13 — 3-Wege-Hahn,

14 —Gefäß mit bidestiliiertem Wasser für die Spülung des Meßsystems,

15 — Sammelgefäß,

16 — Vakuumpumpe,

17 — Registriervorrichtung

Die Vorrichtung besteht aus einer Küvette für die Bestrahlung (mit UV-A-Licht) der Lösung, der Mikromeßküvette 9 (20μΙ) des Chemoluminometers (Patent DDR Nr.213997) und einem beide Küvetten verbindenden dünnen Röhrchen 8. Die Zirkulation der Lösung in dem geschlossenen System zwischen beiden Küvetten wird durch eine Mikroschlauchpumpe 11 gewährleistet. Das Untersuchungsgemisch (Gesamtvolumen 2,5ml) besteht aus 0,1molarer Karbonatpufferlösung (pH 11), in welcher Luminol (ΙΟμΓηοΙ) und die zu untersuchende Substanz gelöst sind. Das Vorlumen des Meßsystems (abführende Röhrchen, Mikroschlauchpumpe, Meßküvette) beträgt 15% des Gesamtvolumens, die Zeitverzögerung zwischen der Bestrahlung und der Messung ist 0,2 Sekunden. Im Ausgangszustand bedeckt der Schirm 2 den Weg des bestrahlenden Lichtstrahls, und die Küvette 4 ist leer.

Zum Röhrchen 7 führt man das Untersuchungsgemisch im Reagenzglas 12, betätigt den Hahn 13 und schaltet die Vakuumpumpe 16an. Nach dem Ansaugen des Materials in die Küvette 4 wird diePumpe16 ausgeschaltet. Es werden derRührer6, die Schlauchpumpe 11 und der Schreiber 17 eingeschaltet. Die Nutlinie wird aufgezeichnet. Dann wird der Schirm 2 geöffnet. Unmittelbar nach Anfang der Bestrahlung des Lösungsgemisches wird eine Chemolumineszenz beobachtet (Zunahme des Fotostromes des SEV), die ihr Maximum nach etwa zwei Minuten erreicht und danach langsam abnimmt. Eine typische Chemolumineszenzkurve ist auf der Fig.2; Kurve a dargestellt

Durch den Pfeil ist der Bestrahlungsanfang gekennzeichnet.

Die Gegenwart der Superoxiddismutase in der zu bestrahlenden Lösung führt zu einer Verringerung der CL: Fig. 2; Kurve b. Die Abhängigkeit der Inhibierung der CL (gemessen im Maximum) von der Quantität der zugesetzten SOD (ihre Aktivität wurde mitderTetrazolium-Methode/Biochem. Biophys. Res.commun.46,1972, 849-854/bestimmt)in%zum Leerwert ist auf der Fig. 3 dargestellt. Einer nach dieser Methode bestimmten Einheit der SOD-Aktivität entsprechen 0,1 E mit derTetrazolium-Methode bestimmten. Beim Zusatz einer antioxydativen Substanz beobachtet man eine Latenzperiode vordem Anstieg der CL (Fig. 2; Kurve c). Die Abhängigkeit der Latenzdauer in Minuten von der Endkonzentration der zugesetzten antioxydativen Substanz am Beispiel von a-Tokopherol und/3-Karotin ist auf der Fig. 4a u. b dargestellt.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der antiradikalen Aktivität von Stoffen, das in zwei Etappen verläuft: 1. Erzeugung von Superoxidradikalen und 2. Nachweis mit einem Detektorsystem, welches eine Quantifizierung der generierten Radikale ermöglicht und die Veränderungen des Meßsignals bei Anwesenheit von antiradikalen Substanzen anzeigt, gekennzeichnet dadurch, daß bei einer fotochemischen Erzeugung die Superoxidradikale mit Hilfe der Chemolumineszenzmethode nachgewiesen werden.

2. Verfahren nach Pkt. 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Lösung kontinuierlich aus der Bestrahlungsküvette in die Meßküvette überführt und anschließend zurück in die geleitet wird.

3. Verfahren nach Pkt. 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die Erzeugung und den Nachweis der Superoxidradikaie die gleiche Substanz, vorrangig 3-Amino-phthalsäurehydrazid, eingesetzt wird.