DD236550A1

DD236550A1 - Verfahren zur vegativen vermehrung von digitalis-hochleistungspflanzen

Info

Publication number: DD236550A1
Application number: DD27554085A
Authority: DD
Inventors: Monika Springer; Heidelore Mertinat; Beate Diettrich; Martin Luckner; Anette Hess; Klaus Breuel
Original assignee: Dresden Arzneimittel
Priority date: 1985-04-25
Filing date: 1985-04-25
Publication date: 1986-06-11

Abstract

Die Erfindung "Vereinfachtes Verfahren zur virusfreien, vegetativen Vermehrung und Erhaltung von Digitalis-Hochleistungspflanzen" bezieht sich auf die Rationalisierung der Digitalis-Klonpflanzen-Produktion mittels Sprossspitzenkulturen. Sie loest diese Aufgabe indem sehr kleine Sprossspitzen-Explantate von 0,3 bis 0,5 mm verwendet werden und Anzucht, Vermehrung und Bewurzelung der sterilen Sprosse in Naehrboeden vereinfachter Zusammensetzung erfolgt wobei die Vermehrung vorzugsweise submers vorgenommen und die Wurzelbildung durch kurzzeitiges Tauchen in einem Induktionsmedium ausgeloest wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Blätter von Digitalis lanata und Digitalis purpurea werden in der pharmazeutischen Industrie zur Gewinnung von Herzglykosiden benutzt. Die sie tragenden Pflanzen werden in der Landwirtschaft unter Verwendung von Elitesaatgut erzeugt, welches durch Kreuzung von Digitalis-Klonpflanzen mit hohem Herzglykosidgehalt hergestellt wird. Die Erfindung ermöglicht die Rationalisierung und Verbilligung der Klonpflanzenproduktion.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, Klonpflanzen durch Sproßspitzenkultur aus ausgelesenen Digitalis-Hochleistungspflanzen gemäß DD-PS 207731 zu erzeugen. Dabei ist zur Saatguterzeugung für den Anbau eine jährliche Neuherstellung der Klonpflanzen notwendig, da Digitalispflanzen nach der Samenreife absterben. Nach dem bekannten Verfahren werden die zur Gewinnung virusfreier Klönpflanzen als Ausgangsmaterial dienenden Hochleistungspflanzen einer 8—10 Wochen dauernden Wärmebehandlung unterzogen, wobei es zu einer Verringerung des Virusgehaltes in den Sproßspitzen kommt. Nachteilig ist bei diesem Verfahren der hohe Zeitbedarf, sowie eine allgemeine Schwächung der Pflanzen durch die notwendigen hohen Temperaturen. Nach der in der DD-PS 207731 enthaltenen technischen Lösung erfolgt die Anlage, Vermehrung und Bewurzelung virusfreier Sprosse entweder auf einem modifizierten Nährmedium nach Murashige und Skoog, das neben den in Tabelle 1 aufgeführten Salzen Vitamine, wie Thiamin, Pyridoxin, Nicotinsäureamid und Inositol sowie die Aminosäuren L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Histidin, L-Hydroxyprolin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin und L-Valin enthält oder auf dem Originalmedium nach Murashige und Skoog, das neben den in Tab. 1 aufgeführten Salzen CUSO4, C0CI2, sowie myo-lnositol, Nicotinsäure, Pyridoxin und Thiamin enthält (Schönerund Reinhard, Planta medica45 [1982] 155), auf dem Medium nach Linsmayer und Skoog, das neben den in Tabelle 1 aufgeführten Salzen CuSO₄, CoCI₂, myo-lnositol und Thiamin enthält (Erdei et al., Plant Cell Reports 1,34—35 [1981]) oder auf dem Medium von Nitsch und Nitsch, das zusätzlich zu den in Tabelle 1 aufgeführten Salzen CuSO₄, myo-lnositol, Nicotinsäure, Pyridoxin, Thiamin, Folsäure, Biotin und Glycin enthält (Dobos et al., Herba Hungarica 21,49—57 [1982]). Der Nachteil dieser Nährmedien liegt in ihrer komplexen Zusammensetzung und dem dadurch bedingt hohen Preis. Die Vermehrung steriler Sprosse erfolgt auf einem mit Agar verfestigten Medium (vgl. DD-PS 207731, Erdei et al., Plant Cell Reports 1,34—35 (1981), Dobos et al., Herba Hungarica 21,49—57 [1982]), wobei nachteilig ist, daß nur relativ niedrige Vermehrungsraten erreicht werden. Die submerse Vermehrung von Sprossen wurde zwar beschrieben (Schoner und Reinhard, Planta medica45,155 [1981]), jedoch war hierzu die Verwendung des komplex zusammengesetzten Originalmediums nach Murashige und Skoog notwendig.

Die Bewurzelung der hergestellten Sprosse wird nach bekannten Verfahren in einem Nährmedium durchgeführt, das Auxine enthält, wobai sich innerhalb von acht Wochen eine für die weitere Behandlung der Pflanze ausreichende Wurzelmasse bildet (vgl. DD-PS 207731, Erdei et al.. Plant Cell Reports 1,34-35 [1981], Dobos et al., Herba Hungarica 21,49-57 [1982], Schoner und Reinhard, Plantamedica 45,155 [1982]). Nachteilig ist hierbei vor allem die für die Bewurzelung notwendige lange Zeit, durch die Raumkapazität gebunden wird und sich die Gefahr von Infektionen vergrößert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Rationalisierung der Herstellung virusfreier Klonpflanzen aus Digitalis-Hochleistungspflanzen durch Vereinfachung der Isolation virusfreier Explantate, Verbesserung der Gewinnung, Vermehrung und Bewurzelung virusfreier Sprosse bei gleichzeitiger qualitativer Verbesserung der daraus regenerierten Pflanzen.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, das bisher bekannte Verfahren zur Herstellung von Digitalis-Hochleistungspflanzen zu rationalisieren durch

— Vereinfachung der Herstellung virusfreier Explantate,

— Vereinfachung und damit Verbilligung der Nährmedien,

— Erhöhung der Vermehrungsrate der Sprosse und

— Verkürzung des für die Bewurzelung notwendigen Zeitraumes.

Für die Herstellung virusfreier Explantate wurde eine Methode gefunden, die die bisher notwendige langwierige Wärmebehandlung der Ausgangs-Hochleistunyspflanzen unnötig macht. Dabei werden besonders kleine in unbehandelten Pflanzen vorhandene apikale und in den Achseln von Blättern stehende Sproßspitzen (Meristeme mit den nächsten Blattprimordien) isoliert und zur Kultur gebracht.

Für Sproßinduktion und Vermehrung wurde ein Nährmedium gefunden, das neben den notwendigen Salzen nur die Vitamine Thiamin und Inositol, sowie Saccharose und ein Zytokinin,z. B. Benzyladenin, enthält. Zur Vermehrung werden die Sprosse erfindungsgemäß submers in der Nährlösung kultiviert wobei 4 bis 5fach höhere Vermehrungsraten als bei emerser Kultivation erhalten werden.

Die Bewurzelung der Sprosse wird erfindungsgemäß durch kurzzeitiges Untertauchen in einem Medium induziert, das Auxine, z. B. Naphthylessigsäure, und Zytokinine, z. B. Benzyladenin, in höherer Konzentration enthält. Die Ausbildung der Wurzeln erfolgt erfindungsgemäß in einem hormonfreien Medium. Hierdurch kann bei Vergrößerung der Wurzelmasse der Prozeß der Bewurzelung von acht Wochen auf fünf Wochen verkürzt werden.

Ausführungsbeispiel Beispiel 1

(Anzucht virusfreier Sprosse)

Sproßspitzen (Meristeme und die nächstliegenden Blattprimordien), Größe 0,3-0,5 mm, werden am Sproßende oder aus Blattachseln sterilisierter Digitalissprosse im 1. oder 2. Vegetationsjahr entnommen. Die Sproßspitzen werden auf einem Nährboden zur Entwicklung gebracht, der neben den Salzen derTabelle 1, 0,5mg Thiamin, 10Ömg Inositol, 30g Saccharose, 2mg Benzyladenin und 8g Agar pro Liter enthält. Die Kultivation erfolgt bei 25°C bei einer 16stündigen Belichtung, die durch 8stündige Dunkelperioden unterbrochen wird. Nach 4 Wochen bilden sich virusfreie Sprosse und es entwickeln sich in den Blattachseln neue Sproßspitzen.

Beispiel 2

(Vermehrung steriler Sprosse)

Nach Beispiel 1 erhaltene Sprosse werden in einem Nährmedium, das neben den Salzen derTabelle 1, 0,5mg Thiamin, 100mg Inositol, 30 g Sacchrose und 2 mg Benzyladenin pro Liter enthält, im Hell-Dunkel-Wechsel, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert (1 Sproß auf 50 ml Medium in 200 ml Erlenmeyerkolben). Innerhalb von vier Wochen bilden sich bis zu 30-40 Tochtersprosse, die vereinzelt und entweder zur weiteren Vermehrung benutzt oder zu Pflanzen regeneriert werden können.

Beispiel 3

(Induktion der Bewurzelung unter Verwendung der Salze von Tabelle 1)

Nach Beispiel 2 erhaltene Sprosse wurden eine Stunde in einem Nährmedium untergetaucht, das neben den Salzen von Tabelle 1,30 g Sacchrose, 25 mg Naphthylessigsäure und 3 mg Benzyladenin pro Liter enthält. Sie werden danach auf einem Nährmedium zur Wurzelbildung weiter kultiviert.

Beispiel 4

(Induktion der Bewurzelung unter Verwendung von Wopil^[Rl)

Nach Beispiel 2 erhaltene Sprosse wurden eine Stunde in einem Nährmedium untergetaucht, das neben 1 g Wopil^IRI, 30g Saccharose, 25 mg Naphthylessigsäure und 3 mg Benzyladenin pro Liter enthält. Sie werden danach auf einem Nährmedium zur Wurzelbildung weiter kultiviert.

Beispiel 5

(Wurzelbildung)

Sprosse, in denen nach Beispiel 3 oder 4 die Wurzelbildung induziert wurde, werden fünf Wochen auf einem Nährmedium kultiviert, das neben den Salzen von Tabelle 1,8,0 g Agar pro Liter Nährmedium enthält. Innerhalb von fünf Wochen hat sich eine für die Überführung aus dem sterilen Milieu ausreichende Wurzelmasse gebildet.

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Salze des erfindungsgemäß vereinfachten Nährmediums nach Murashige und Skoog (Physiol. Plant. 15 [1962]

Tabelle 1: Salze des erf	ndungsgem
479-497)
	mg/l
CaCI₂-6 H₂O	661
KH₂PO₄	170
Na₂EDTA-2 H₂O	37,3
H₃BO₃	6,2
MnSO₄	15,1
ZnSO₄-7 H₂O	8,6
Kl	0,83
Na₂MoO₄-2 H₂O	0,25
NH₄NO₃	1 650,0
KNO₃	1 900,0
MgSO₄ -7 H₂O	370,0
FeSO₄ -7 H₂O	27,8

Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft die Rationalisierung des Verfahrens zur Herstellung virusfreier Klonpflanzen aus Digitalis-Hochzuchtpflanzen durch Sproßspitzenkultur. Dazu werden besonders kleine Sprößspitzen (Meristeme und nächstliegende Blattprimordien) aus Digitalissprossen im ersten oder zweiten Vegetationsjahr entnommen und auf weniger komplexen Nährmedien zur Entwicklung, Vermehrung und Bewurzelung gebracht. Die Vermehrung der Sprosse erfolgt submers, da hierbei besonders hohe Vermehrungsraten erreicht werden. Die Wurzelbildung wird durch Tauchen der Sprosse in einer Auxine und Zytokinine enthaltenden Nährlösung induziert. Die Ausbildung der Wurzeln erfolgt auf einem Medium, das als Nährstoffe nur anorganische Salze enthält.

Claims

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Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur vegetativen Vermehrung von Digitalis-Hochleistungspflanzen durch Sproßspitzenkultur, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anlage virusfreier Sprosse sehr kleine Sproßspitzen-Explantate (Größe 0,3—0,5 mm) benutzt werden und Anzucht, Vermehrung und Bewurzelung der sterilen Sprossein Nährböden mit vereinfachter Zusammensetzung erfolgt, wobei die Vermehrung vorzugsweise submers vorgenommen und die Wurzelbildung durch kurzzeitiges Tauchen in einem Induktionsmedium ausgelöst wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzucht der Sprosse ein Nährboden benutzt wird, der außer den Salzen der Tabelle 1 0,5mg/l Thiamin, 100mg/l Inositol, 30g'/l Saccharose, 2mg/l Benzyladenin und 8g/l Agar enthält.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet.'daß die Sprosse vier Wochen submers in einer Schüttelkultur vermehrt werden, die außer den Salzen der Tabelle 1 0,5mg/l Thiamin, 100mg/l Inositol, 30g/l Saccharose und2mg/l Benzyladenin enthält.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Wurzelinduktion und Wurzelbildung voneinander getrennt werden, wobei zur Wurzelinduktion ein Nährmedium benutzt wird, das außer den Salzen der Tabelle 1 25mg/l Naphthylessigsäure und 3mg/l Benzyladenin enthält.
5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Salze der Tabelle 1 1 g/l Wopil^(R) benutzt wird.
6. Verfahren nach Punkt 1,4, und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die sterilen Sprosse 1 h in der Lösung untergetaucht werden.
7. Verfahrennach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die induzierten Sprosse zur Wurzelbildung auf einem Medium kultiviert werden, das außer den Salzen der Tabelle 1 Sg/I Agar enthält.