DD225795A1 - Festphasen-immunoassay an cellulosehaltigen materialien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikoerpern, Haptenen usw. an zellulosehaltigen Materialien. Ziel der Erfindung ist es, leicht zugaengliche und billige Traegermaterialien im Immunoassay zu verwenden, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen. Die Erfindung hat die Aufgabe, im Festphasen-Immunoassay zellulosehaltige Formkoerper mit hoher Beladungskapazitaet zu verwenden. Erfindungsgemaess wurde die Aufgabe durch Formkoerper geloest, die aus Zellulose und/oder Zellulosederivaten mit 4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol.-%, aus 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin in einer Menge von 0,5-50 Vol.-%, aus Chloriden in einer Menge bis zu 20 Vol.-% und aus Zellulose und/oder Zellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol.-% bestehen. Der Immunoassay wird in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin sowie der Biotechnologie angewendet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, Haptenen etc. an !zellulosehaltige) Träger unter wiederholtem und reproduzierbarem Einsatz im (Enzym)-Immunoassay. Das Verfahren findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschafiiichen Forschung sowie der BioteohQologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die An'wendung von Immunoassays zur spezifischen und empfindlichen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Viren etc. hat in den letzten Jahren sowohl in der klinischen Routinediagnostik als auch in der medizinischen und biowissenschaftlichen Forschung große Bedeutung erlangt, wobei sich der Anwendungsbereich dieser Methoden in den nächsten Jahren erheblich erweitern wird. Am häufigsten angewandt wird hierbei die sogenannte Festphasentechnik („solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden ist und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K. J.Catt und G.W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der ädsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyrol, Polyäthylen, PVC u.a., genutzt (Übersicht: J.E.Herrmann, in: Methods in Enzymology 73 [1981] 239)

Nachteile dieses Verfahrens sind:

— Die Beladungsdichte an Plastematerialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial, die zur Verfugung stehende Oberfläche sowie die Größe des Proteins limitiert.

— Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J.E.Herrmann, R.M.Hendry, M.F.Collins: J.CIin. Microbiol. 10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W.Schößler, G.Wegner: Z. med. Labordiagn. 24 [1983] 177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.

— Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so daß sehr wertvolle und nur aufwendig zu präparierende Proteine verloren gehen.

— Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probenzahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.

— Die Möglichkeiten einer Standardisierung sind bei diesem Verfahren begrenzt.

Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, beschrieben verschiedene Autoren den Einsatz chemisch modifizierter Träger zur kovalenten Kopplung von Proteinen im Immunoassay (Übersicht: J.E.Herrmann, in: Methods in Enzymology 73 [1981] 239). Von derartigen Materialien haben insbesondere Zellulose, Dextrane, Agar und dessen Derivate (Übersicht: S.Fuchs, M.SeIa, in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford 1978) neben PolyacrylsäureDerivaten, substituierten Polystyrolen oder Nylon (R.M.Hendry, J.E.Herrmann: J. immunol. methods 35 [1980] 285) als Matrix Anwendung gefunden. Diese Materialien haben sich jedoch nicht in dem gewünschten Umfang durchsetzen können, einmal, da die chemischen Modifizierungen häufig mit einem erheblichen Aufwand verbunden sind und zum anderen, da diese Materialien Proteine unspezifisch binden, thermisch und chemisch relativ instabil sind oder mikrobiell leicht angegriffen werden.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, leicht zugängliche und billige Trägermaterialien im immunoassay einzusetzen, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, im Festphasen-Immunoassay zellulosehaltige Formkörper zu verwenden, die eine hohe Beladungskapazität aufweisen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Formkörper gelöst, die aus Zellulose und/oder ZelMcsederiväten mit 4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen, die durch nucleophile Substitution von 2,4,6-Trich!or-1,3,5-triazin an den OH-Gruppen der Zellulose gebunden wurde, in einer Menge von 1-80 Vol.-% aus 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin in einer Menge von 0,5-50 Vol.-% aus Chloriden bis zu 20 Vol.-% und aus Zellulose oder Zellulosederivaten in einer Menge von 5-80VoI.-% bestehen.

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ie Oberfläche der Formkörper ist zwei- oder dreidimensional für die Beladung mit Antigenen und Antikörpern nutzbar, ach Ablauf der Immunreaktion werden die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende sagenzien gespalten und die mit Antigenen bzw. Antikörpern beladenen Träger wieder im Immunoassay eingesetzt. Die als iste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form. Besonders geeignet sind kugelförmige, anare oder zylindrische Körper, aber auch andere Formen lassen sich verwenden. Das Volumen der Körper beträgt mindestens 01 cm³ und sollte 15cm³ nicht überschreiten. Bei Flächenkörpern ist weniger das Volumen als eine reproduzierbare, zur erfügung stehende Fläche pro Probe von Bedeutung. Diese sollte 0,001 cm² nicht unter- und 5cm² nicht überschreiten. Die Drmkörper sind kompakt oder hohl, wobei die Hohlräume geschlossen oder offen sind. Die Formkörper können als individuelle latrix für jede Probe zur Verfügung stehen, jedoch auch mehrere Proben gleichzeitig aufnehmen, wobei durch geeignete orrichtungen ein Vermischen derselben vermieden werden muß. Ein besonders zweckmäßig ausgeführter Formkörper ist ein lächenträger mit papierähnlicher Matrix.

ie nicht denaturierenden Medien zur Dissoziation der Antigen-Antikörper-Komplexe können aus den unterschiedlichsten ubstanzen bestehen, die auf unterschiedlichste Art und Weise die multifaktoriellen Bindungen derartiger Komplexe zu spalten ι der Lage sind. Hierzu sind vor allem stark saure Puffer wie HCI-Glyzin-Puffer pH = 2,2-2,8 chaotropische Ionen, wie MgCI₂, SCN, NaJ sowie die Polarität des Puffers reduzierende Verbindungen wie Dioxan und Äthylenglykol zu rechnen, /ichtig für die praktische Durchführung des Assays ist hierbei, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Formkörper leicht j handhaben sind und eine hinreichend große und definierte Oberfläche besitzen. Der so mit dem Antikörper bzw. dem ,ntigen geladene Träger wird dann als feste Phase im (Enzym)-Immunoassay eingesetzt. Nach Ablauf der Immunreaktion rerden die gebundenen Immunreaktariden durch die beschriebenen, die Dissoziation herbeiführenden, Agenzien abgespalten, ο daß das gebundene Antigen bzw. der Antikörper für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfügung stehen, esonders praktikabel gestaltet sich die Durchführung von Immunoassays auf den Flächenträgern mit papierähnlicher Matrix jr screening-Untersuchungen oder (monoklonale) Antikörper-Testungen. Derartige plane Träger bieten ausreichend Platz für ine große Zahl von Proben. Wichtig ist hierbei, daß die für Antigen- oder Antikörper-Bindung zur Verfügung stehenden lachen für alle Proben identisch sind, da nur dann ein quantitativer oder semiquantitativer Vergleich derselben möglich ist. 'on Bedeutung ist weiterhin, daß durch geeignete Maßnahmen ein Ineinanderlaufen der individuellen P/oben ausgeschlossen /ird. Beide Bedingungen können auf einfache Art und Weise durch Anwendung geeigneter Hydrophobierungsmittel, Schaffung on Probenvertiefungen oder durch Anwendung von Auftragestempeln.realisjert werden. )as erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:

- Durch die Bindung von Antigenen bzw. Antikörpern an die erfindungsgemäßen Formkörper lassen sich wesentlich höhere Beladungsdichten erzielen.

'f- Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Immunreaktanden während der notwendigen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert.

- Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer erheblichen Reduzierung der Kosten in der klinischen Praxis. Einmal, da

; die als Einweggefäße benutzten Plastematerialien abgelöst werden, und zum anderen, da die mitunter sehr wertvollen und ¹ teuren Proteine eingespart werden.

- Durch die Immobilisierung der Antigene bzw. Antikörper auf den erfindungsgemäßen Formkörpem ergeben sich neue Aspekte der Fertigung einfach zu handhabender und standardisierter Testkits für kommerzielle Hersteller.

m folgenden wird die Erfindung durch einige Beispiele erläutert.

Vusführungsbeispieie

3eispiel 1

Ein Flächenträger mit papierähnlicher Matrix gemäß der Erfindung wird mit humanem Immunglobulin G, welches mit ¹²⁵J adioaktiv markiert ist, in verschiedenen Konzentrationen und Puffersystemen versetzt und 16h bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 enthält, werden die eventuell noch überschüssigen reaktiven jruppen mit 1 m Äthanolaminlösung blockiert. Nach erneutem Waschen mit obigem PBS-Puffer wird die gebundene ^Droteinmenge durch Messung der Radioaktivität ermittelt. Zur Ermittlung möglicher Desorptionen werden die Proben inschließend erneut siebenmal mit PBS-Puffer gewaschen. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 dargestellt. Die so beladenen ^:lächenträger werden danach zur Ermittlung der Immunreaktivität mit einem Konjugat bestehend aus einem Kaninchenäntihuman IgG und dem Enzym alkalische Phosphatase versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem /Vaschen wird die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase durch Hydrolyse von 4-Nitrophenylphosphat in 0,5ml DiäthanolaminpufferpH9,8 und photometrische Messung des Enzymproduktes bei 405 nm nach Stoppen mit 1 η NaOH aestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays werden die Flächenträger zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend in Mehrfachbestimmungen mit einer der folgenden Dissoziationsreagenzien für 1 h bei 4°C versetzt. 1) PBS-Puffer, 2m an NaCI, 5% Dioxan enthaltend, 2) 1m KSCN 3) 3m KSCN 4) 4,5m MgCl₂ 5) 1 m NaJ 6) HCI-Glyzin-Puffer pH2,8. Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem IgG beladenen Flächenträger erneut im Enzymimmunoassay eingesetzt werden können.

Tabelle 1 Puffer Protein

1 ng/ml 10 ng/ml 30ng/m!

3x waschen 10x waschen 3x waschen 10x waschen 3x waschen 10x waschen

0,1 m Phosphat-Puffer+5%

Essigsäure pH 3,5 78ng/cm² 74ng/cm² 584 ng/cm² 5S0ng/cm² 2041 ng/cm² 1961 ng/cm²

0,1 m Acetat-Puffer pH 5 51 ng/cm² 51 ng/cm² 598 ng/cm² 582 ng/cm² 1884 ng/cm² 1881 ng/cm² 0,1 m Phosphat-Puffer pH 7 37 ng/cm² 95 ng/cm² 1502 ng/cm² 1497 ng/cm² 4 472 ng/cm² 4 535 ng/cm²

Beispiel 2

Flächenförmige erfindungsgemäße Formkörper (F = 56mm²) werden, wie in Beispiel -1 beschrieben, mit humanem Faktor Viii beladen. Diese Träger werden in Polystyrol-Mikrotitrations-Platten oder Polystyrol-Röhrchen überführt und im folgenden Enzymimmunoassay zur Bestimmung von F Vlll-Antigen (W. Schößler, M. Stepanauskas, Chr. Dittrich, H. Heine: Acta biol. med. germ. 41 (1982) 263; W.Schößler, M.Stepanauskas, Chr.Dittrich: Acta biol. med. germ. 41 [1982] 695) in der beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Hierzu werden die Formkörper mit einem Inkubationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem im Überschuß vorhandenen Kaninchen-anti-human-Faktor Vlll-Antikörper, versetzt und 6 h bei 37°C ihkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer, pH7,4, der 0,05% Tween 20 enthält, werden 200μΙ eines Konjugates, bestehend aus einem Hammel-anti-Kaninchen-IgG und dem Enzym alkalische Phosphatase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Abspaltung der gebundenen Antikörper erfolgt mit einem der in Beispiel 1 angeführten Dissoziationsreagenzien, so daß die mit Faktor VIII beladenen Träger erneut im Immunoassay eingesetzt werden können

Beispiel 3

Ein erfindungsgemäßer Flächenträger mit papierähnlicher Matrix wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit humanem Faktor VIII beladen. Dieser Träger dient im folgenden als Modell für screening-Untersuchungen auf (monoklonale) Antikörper. Nach Ausführung der Waschvorgänge, die sich bei diesem Flächenträger besonders einfach gestalten, werden die zu untersuchenden und zu bestimmenden Substanzen mit einem geeigneten Auftragestempel punktförmig aufgetragen. In unserem Fall dienten hierzu geeignete Verdünnungen eines Kaninchen-anti-human-Faktor Vlll-Antiserums bzw. eines Kaninchenserums als Negativkontrolle als Antikörperquelle. Nach einer Inkubation von 4-6h bei 37°C wird der Flächenträger erneut gewaschen und mit einem Schaf-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt mit dem Enzym Peroxydase, 4h bei 37°C oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, erneut mehrmals gewaschen und die Enzymaktivität mit einem geeigneten Nachweissystem, so z. B. 4mM 0-Phenylendiamin und 1,5mM H₂O₂ durch visuelle Auswertung der entstehenden Färbung bestimmt. Eine positive Färbung weist eindeutig auf einen Antikörper hin.

Claims (5)

1. Erfindungsansprüche:

   1. Festphasen-Immunoassay zur immunologischen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Viren, Hormonen und Pharmaka etc. durch Fixierung der komplementären Antikörper oder Antigene an zellulosehaltigen Materialien als feste Phase, Durchführung der Immunreaktion, Spaltung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende Reagenzien und Wiedereinsatz der beladenen festen Phasen im Immunoassay, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phase Formkörper verwendet werden, die aus Zellulose und/oder Zellulosederivaten mit 4,6-Dich!or-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80Vol.-%, aus 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin in einer Menge von 0,5-50Vol.-%, aus Chloriden in einer Menge bis zu 20Vol.-% und aus Zellulose und/oder Zellulosederivaten in einer Menge von 5-80VoI.-% bestehen, wobei die Oberfläche der Formkörper zwei- oder dreidimensional für die Beladung nutzbar ist.
2. 2. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die im Immunoassay eingesetzten dreidimensional nutzbaren Formkörper halbkugelförmige, kugelförmige, würfelförmige oder zylinderförmige Gestalt haben, daß sie sowohl Kompakt- als auch Hohlkörper sind, daß die Hohlkörper offen oder geschlossen sind und daß das Volumen der Formkörper 0,01 cm³-15cm³ beträgt.
3. 3. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweidimensional nutzbaren Formkörper Flächenträger sind, deren Oberfläche für regelmäßige und definierte Bezirke nutzbar ist, wobei diese Bezirke eine Größe von 0,001 cm²-5cm² besitzen.
4. 4. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellulose bzw. die Zellulosederivate teilweise oder vollständig faserförmige Partikel sind.
5. 5. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1 und 3,dadurch gekennzeichnet, daß die Flächenträger eine papierähnliche Matrix aufweisen.