DD225795A1 - SOLID PHASE IMMUNOASSAY OF CELLULOSIC MATERIALS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikoerpern, Haptenen usw. an zellulosehaltigen Materialien. Ziel der Erfindung ist es, leicht zugaengliche und billige Traegermaterialien im Immunoassay zu verwenden, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen. Die Erfindung hat die Aufgabe, im Festphasen-Immunoassay zellulosehaltige Formkoerper mit hoher Beladungskapazitaet zu verwenden. Erfindungsgemaess wurde die Aufgabe durch Formkoerper geloest, die aus Zellulose und/oder Zellulosederivaten mit 4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol.-%, aus 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin in einer Menge von 0,5-50 Vol.-%, aus Chloriden in einer Menge bis zu 20 Vol.-% und aus Zellulose und/oder Zellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol.-% bestehen. Der Immunoassay wird in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin sowie der Biotechnologie angewendet.The invention relates to a solid phase immunoassay for the determination of antigens and antibodies, haptens, etc. on cellulosic materials. The aim of the invention is to use readily accessible and inexpensive carrier materials in the immunoassay, which can be regenerated easily, quickly and reproducibly for reuse. The invention has the object to use in solid phase immunoassay cellulosic molding with high loading capacity. According to the invention, the object was achieved by moldings consisting of cellulose and / or cellulose derivatives with 4,6-dichloro-1,3,5-triazine groupings in an amount of 1-80% by volume, from 2,4,6- Trihalogen-1,3,5-triazine in an amount of 0.5-50 vol .-%, of chlorides in an amount up to 20 vol .-% and of cellulose and / or cellulose derivatives in an amount of 5-80 vol .-% consist. The immunoassay is used in the pharmaceutical industry, medicine and biotechnology.
Description
Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, Haptenen etc. an !zellulosehaltige) Träger unter wiederholtem und reproduzierbarem Einsatz im (Enzym)-Immunoassay. Das Verfahren findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschafiiichen Forschung sowie der BioteohQologie.The invention relates to a solid-phase immunoassay for the determination of antigens and antibodies, haptens, etc., to cellulosic carriers with repeated and reproducible use in the (enzyme) immunoassay. The method is used in the pharmaceutical industry, medicine, bioscience research and biotechnology.
Die An'wendung von Immunoassays zur spezifischen und empfindlichen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Viren etc. hat in den letzten Jahren sowohl in der klinischen Routinediagnostik als auch in der medizinischen und biowissenschaftlichen Forschung große Bedeutung erlangt, wobei sich der Anwendungsbereich dieser Methoden in den nächsten Jahren erheblich erweitern wird. Am häufigsten angewandt wird hierbei die sogenannte Festphasentechnik („solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden ist und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K. J.Catt und G.W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der ädsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyrol, Polyäthylen, PVC u.a., genutzt (Übersicht: J.E.Herrmann, in: Methods in Enzymology 73 [1981] 239)The use of immunoassays for the specific and sensitive determination of antigens, antibodies, haptens, viruses, etc. has become very important in recent years in routine clinical diagnostics as well as in medical and life sciences research, the scope of these methods being in will expand significantly in the next few years. Most commonly used is the so-called solid-phase technique, in which one of the immunological reactants is bound to a solid phase, thus allowing easy separation of the formed antigen-antibody complexes from the free, unbound reactants For example, the method of adsorptive binding of proteins to solid plastic phases, preferably polystyrene, polyethylene, PVC, etc., which is based on KJCatt and GWTregear (Science 15 [1967] 1570), is used almost exclusively (review: JEHerrmann, in: Methods in Enzymology 73 [1981] 239)
Nachteile dieses Verfahrens sind: Disadvantages of this method are:
— Die Beladungsdichte an Plastematerialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial, die zur Verfugung stehende Oberfläche sowie die Größe des Proteins limitiert.- The loading density of plastic materials and thus the sensitivity of the immunoassay are limited by the respective plastic material, the available surface and the size of the protein.
— Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J.E.Herrmann, R.M.Hendry, M.F.Collins: J.CIin. Microbiol. 10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W.Schößler, G.Wegner: Z. med. Labordiagn. 24 [1983] 177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.- During the individual incubation and washing procedures in the immunoassay significant amounts of protein (68% in virus antigens: JEHerrmann, RMHendry, MFCollins: J.CIin.Microbiol.10 [1979] 210; 50% in the case of antibodies: W. Schossler, G .Wegner: Z. med., Labordiagn., 24 [1983] 177). Such desorptions, in turn, adversely affect the sensitivity and decisively determine the error of the method.
— Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so daß sehr wertvolle und nur aufwendig zu präparierende Proteine verloren gehen.- The loaded with proteins plastic materials can be used only once after the immune reaction, so that very valuable and expensive to be prepared proteins are lost.
— Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probenzahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.The use of these plastic materials as disposable containers represents a not inconsiderable economic factor for larger numbers of samples in clinical routine.
— Die Möglichkeiten einer Standardisierung sind bei diesem Verfahren begrenzt.- The possibilities of standardization are limited in this method.
Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, beschrieben verschiedene Autoren den Einsatz chemisch modifizierter Träger zur kovalenten Kopplung von Proteinen im Immunoassay (Übersicht: J.E.Herrmann, in: Methods in Enzymology 73 [1981] 239). Von derartigen Materialien haben insbesondere Zellulose, Dextrane, Agar und dessen Derivate (Übersicht: S.Fuchs, M.SeIa, in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford 1978) neben PolyacrylsäureDerivaten, substituierten Polystyrolen oder Nylon (R.M.Hendry, J.E.Herrmann: J. immunol. methods 35 [1980] 285) als Matrix Anwendung gefunden. Diese Materialien haben sich jedoch nicht in dem gewünschten Umfang durchsetzen können, einmal, da die chemischen Modifizierungen häufig mit einem erheblichen Aufwand verbunden sind und zum anderen, da diese Materialien Proteine unspezifisch binden, thermisch und chemisch relativ instabil sind oder mikrobiell leicht angegriffen werden.To circumvent these difficulties, several authors have described the use of chemically modified carriers for the covalent coupling of proteins in the immunoassay (for review: J. E. Hirmann, in: Methods in Enzymology 73 [1981] 239). Of such materials, in particular cellulose, dextrans, agar and its derivatives (review: S.Fuchs, M. Seia, in: Handbook of Experimental Immunology (DM Weir ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford 1978) have in addition to polyacrylic acid derivatives, substituted polystyrenes or nylon (RMHendry, JEherrmann: J. Immunol., Methods 35 [1980] 285) found as a matrix application. However, these materials have not been able to assert themselves to the desired extent, once, because the chemical modifications are often associated with considerable effort and, secondly, because these materials bind proteins nonspecifically, are thermally and chemically relatively unstable or are easily attacked microbially.
Es ist Ziel der Erfindung, leicht zugängliche und billige Trägermaterialien im immunoassay einzusetzen, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.It is an object of the invention to use easily accessible and inexpensive carrier materials in the immunoassay, which can be easily, quickly and reproducibly regenerated for reuse.
Die Erfindung hat die Aufgabe, im Festphasen-Immunoassay zellulosehaltige Formkörper zu verwenden, die eine hohe Beladungskapazität aufweisen.The invention has the object to use in solid phase immunoassay cellulosic moldings having a high loading capacity.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Formkörper gelöst, die aus Zellulose und/oder ZelMcsederiväten mit 4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen, die durch nucleophile Substitution von 2,4,6-Trich!or-1,3,5-triazin an den OH-Gruppen der Zellulose gebunden wurde, in einer Menge von 1-80 Vol.-% aus 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin in einer Menge von 0,5-50 Vol.-% aus Chloriden bis zu 20 Vol.-% und aus Zellulose oder Zellulosederivaten in einer Menge von 5-80VoI.-% bestehen.According to the invention, the object is achieved by moldings composed of cellulose and / or cellulose derivatives with 4,6-dichloro-1,3,5-triazine groups, which are prepared by nucleophilic substitution of 2,4,6-trichloro-1,3 , 5-triazine was bonded to the OH groups of the cellulose in an amount of 1-80% by volume of 2,4,6-trihalo-1,3,5-triazine in an amount of 0.5-50 Vol .-% of chlorides up to 20 vol .-% and of cellulose or cellulose derivatives in an amount of 5-80VoI .-% consist.
- 2 - züz zt)4 υ- 2 - zzz zt) 4 υ
ie Oberfläche der Formkörper ist zwei- oder dreidimensional für die Beladung mit Antigenen und Antikörpern nutzbar, ach Ablauf der Immunreaktion werden die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende sagenzien gespalten und die mit Antigenen bzw. Antikörpern beladenen Träger wieder im Immunoassay eingesetzt. Die als iste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form. Besonders geeignet sind kugelförmige, anare oder zylindrische Körper, aber auch andere Formen lassen sich verwenden. Das Volumen der Körper beträgt mindestens 01 cm3 und sollte 15cm3 nicht überschreiten. Bei Flächenkörpern ist weniger das Volumen als eine reproduzierbare, zur erfügung stehende Fläche pro Probe von Bedeutung. Diese sollte 0,001 cm2 nicht unter- und 5cm2 nicht überschreiten. Die Drmkörper sind kompakt oder hohl, wobei die Hohlräume geschlossen oder offen sind. Die Formkörper können als individuelle latrix für jede Probe zur Verfügung stehen, jedoch auch mehrere Proben gleichzeitig aufnehmen, wobei durch geeignete orrichtungen ein Vermischen derselben vermieden werden muß. Ein besonders zweckmäßig ausgeführter Formkörper ist ein lächenträger mit papierähnlicher Matrix.The surface of the moldings can be used two- or three-dimensionally for loading with antigens and antibodies. After the immune reaction has elapsed, the antigen-antibody complexes formed are split by the dissociation-inducing sagences and the carriers loaded with antigens or antibodies are used again in the immunoassay. The moldings used as the iste phase have a different geometric shape. Particularly suitable are spherical, anare or cylindrical bodies, but other shapes can be used. The volume of the body is at least 01 cm 3 and should not exceed 15cm 3 . In the case of sheet bodies, less volume than a reproducible available area per sample is of importance. This should 0.001 cm2 not fall below 5 cm 2 not exceed. The Drmkörper are compact or hollow, with the cavities are closed or open. The moldings can be available as individual matrix for each sample, but can also accommodate several samples at the same time, whereby mixing must be avoided by suitable means. A particularly suitably executed molded body is a smile carrier with a paper-like matrix.
ie nicht denaturierenden Medien zur Dissoziation der Antigen-Antikörper-Komplexe können aus den unterschiedlichsten ubstanzen bestehen, die auf unterschiedlichste Art und Weise die multifaktoriellen Bindungen derartiger Komplexe zu spalten ι der Lage sind. Hierzu sind vor allem stark saure Puffer wie HCI-Glyzin-Puffer pH = 2,2-2,8 chaotropische Ionen, wie MgCI2, SCN, NaJ sowie die Polarität des Puffers reduzierende Verbindungen wie Dioxan und Äthylenglykol zu rechnen, /ichtig für die praktische Durchführung des Assays ist hierbei, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Formkörper leicht j handhaben sind und eine hinreichend große und definierte Oberfläche besitzen. Der so mit dem Antikörper bzw. dem ,ntigen geladene Träger wird dann als feste Phase im (Enzym)-Immunoassay eingesetzt. Nach Ablauf der Immunreaktion rerden die gebundenen Immunreaktariden durch die beschriebenen, die Dissoziation herbeiführenden, Agenzien abgespalten, ο daß das gebundene Antigen bzw. der Antikörper für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfügung stehen, esonders praktikabel gestaltet sich die Durchführung von Immunoassays auf den Flächenträgern mit papierähnlicher Matrix jr screening-Untersuchungen oder (monoklonale) Antikörper-Testungen. Derartige plane Träger bieten ausreichend Platz für ine große Zahl von Proben. Wichtig ist hierbei, daß die für Antigen- oder Antikörper-Bindung zur Verfügung stehenden lachen für alle Proben identisch sind, da nur dann ein quantitativer oder semiquantitativer Vergleich derselben möglich ist. 'on Bedeutung ist weiterhin, daß durch geeignete Maßnahmen ein Ineinanderlaufen der individuellen P/oben ausgeschlossen /ird. Beide Bedingungen können auf einfache Art und Weise durch Anwendung geeigneter Hydrophobierungsmittel, Schaffung on Probenvertiefungen oder durch Anwendung von Auftragestempeln.realisjert werden. )as erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:The non-denaturing media for the dissociation of the antigen-antibody complexes can consist of the most diverse substances which are capable of cleaving the multifactorial bonds of such complexes in the most diverse ways. Strong acidic buffers such as HCI-glycine buffer pH = 2.2-2.8 chaotropic ions, such as MgCl 2 , SCN, NaJ and the polarity of the buffer-reducing compounds, such as dioxane and ethylene glycol, are especially to be expected for this purpose Practical implementation of the assay here is that the moldings to be used according to the invention are easy to handle and have a sufficiently large and defined surface. The carrier thus loaded with the antibody or the required carrier is then used as the solid phase in the (enzyme) immunoassay. After the immune reaction has ended, the bound immunoreactants are cleaved off by the described agents which cause the dissociation, that the bound antigen or the antibody is available for renewed use in the immunoassay; it is particularly practicable to carry out immunoassays on the surface carriers paper-like matrix jr screening tests or (monoclonal) antibody tests. Such planar carriers provide sufficient space for a large number of samples. It is important here that the laughs available for antigen or antibody binding are identical for all samples, since only then a quantitative or semiquantitative comparison of the same is possible. On the other hand, it is important that suitable measures be taken to exclude the overlapping of the individual P / above. Both conditions can be easily realized by the use of suitable hydrophobing agents, creation of sample wells or application of stamps. The method according to the invention is characterized by a number of advantages:
- Durch die Bindung von Antigenen bzw. Antikörpern an die erfindungsgemäßen Formkörper lassen sich wesentlich höhere Beladungsdichten erzielen.- By binding of antigens or antibodies to the moldings of the invention can be achieved significantly higher loading densities.
'f- Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Immunreaktanden während der notwendigen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert. 'f- The immobilization occur no desorption of Immunreaktanden during the necessary incubation and washing processes in the immunoassay. This significantly reduces the methodological error.
- Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer erheblichen Reduzierung der Kosten in der klinischen Praxis. Einmal, daThe method according to the invention leads to a considerable reduction of costs in clinical practice. Once, there
; die als Einweggefäße benutzten Plastematerialien abgelöst werden, und zum anderen, da die mitunter sehr wertvollen und 1 teuren Proteine eingespart werden.; The plastic materials used as disposable containers are replaced, and on the other hand, since the sometimes very valuable and expensive 1 proteins are saved.
- Durch die Immobilisierung der Antigene bzw. Antikörper auf den erfindungsgemäßen Formkörpem ergeben sich neue Aspekte der Fertigung einfach zu handhabender und standardisierter Testkits für kommerzielle Hersteller.The immobilization of the antigens or antibodies on the moldings according to the invention results in new aspects of the production of easy-to-handle and standardized test kits for commercial manufacturers.
m folgenden wird die Erfindung durch einige Beispiele erläutert.In the following, the invention will be explained by some examples.
3eispiel 1Example 1
Ein Flächenträger mit papierähnlicher Matrix gemäß der Erfindung wird mit humanem Immunglobulin G, welches mit 125J adioaktiv markiert ist, in verschiedenen Konzentrationen und Puffersystemen versetzt und 16h bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 enthält, werden die eventuell noch überschüssigen reaktiven jruppen mit 1 m Äthanolaminlösung blockiert. Nach erneutem Waschen mit obigem PBS-Puffer wird die gebundene Droteinmenge durch Messung der Radioaktivität ermittelt. Zur Ermittlung möglicher Desorptionen werden die Proben inschließend erneut siebenmal mit PBS-Puffer gewaschen. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 dargestellt. Die so beladenen :lächenträger werden danach zur Ermittlung der Immunreaktivität mit einem Konjugat bestehend aus einem Kaninchenäntihuman IgG und dem Enzym alkalische Phosphatase versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem /Vaschen wird die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase durch Hydrolyse von 4-Nitrophenylphosphat in 0,5ml DiäthanolaminpufferpH9,8 und photometrische Messung des Enzymproduktes bei 405 nm nach Stoppen mit 1 η NaOH aestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays werden die Flächenträger zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend in Mehrfachbestimmungen mit einer der folgenden Dissoziationsreagenzien für 1 h bei 4°C versetzt. 1) PBS-Puffer, 2m an NaCI, 5% Dioxan enthaltend, 2) 1m KSCN 3) 3m KSCN 4) 4,5m MgCl2 5) 1 m NaJ 6) HCI-Glyzin-Puffer pH2,8. Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem IgG beladenen Flächenträger erneut im Enzymimmunoassay eingesetzt werden können.A paper-like matrix surface support according to the invention is mixed with human immunoglobulin G labeled adipatively with 125 J in various concentrations and buffer systems and incubated at 37 ° C. for 16 h. After washing three times with PBS buffer, pH 7.4, containing 0.05% Tween 20, any remaining reactive groups are blocked with 1 M ethanolamine solution. After washing again with the above PBS buffer, the bound D is roteinmenge by measuring the radioactivity determined. To determine possible desorptions, the samples are then washed again seven times with PBS buffer. The results are shown in Tab. The loaded so : Smile carrier are then added to determine the immunoreactivity with a conjugate consisting of a rabbit antihuman IgG and the enzyme alkaline phosphatase and incubated overnight at room temperature. After renewed stirring, the enzyme activity of the alkaline phosphatase is assessed by hydrolysis of 4-nitrophenyl phosphate in 0.5 ml diethanolamine buffer pH9.8 and photometric measurement of the enzyme product at 405 nm after quenching with 1 N NaOH. After carrying out the enzyme immunoassay, the surface carriers are washed twice with 0.5 ml of PBS buffer each time and subsequently mixed in multiple determinations with one of the following dissociation reagents for 1 h at 4 ° C. 1) PBS buffer containing 2m NaCl, 5% dioxane, 2) 1m KSCN 3) 3m KSCN 4) 4.5m MgCl 2 5) 1m NaJ 6) HCl glycine buffer pH 2.8. By all these agents, the bound antigen-antibody complexes are cleaved, so that the loaded with human IgG surface carriers can be used again in the enzyme immunoassay.
1 ng/ml 10 ng/ml 30ng/m!1 ng / ml 10 ng / ml 30ng / m!
3x waschen 10x waschen 3x waschen 10x waschen 3x waschen 10x waschenWash 3x 10x Wash 3x Wash 10x Wash 3x Wash 10x Wash
0,1 m Phosphat-Puffer+5%0.1m phosphate buffer + 5%
0,1 m Acetat-Puffer pH 5 51 ng/cm2 51 ng/cm2 598 ng/cm2 582 ng/cm2 1884 ng/cm2 1881 ng/cm2 0,1 m Phosphat-Puffer pH 7 37 ng/cm2 95 ng/cm2 1502 ng/cm2 1497 ng/cm2 4 472 ng/cm2 4 535 ng/cm2 0.1 m acetate buffer pH 5 51 ng / cm 2 51 ng / cm 2 598 ng / cm 2 582 ng / cm 2 1884 ng / cm 2 1881 ng / cm 2 0.1 m phosphate buffer pH 7 37 ng / cm 2 95 ng / cm 2 1502 ng / cm 2 1497 ng / cm 2 4 472 ng / cm 2 4 535 ng / cm 2
Flächenförmige erfindungsgemäße Formkörper (F = 56mm2) werden, wie in Beispiel -1 beschrieben, mit humanem Faktor Viii beladen. Diese Träger werden in Polystyrol-Mikrotitrations-Platten oder Polystyrol-Röhrchen überführt und im folgenden Enzymimmunoassay zur Bestimmung von F Vlll-Antigen (W. Schößler, M. Stepanauskas, Chr. Dittrich, H. Heine: Acta biol. med. germ. 41 (1982) 263; W.Schößler, M.Stepanauskas, Chr.Dittrich: Acta biol. med. germ. 41 [1982] 695) in der beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Hierzu werden die Formkörper mit einem Inkubationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem im Überschuß vorhandenen Kaninchen-anti-human-Faktor Vlll-Antikörper, versetzt und 6 h bei 37°C ihkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer, pH7,4, der 0,05% Tween 20 enthält, werden 200μΙ eines Konjugates, bestehend aus einem Hammel-anti-Kaninchen-IgG und dem Enzym alkalische Phosphatase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Abspaltung der gebundenen Antikörper erfolgt mit einem der in Beispiel 1 angeführten Dissoziationsreagenzien, so daß die mit Faktor VIII beladenen Träger erneut im Immunoassay eingesetzt werden könnenSurface shaped bodies according to the invention (F = 56 mm 2 ) are loaded with human factor Viii as described in Example 1. These carriers are transferred into polystyrene microtitration plates or polystyrene tubes and in the following enzyme immunoassay for the determination of F VIII antigen (W. Schößler, M. Stepanauskas, Chr. Dittrich, H. Heine: Acta biol (1982) 263; W. Schossler, M.Stepanauskas, Chr.Dittrich: Acta biol. Med. Germ. 41 [1982] 695) in the manner described. For this purpose, the tablets are mixed with an incubation mixture consisting of the plasma to be determined and an excess of rabbit anti-human factor VIII antibody and incubated at 37 ° C. for 6 h. After washing again with PBS buffer, pH 7.4, containing 0.05% Tween 20, 200μΙ of a conjugate consisting of a mutant anti-rabbit IgG and the enzyme alkaline phosphatase are added and after several hours of incubation and subsequent washing the enzyme activity, as described in Example 1, determined. The cleavage of the bound antibodies is carried out with one of the dissociation reagents listed in Example 1, so that the carrier loaded with factor VIII can be used again in the immunoassay
Beispiel 3 Example 3
Ein erfindungsgemäßer Flächenträger mit papierähnlicher Matrix wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit humanem Faktor VIII beladen. Dieser Träger dient im folgenden als Modell für screening-Untersuchungen auf (monoklonale) Antikörper. Nach Ausführung der Waschvorgänge, die sich bei diesem Flächenträger besonders einfach gestalten, werden die zu untersuchenden und zu bestimmenden Substanzen mit einem geeigneten Auftragestempel punktförmig aufgetragen. In unserem Fall dienten hierzu geeignete Verdünnungen eines Kaninchen-anti-human-Faktor Vlll-Antiserums bzw. eines Kaninchenserums als Negativkontrolle als Antikörperquelle. Nach einer Inkubation von 4-6h bei 37°C wird der Flächenträger erneut gewaschen und mit einem Schaf-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt mit dem Enzym Peroxydase, 4h bei 37°C oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, erneut mehrmals gewaschen und die Enzymaktivität mit einem geeigneten Nachweissystem, so z. B. 4mM 0-Phenylendiamin und 1,5mM H2O2 durch visuelle Auswertung der entstehenden Färbung bestimmt. Eine positive Färbung weist eindeutig auf einen Antikörper hin.An inventive surface support with paper-like matrix, as described in Example 2, loaded with human factor VIII. This carrier is used in the following as a model for screening tests for (monoclonal) antibodies. After carrying out the washing operations, which are particularly simple in this surface support, the substances to be examined and determined are applied in a punctiform manner with a suitable application stamp. In our case, suitable dilutions of a rabbit anti-human factor VIII anti-serum or of a rabbit serum served as negative control as antibody source. After incubation for 4-6 h at 37 ° C, the surface support is washed again and incubated with a sheep anti-rabbit IgG, coupled with the enzyme peroxidase, 4 h at 37 ° C or overnight at room temperature, washed several times and the Enzyme activity with a suitable detection system, such. B. 4mM 0-phenylenediamine and 1.5mM H 2 O 2 determined by visual evaluation of the resulting color. A positive staining clearly indicates an antibody.
Claims (5)
Priority Applications (7)
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| DE8484109485T DE3472112D1 (en) | 1983-08-09 | 1984-08-09 | Macromolecular compositions including chemically active fillers, process for their production and their use |
| EP84109485A EP0134025B1 (en) | 1983-08-09 | 1984-08-09 | Macromolecular compositions including chemically active fillers, process for their production and their use |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0222146A2 (en) * | 1985-10-16 | 1987-05-20 | Fresenius AG | Selective adsorbent for binding immunocouplers |
-
1984
- 1984-04-24 DD DD26226484A patent/DD225795A1/en not_active IP Right Cessation
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |