DD218189A1

DD218189A1 - SOLID PHASE IMMUNOASSAY FOR THE DETERMINATION OF ANTIGEN AND ANTIBODY ON GLASS SURFACES

Info

Publication number: DD218189A1
Application number: DD25384883A
Authority: DD
Inventors: Werner Schoessler; Christa Dittrich; Klaus Gulde
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1983-09-10
Filing date: 1983-09-10
Publication date: 1985-01-30

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen, Antikoerpern, Haptenen, Viren, Hormonen Pharmaka etc. Das Ziel der Erfindung ist es, billige Traegermaterialien zu verwenden, die wiederholt eingesetzt werden koennen. Aufgabe der Erfindung ist es, siliziumdioxidhaltige Materialien einzusetzen. Erfindungsgemaess erfolgt dies durch siliziumdioxidhaltige Formkoerper, deren Oberflaechen zwei- oder dreidimensional nutzbar sind. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.The invention relates to a solid-phase immunoassay for the determination of antigens, antibodies, haptens, viruses, hormones drugs, etc. The aim of the invention is to use cheap carrier materials which can be used repeatedly. The object of the invention is to use siliceous materials. According to the invention, this is done by siliceous moldings, the surfaces of which can be used two or three dimensionally. The assay is used in the pharmaceutical, medical, life sciences and biotechnology industries.

Description

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Festphasen — Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern an GlasoberflächenSolid phase immunoassay for the determination of antigens and antibodies on glass surfaces

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft einen Feslphasen-Immunoassay zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, Haptenen etc. an silmumdioxidhaltigen Formkörpern, vorzugsweise aus Glas unter wiederholtem Einsatz im (Enzym)-Immunoassay. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.The invention relates to a Feslphasen-immunoassay for the determination of antigens and antibodies, haptens, etc. silmumdioxidhaltigen moldings, preferably glass with repeated use in (Enzyme) immunoassay. The assay is used in the pharmaceutical, medical, life sciences and biotechnology industries.

Characteristic of the known technical solutions

Immunoassays sind Verfahren zur spezifischen und sensitiven qualitativen und quantitativen Analyse eines Stoffes in einer Flüssigkeit unter Anwendung der für diesen Stoff spezifischen Antikörper. Derartige Verfahren haben in den letzten Jahren in der medizinischen Praxis große Bedeutung erlangt.Immunoassays are methods for the specific and sensitive qualitative and quantitative analysis of a substance in a liquid using antibodies specific for this substance. Such methods have become very important in medical practice in recent years.

Unter den zahlreichen beschriebenen Varianten hat die sogenannte Festphasentechnik („solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden ist und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht, eine weite Verbreitung gefunden. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K. J.Catt und G.W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der adsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyrol angewandt (Übersicht: J.E.Herrmann in: Methods in Enzymology 73 11981] S.239). Nachteile dieses Verfahrens sind:Among the numerous variants described, the so-called solid-phase technique, in which one of the immunological reactants is bound to a solid phase and thus allows easy separation of the formed antigen-antibody complexes from the free, unbound reactants, At present, almost exclusively the method of adsorptive binding of proteins to solid plastic phases, preferably polystyrene, which is based on KJCatt and GWTregear (Science 15 [1967] 1570) is currently used (review: JEHerrmann in: Methods in Enzymology 73 11981 ] P.239) Disadvantages of this method are:

— Die Beladungsdichte an den Plastematerialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial und die zur Verfügung stehende Oberfläche limitiert.- The loading density of the plastic materials and thus the sensitivity of the immunoassay are limited by the respective plastic material and the available surface.

— Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J.E.Herrmann et al.J.CIin.Microbiol.10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W.Schößler, G.Wegner: Z.med. Labordiagn.24 [1983] 3,177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.- During the individual incubation and washing procedures in the immunoassay significant amounts of protein (68% for virus antigens: JEHerrmann et al.J.CIin.Microbiol.10 [1979] 210, 50% for antibodies: W. Schößler, G.Wegner: Z .med. Labordiagn. 24 [1983] 3,177). Such desorptions, in turn, adversely affect the sensitivity and decisively determine the error of the method.

— Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so daß sehr wertvolle und nur aufwändig zu präparierende Proteine verloren gehen.- The loaded with proteins plastic materials can be used only once after the immune reaction, so that very valuable and only consuming to be prepared proteins are lost.

— Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probezahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.The use of these plastic materials as disposable containers represents a not inconsiderable economic factor for larger numbers of samples in clinical routine.

In der Patentanmeldung (WP GOI N/249992) wurde ein Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von zirkulierenden Immunkomplexen unter kovalenter Bindung des Proteins C1q an siliziumdioxidhaltige Materialien, vorzugsweise Glas, beschrieben.In the patent application (WP GOI N / 249992), a solid-phase immunoassay for the determination of circulating immune complexes covalently bonding the protein C1q to siliceous materials, preferably glass, has been described.

Dieses Verfahren beruht auf der seit langem bekannten Tatsache, daß die OH-Gruppen auf SiO₂-Oberflächen als Angriffspunkte für chemische Agenzien, insbesondere Organosilanen mit unterschiedlichen Funktionellen Gruppen, zur Verfügung stehen. Während die silikofunktionelle Gruppe mit dem Glas reagiert, steht die organofunktionelle Gruppe den üblichen chemischen Reaktionen unter Verwendung von Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, Isothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen zur Verfügung, so daß diese Verbindungen als Brücke zwischen der anorganischen Matrix und der organischen/ biochemischen Verbindung fungieren.This method is based on the long-known fact that the OH groups on SiO ₂ surfaces are available as targets for chemical agents, in particular organosilanes with different functional groups available. While the silicofunctional group reacts with the glass, the organofunctional group is available for the usual chemical reactions using amino, carbonyl, carboxy, isocyano, diazo, isothiocyano, sulfhydryl or nitroso groups, so that these Compounds act as a bridge between the inorganic matrix and the organic / biochemical compound.

In erwähnter Patentanmeldung (WP GO1 N/249992) konnte gezeigt werden, daß durch die kovalente Bindung des Proteins C1q an Glasoberflächen dieses durch Anwendung nicht denaturierender Medien wiederholt und reproduzierbar im Immunoassay eingesetzt werden kann. Allerdings wurde dieses Verfahren dadurch begünstigt, daß die Bindung zirkulierender Immunkomplexe oder von aggregiertem IgG an C1q vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen über den Fc-TeiI des Immunglobulins erfolgt und somit eine Abspaltung der gebundenen Immunreaktanden durch einfache Änderung der lonenstärke des Mediums erzielt werden konnte.In the cited patent application (WP GO1 N / 249992) it could be shown that by the covalent binding of the protein C1q on glass surfaces this can be used repeatedly and reproducibly in the immunoassay by non-denaturing media. However, this method was favored by the fact that the binding of circulating immune complexes or aggregated IgG to C1q preferably takes place via electrostatic interactions via the Fc part of the immunoglobulin and thus cleavage of the bound immunoreactants could be achieved by simply changing the ionic strength of the medium.

Wesentlich komplizierter stellen sich die Verhältnisse bei spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen dar, bei denen durch eine Vielzahl unterschiedlichster nichtkovalenter Wechselwirkungen beträchtliche Bindungsstärken erreicht werden. Derartige Antigen-Antikörper-Komplexe lassen sich oft nur unter Anwendung relativ drastischer Medien dissoziieren, wobei nicht selten einer oder beide Reaktionspartner denaturiert werden. So ist eine vollständige Dissoziation derartiger Komplexe nur im stark sauren (pH < 2,4) oder stark alkalischen (pH > 13) pH-Bereich zu erzielen, wobei die Dissoziationsgeschwindigkeit zwischen 1 h bis mehreren Tagen liegen kann. Es ist einleuchtend, daß derartige Dissoziationszeiten nicht nur die Gefahr von Proteindenaturierungen verstärken, sondern auch für eine Anwendung in der klinischen Praxis nicht praktikabel sind.Significantly more complicated are the conditions in specific antigen-antibody reactions in which considerable bond strengths are achieved by a large number of different noncovalent interactions. Often, such antigen-antibody complexes can only be dissociated using relatively drastic media, often denaturing one or both reactants. Thus, a complete dissociation of such complexes can be achieved only in the strongly acidic (pH <2.4) or strongly alkaline (pH> 13) pH range, the dissociation rate can be between 1 h to several days. It is evident that such dissociation times not only increase the risk of protein denaturation, but are also impractical for use in clinical practice.

Object of the invention

Es ist Ziel der Erfindung, allgemein zugänglich und billige Trägermaterialien unter Nutzung der kovalenten Bindung von Proteinen im Immunoassay einzusetzen, die sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.It is an object of the invention to provide generally accessible and inexpensive support materials using the covalent bonding of proteins in the immunoassay, which can be easily, quickly and reproducibly regenerated for reuse.

Explanation of the essence of the invention

Die Erfindung hat die Aufgabe, siliziumdioxidhaltige Trägermaterialien, vorzugsweise Glas, als feste Phase im Festphasen-Immunoassay einzusetzen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch siliziumdioxidhaltige Formkörper, deren Oberflächen /wi)i- odor dreidimensional nutzbar sind und die nach vorheriger an sich bekannter chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaflmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien mit Antigenen oder Antikörpern beladen werden und nach Ablauf der Immunreaktion die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Dissoziation herbeiführende Reagenzien gespalten und die mit Antigenen bzw. Antikörpern beladenen Formkörper wieder im Immunoassay eingesetzt werden, gelöst. Die als feste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form. Besonders geeignet sind kugelförmige, planere oder zylindrische Körper, aber auch würfelförmige oder kegelförmige lassen sich verwenden. Das Volumen der Körper beträgt mindestens 0,1 cm³ und sollte 15cm³ nicht überschreiten. Bei planeren Glaskörpern ist weniger das Volumen als eine reproduzierbare, zur Verfügung stehende Fläche pro Probe von Bedeutung. Diese sollte 0,001 cm² nicht unter- und 5cm² nicht überschreiten. Die Formkörper sind kompakt oder hohl, wobei die Hohlräume geschlossen oder offen sind. Die Formkörper können als individuelle Matrix für jede Probe zur Verfügung stehen, jedoch auch mehrere Proben gleichzeitig aufnehmen, wobei durch geeignete Vorrichtungen ein Vermischen derselben vermieden werden muß. Das siliziumdioxidhaltige Material ist im wesentlichen Glas, wobei die Zusammensetzung unterschiedlich sein kann. Es muß nur gewährleistet sein, daß sich genügend Si-OH-Giuppen auf der Oberfläche befindenThe object of the invention is to use silicon dioxide-containing carrier materials, preferably glass, as the solid phase in the solid-phase immunoassay. According to the invention, the object is achieved by siliceous moldings whose surfaces are / are usable in three dimensions and which are loaded with silane coupling agents and hetero- or homobifunctional reagents with antigens or antibodies according to previously known chemical surface modification and, after the immune reaction has ended, the antigen formed Antibody complexes cleaved by the dissociation-inducing reagents and loaded with antigens or antibodies moldings are used again in immunoassay solved. The molded bodies used as a solid phase have a different geometric shape. Particularly suitable are spherical, planar or cylindrical bodies, but also cubic or conical can be used. The volume of the body is at least 0.1 cm ³ and should not exceed 15cm ³ . In the case of planar glass bodies, less volume than a reproducible, available area per sample is of importance. This should 0.001 ^cm2 not fall below 5 cm ² not exceed. The moldings are compact or hollow, with the cavities closed or open. The moldings can be available as an individual matrix for each sample, but can also accommodate several samples at the same time, whereby mixing must be avoided by means of suitable devices. The siliceous material is essentially glass, which composition may be different. It only needs to be ensured that there are enough Si-OH groups on the surface

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Die nicht denaturierenden Medien zur Dissoziation der Antigen-Antikörper-Komplexe können aus den verschiedensten Substanzen bestehen, die auf unterschiedliche Art und Weise die multifaktoriellen Bedingungen derartiger Antigen-Antikörper-Komplexe zu spalten in der Lage sind. Hierzu sind vor allem stark saure Puffer wie HCI-Glyzin-Puffer pH - 2,2-2,8, chaotrophische Ionen, wie MgCI₂, KSCN, NaJ sowie die Polarität des Puffers reduzierende Verbindungen wie Dioxan und Äthylenglykol zu rechnen.The non-denaturing media for the dissociation of the antigen-antibody complexes may consist of a variety of substances that are capable of cleaving in different ways the multifactorial conditions of such antigen-antibody complexes. Strongly acidic buffers such as HCI-glycine buffer pH 2.2-2.8, chaotropic ions such as MgCl ₂ , KSCN, NaJ, as well as the polarity of the buffer reducing compounds such as dioxane and ethylene glycol are to be expected for this purpose.

Die Oberflächenmodifizierung dient dem Zweck der Schaffung von Bedingungen für das Eingehen kovalenter Bindungen mit dem jeweiligen Protein. Sie erfolgt durch sogenannte Silanhaftmittel der StrukturThe surface modification serves the purpose of providing conditions for entering into covalent bonds with the particular protein. It is effected by so-called silane coupling agents of the structure

-OR X-(CHj)_n-Si₁OR-OR X- (CHj) _n -Si ₁ OR

wobei R Alkylreste und X reaktive Gruppen, wie Amino-. Diazo-, Carbonyl-, Carboxy-, tsocyano-, lsothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen u. ä. sind und dadurch hetero- oder homobifunktionelle Reagenzien wie Gluteraldehyd umgesetzt werden.where R is alkyl radicals and X reactive groups, such as amino. Diazo, carbonyl, carboxy, tsocyano, isothiocyano, sulfhydryl or nitroso groups and the like. Ä. And thereby hetero or homobifunctional reagents such as gluteraldehyde are implemented.

An die so aktivierte Glasoberfläche wird erfindungsgemäß der Antikörper bzw. das Antigen in der bekannten Art und Weise gebunden.According to the invention, the antibody or the antigen is bound in the known manner to the glass surface activated in this way.

Wichtig für die praktische Durchführung das Assays ist hierbei, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Glaskörper leicht zu handhaben sind und eine hinreichend große und definierte Oberfläche besitzen. Die so mit dem Antikörper bzw. dem Antigen beladene Glasmatrix wird dann als feste Phase im (Enzymimmunoassay eingesetzt. Nach Ablauf der Immunreaktion werden die gebundenen Immunreaktanden durch die beschriebenen die Dissoziation herbeiführenden Agenzien abgeschalten, so daß das Kovalent gebundene Antigen bzw. der Antikörper für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfügung stehen. Besonders einfach gestaltet sich die Durchführung des Immunoassays auf planen Glasplatten, die analog kommerzieller Mikrotitrationsplatten ausreichend Platz für eine große Zahl von Proben liefern. Derartige Platten bieten sich besonders für Screening-Untersuchungen in der klinischen Routine an. Wichtig ist hierbei, daß die für die Antigen- oder Antikörper-Bindung zur Verfugung stehenden Flächen für alle Proben identisch ist, da nur dann ein quantitativer Vergleich derselben möglich ist. Von Bedeutung ist weiterhin, daß durch geeignete Maßnahmen ein Ineinanderlaufen der individuellen Proben ausgeschlossen wird. Beide Bedingungen werden auf einfache Art und Weise mit geeigneten Hydrophobierungsmitteln, wie Chlorsilane und Paraffine geschaffen, die die entsprechende Glasplatte in kleine, definierte Areale unterteilen und auf Grund ihrer Oberflächenspannung eine deutliche Abgrenzung der auf diese Areale aufzubringenden Flüssigkeiten bewirken. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:Important for the practical implementation of the assay here is that the glass body to be used according to the invention are easy to handle and have a sufficiently large and defined surface. The glass matrix thus loaded with the antibody or the antigen is then used as the solid phase in the enzyme immunoassay After the immune reaction has ended, the bound immunoreactants are switched off by the described dissociation-causing agents, so that the covalently bound antigen or the antibody for a Immunoassay is particularly simple on plano-glass plates, which provide sufficient space for a large number of samples in the same way as commercial microtiter plates, and are particularly suitable for routine clinical screening here is that the for the antigen or antibody binding to the jointing surfaces is identical for all samples, since only a quantitative comparison of the same is possible. of importance is further that by suitable measures a running together of the individual Samples are excluded. Both conditions are created in a simple manner with suitable hydrophobizing agents, such as chlorosilanes and paraffins, which divide the corresponding glass plate into small, defined areas and, due to their surface tension, produce a clear delimitation of the liquids to be applied to these areas. The inventive method is characterized by a number of advantages:

— Durch die kovalente Bindung von Antigenen bzw. Antikörpern lassen sich wesentlich höhere Beladungsdichten erzielen. Diese führen ebenso wie die verbesserte sterische Zugänglichkeit des Proteins — bedingt durch den Spacer—zu einer höheren Empfindlichkeit im Immunoassay.- By covalent binding of antigens or antibodies can be achieved significantly higher loading densities. These lead, as well as the improved steric accessibility of the protein - due to the spacer - to a higher sensitivity in the immunoassay.

— Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Immunreaktanden während der notwendigen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert.Immobilization does not cause any desorption of the immunoreactant during the necessary incubation and washing procedures in the immunoassay. This significantly reduces the methodological error.

— Die unspezifische Bindung an Glas-Formkörpern ist vernachlässigbar gering.- The non-specific binding to glass moldings is negligible.

— Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer erheblichen Reduzierung der Kosten in der klinischen Praxis. Einmal, da die als Einweggefäße benutzten Plastematerialien abgelöst werden und zum anderen, da sich die auf diesem Verfahren beruhenden Immunoassays leicht automatisieren lassen. Besonders augenfällig wird dies bei Verwendung von planen Glasplatten, bei denen die notwendigen Trenn- und Waschvorgänge durch einfaches Abspülen erzielt werden können. Aber auch bei Einsatz von Glaskörpern kann eine erhebliche Zeitersparnis dieser Vorgänge erreicht werden (siehe Beispiel 2 und 3).The method according to the invention leads to a considerable reduction of costs in clinical practice. First, because the plastic materials used as disposable containers are being replaced and, secondly, because the immunoassays based on this method are easy to automate. This is particularly evident when using flat glass plates, where the necessary separation and washing operations can be achieved by simply rinsing. But even with the use of glass bodies, a significant time savings of these processes can be achieved (see Example 2 and 3).

— Durch die kovalente Bindung der Antigene bzw. Antikörper an die Glasoberfläche können diese unter Anwendung von geeigneten Dissoziationsreagenzien wiederholt im Immunoassay eingesetzt werden. Dadurch werden die mitunter sehr wertvollen und teuren Proteine eingespart, was wiederum die Kosten des Assays günstig beeinflußt.- By the covalent binding of the antigens or antibodies to the glass surface they can be repeatedly used in the immunoassay using appropriate dissociation reagents. As a result, the sometimes very valuable and expensive proteins are saved, which in turn favorably affects the cost of the assay.

— Durch die Immobilisierung der Antigene bzw. Antikörper an Glasmatrices ergeben sich neue Aspekte der Fertigung einfach zu handhabender und standardisierter Testkits für kommerzielle Hersteller derartiger Kits.The immobilization of the antigens or antibodies on glass matrices opens up new aspects of manufacturing easy-to-use and standardized test kits for commercial manufacturers of such kits.

In the following the invention is explained by some examples. example 1

in kommerzielle Glasröhrchen (5,5mm χ 45mm) werden je 250μΙ einer 1%igen Lösung des Silanhaftmittels NB 1114 (Aminopropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) in Äthanol/Wasser (1:1) gegeben und 4 Stunden bei höheren Temperaturen (37⁰C bis 60"C) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer, pH7,4, werden je 200 μΙ 2%iges Gluteraldehyd in PBS-Puffer zugegeben und 2 h bei 37 ⁰C inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen werden die so aktivierten Röhrchen mit je 200μΙ humanem IgG in PBS-Puffer versetzt (50μΙ/ΓηΙ) und 4h bei Raumtemperatur bebrütet. Nach weiteren Waschvorgängen werden die eventuell noch freien Aldehydgruppen mit 0,2 m Lysinlösung blockiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer werden die Röhrchen mit 200μΙ eines Kaninchen-antihuman-lgG-Antiserums in einer Verdünnung von 1:100 für 4h bei 37"C inkubiert und anschließend wiederum mehrmals gewaschen. Anschließend werden die Röhrchen mit 200μΙ Konjugat (39ng/ml), bestehend auf einem Schaf-anti-Kaninchen-tgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und nach erneutem Waschen die Enzymaktivität mit 2,2 Azinodie (3-äthyl-benzthiazolin-sulfonat (6) (ABTS) und H₂O₂ und photometrische Messung bei 418nm bestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays werden die Röhrchen zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend in Mehrfachbesti'nmungen mit einer der folgenden Dissoziationsreagenzien für 1 h bei Raumtemperatur versetzt; 1) PBS-Puffer, 2 m an NaCI 5% Dioxan enthaltend, 2) ImKSCN, 3) 3m KSCN, 4) 4,5m MgCI,, 5} 1m NaJ, 6) HCI-Glyzin-Puffer pH 2,8. Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem IgG beladenen Röhrchen erneut im Enzymimmunoassay eingesetzt werden könnenin commercial glass tubes (5.5 mm χ 45mm) are each 250μΙ a 1% solution of the silane coupling agent NB 1114 (Aminopropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) in ethanol / water (1: 1) and 4 hours at higher temperatures (37 ⁰ C to 60 "C) were incubated. After washing three times with PBS buffer, pH 7.4, 200 μΙ be 2% glutaraldehyde in PBS-buffer was added and incubated for 2 h at 37 ⁰ C. After further washing three times so the tubes are activated with 200μΙ of human IgG in PBS buffer (50μΙ / ΓηΙ) and incubated for 4 h at room temperature After further washing, any remaining aldehyde groups are blocked with 0.2 ml lysine solution After renewed washing with PBS buffer, the tubes with 200μΙ one Rabbit anti-human IgG antiserum in a dilution of 1: 100 for 4 h at 37 "C incubated and then washed several times. Subsequently, the tubes with 200μΙ conjugate (39ng / ml), consisting of a sheep anti-rabbit tgG antibody and the enzyme horseradish peroxidase, incubated overnight at room temperature and after washing again the enzyme activity with 2,2 Azinodie (3-ethyl benzothiazoline sulfonate (6) (ABTS) and H ₂ O ₂ and photometric measurement at 418nm After carrying out the enzyme immunoassay, the tubes are washed twice with 0.5 ml each of PBS buffer and subsequently in multiple assays with one of the following 1) PBS buffer, 2 M NaCI containing 5% dioxane, 2) ImKSCN, 3) 3m KSCN, 4) 4.5m MgCl 4, 5m 1M NaI, 6) HCl glycine Buffer pH 2.8. By all these agents, the bound antigen-antibody complexes are cleaved, so that the tubes loaded with human IgG can be used again in the enzyme immunoassay

Zylinderförmige Formkörper aus Glas (Außei!durchmesser 6 mm, Innendurchmesser ca. 4mm, Höhe ca. 3mm) werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Silanhaftmitteln (NB 1115 (Glycidoxypropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) behandelt und anschließend mit Gluteraldehyd aktiviert und mit humanem Faktor VIII gebunden. Zur Ausführung des EIA werden diese3 mm) are treated as described in Example 1 with silane coupling agents (NB 1115 (Glycidoxypropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) and then activated with gluteraldehyde and with human factor VIII This will be used to execute the EIA

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Formkörper in kommerzielle Mikrotitrationsplatten, die 96 Proben a 300μΙ aufnehmen, gegeben und im folgenden nach zwischenzeitlichem Waschen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-anti-human-F Vlll-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, versetzt. Nach anschließendem Waschen wird die Enzymaktivität analog Beispiel 1 mit ABTS und H₂O₂ unter Verwendung einer Absaugküvette (Kombinat VEB Carl Zeiss JENA) bestimmt. Entsprechend Beispiel 1 wird das gebundene Konjugat mit einem der dort angeführten Oissoziationsreagenzien 1 )-6) abgespalten und ausgewaschen, so daß die mit F VIII beladenen Glas-Formkörper erneut in EIA eingesetzt werden können. Die Waschvorgänge erfolgen in dieser Variante durch Abdecken der Mikrotitrationsplatte mit einer geeigneten Vorrichtung, die die Glas-Formkörper in den Vertiefungen fixiert, und einfaches Umdrehen der Mikrotitrationsplatte. Dadurch vereinfacht sich der Waschprozeß im Vergleich zu Beispiel 1, bei dem jedes Röhrchen in der üblichen Art und Weise mittels Vakuum abgesaugt werden muß, erheblich, so daß größere Probenzahlen mit hoher Effektivität bestimmt werden können.Molded into commercial microtitration plates, the 96 samples a 300μΙ record, given and then after interim washing with a conjugate consisting of a rabbit anti-human F VIII antibody and the enzyme horseradish peroxidase added. After subsequent washing, the enzyme activity is determined analogously to Example 1 with ABTS and H ₂ O ₂ using a suction cuvette (Kombinat VEB Carl Zeiss JENA). According to Example 1, the bound conjugate is cleaved off with one of the oissoziationsreagenzien 1) -6) and washed out, so that the loaded with F VIII glass moldings can be reused in EIA. The washing operations are carried out in this variant by covering the microtitration plate with a suitable device which fixes the glass moldings in the wells, and simply turning over the microtitration plate. This simplifies the washing process significantly compared to Example 1, in which each tube must be vacuum-suctioned in the usual manner, so that larger numbers of samples can be determined with high efficiency.

Example 3

Glaskugeln von 5,5mm Durchmesser (mattiert F ~ 50 mm²) werden wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln, Gluteraldehyd und humanem F VIII aktiviert und beladen. Diese Glaskugeln werden in Polystyrol-Mikrotiter-Platten eingeführt und im folgenden der EIA zur Bestimmung von F Vlll-Antigen (W. Schößler et al. Acta biol. med. Germ.41 [1982] 263, W. Schößler et al. Acta biol. med.Germ.41 [1982] 695) in der beschriebenen Art und Weise durchgeführt. Hierzu werden die Glaskugeln mit einom Inktibationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem in Überschuß vorhandenen Kaninchenanii human Faktor Vlll-Antikörper versetzt und 6h bei 37 C inkubiert. Nach erneutem Waschen analog dem Beispiel 2 werden 200/il eines Konjugates, bestehend aus einem Schaf-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxydase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, bestimmt. Die Abspaltung der gebundenen Antikörper erfolgte mit einem der in Beispiel 1 angeführten Dissoziationsreagenzien, so daß die mit F VIII beladenen Glaskugeln erneut im EIA eingesetzt werden können.Glass balls of 5.5mm diameter (matte F ~ 50mm ² ) are activated and loaded as described in Example 1 or 2 with silane coupling agents, gluteraldehyde and human F VIII. These glass spheres are introduced into polystyrene microtiter plates and subsequently the EIA for the determination of F VIII antigen (W. Schößler et al., Acta biol med med Germ.41 [1982] 263, W. Schößler et al., Acta biol Med.Germ.41 [1982] 695) in the manner described. For this purpose, the glass spheres are mixed with a mixture of Inktibationsgemisch, consisting of the plasma to be determined and an excess present in Rabbitanii human factor VIII antibody and incubated at 37 C for 6 h. After washing again analogously to Example 2, 200 μl of a conjugate consisting of a sheep anti-rabbit IgG antibody and the enzyme horseradish peroxidase are added and, after several hours of incubation and subsequent washing, the enzyme activity is determined as described in Examples 1 and 2. certainly. The cleavage of the bound antibody was carried out with one of the dissociation reagents listed in Example 1, so that the loaded with F VIII glass beads can be used again in the EIA.

Example 4

Plane Glasplatten werden durch Hydrophobierungsmittel wie Chlorsilane oder Paraffin in konstante Areale von ca. 1 cm² Fläche unterteilt. Diese werden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln und Gluteraldehyd aktiviert und mit einem Anti-human-Faktor Vlll-Antikörper vom Kaninchen beladen. Nach Ausführung der erforderlichen Waschvorgänge, die durch einfaches Abspülen der Glasplatte realisiert werden, erfolgt eine Inkubation mit einem geeigneten Volumen (25 bis 50μΙ) Faktor-Vlll-Antigen enthaltendem Probenmaterial und nach erneutem Waschen die Zugabe eines Kaninchen-anti-human-F VIII-Antikörpers gekoppelt an das Enzym Meerrettichperoxydase und Bestimmung der Enzymaktivität analog Beispiel 3.Plane glass plates are divided by hydrophobing agents such as chlorosilanes or paraffin in constant areas of about 1 cm ² area. These are activated as described in Examples 1 and 2 with silane coupling agents and gluteraldehyde and loaded with rabbit anti-human factor VIII antibody. After carrying out the required washing operations, which are realized by simply rinsing off the glass plate, an incubation with a suitable volume (25 to 50 μΙ) of factor VIII antigen-containing sample material is carried out and, after washing again, the addition of a rabbit anti-human F VIII Antibody coupled to the enzyme horseradish peroxidase and determination of the enzyme activity analogous to Example 3.

Claims

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Invention claims:

1. Feslphasen immunoassay for the immunological determination of Aniigene, Anukörpern, haptens, viruses, hormones, pharmaceuticals, etc. based on siliceous materials as a solid phase, characterized in that as solid phase siliceous moldings whose surfaces are two- or three-dimensional usable, can be used according to prior known chemical surface modification with silane coupling agents and hetero- or homobifunctional reagents with antigens such as factor VIII antigen or other plasma proteins, antibodies such as anti-factor VIII antibodies or antibodies against antigens. Haptens, viruses, bacteria, etc., human immunoglobulin or other serum proteins or haptens are loaded and cleaved after the immune reaction, the antigen-antibody complexes formed by the dissociation-inducing reagents and loaded with the above antigens, antibodies or haptens molded body be used again in the immunoassay.

2. Solid phase immunoassay according to item 1, characterized in that the immunoassay used three-dimensionally useful moldings have hemispherical, spherical, cylindrical, cubic or conical shape that they are both compact and hollow body that the half-bodies are open or closed and that the volume of the shaped body is 0.1 to 15 cm ³ .

Solid-phase immunoassay according to item 1, characterized in that the two-dimensionally usable shaped bodies are planar SiO ₂ -containing bodies whose surface is oimjoißilt in regular mutually alternating hydrophobic and hydrophilic districts, whereby the bydropbilon effects; oino size) from 0.001 to ⁷ .

Ί \ ostphasen immunoassay according to item 3, characterized in that the hydrophobic Be / Irko are produced by hydrophobizing agents such chlorosilanes or paraffins.

5. Solid phase immunoassay according to item 1, characterized in that the shaped siliceous material is glass.

6. Solid phase immunoassay according to item 1, characterized in that as the dissociation inducing reagents strongly acidic buffer and solutions, alkaline buffers and solutions, chaotrophic ions, depolarizing reagents, electrostatic and hydrogen bonds affecting substances and haptens are used.