DE4214589C2

DE4214589C2 - Immunosensor and measuring method for the quantitative determination of constituents in liquids

Info

Publication number: DE4214589C2
Application number: DE19924214589
Authority: DE
Inventors: Stephan Heymann; Werner Schoesler; Frieder Scheller; Axel Warsinke; Olaf Behring; Burkhard Micheel
Original assignee: Imtec Immundiagnostika GmbH
Current assignee: IMTEC IMMUNDIAGNOSTIKA GMBH, 13125 BERLIN, DE
Priority date: 1992-05-04
Filing date: 1992-05-04
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2012-05-05
Also published as: DE4214589A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Immunosensor zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten, bestehend aus einem elektrochemischen, optischen oder massensensitiven Meßwertaufnehmer und einem Meßverfahren zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten unter Einsatz eines Immunosensors.The invention relates to an immunosensor for quantitative Determination of components in liquids consisting of a electrochemical, optical or mass sensitive Sensor and a measuring method for quantitative Determination of components in liquids using a Immunosensor.

Immunosensoren sind im Prinzip bekannt. Sie stellen eine besondere, hoch selektiv messende Ausgestaltungsform der sogenannten Biosensoren dar. Dabei können die Konzentrationen der an einer immunologische Reaktion beteiligten Komponenten selektiv über einen Fühler erfaßt und über einen Meßwertaufnehmer in mit der Konzentration korrelierende elektrische Signale umgewandelt werden. Die Meßwertaufnahme kann auf elektrochemischem, optischem oder massensensitivem Wege erfolgen. In der Regel finden die immunologischen Reaktionen an oder auf einer, zum Beispiel aus PVC bestehenden Membran statt, die vor dem Meßwertaufnehmer angeordnet ist. Entscheidend für die Funktion des Immunosensors ist die auf dieser Membran immobilisierte, biochemische Fängersubstanz, die für eine meßwerterzeugende, immunologische Reaktion zuständig ist. Ein Nachteil der bisher bekannten Immunosensoren ist, daß die immobilisierten Fängersubstanzen nicht oder kaum regenerations fähig sind. Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Immunosensoren ist ihre relativ langsame Ansprechbarkeit, was vorrangig in der Routine die Wirtschaftlichkeit beeinträchtigt.In principle, immunosensors are known. You make one special, highly selective design of the so-called biosensors. The concentrations of components involved in an immunological reaction selectively detected by a sensor and a sensor in with electrical signals correlating to the concentration are converted become. The measured value recording can be based on electrochemical, optical or mass-sensitive ways. They usually find immunological reactions on or on one, for example made of PVC existing membrane instead, which is arranged in front of the sensor is. The decisive factor for the function of the immunosensor is this membrane immobilized, biochemical capture substance is responsible for a measurement-generating, immunological reaction. A disadvantage of the previously known immunosensors is that the immobilized capture substances hardly or not at all are capable. Another disadvantage of the previously known Immunosensors is what their relatively slow responsiveness is primarily affects the economy in routine.

Immunosensoren sind Weiterentwicklungen der im Bereich der Laboratoriumsdiagnostik eingesetzten Immunoassays. Unter Bestandteilen in physiologischen Flüssigkeiten sind insbesondere Antigene, Antikörper, Haptene, Zellen, Viren und Immunkomplexe oder Immunglobulinaggregate zu verstehen. Antigene sind zumeist Minorkomponenten in ihrer jeweiligen Umgebung. Bekanntermaßen basiert ihr Nachweis auf der selektiven, nichtkovalenten Bindung des Antigens an spezifische Antikörper. Die Anwendung des als Immunoassay bezeichneten Verfahrens zur Bestimmung von Antigenen besitzt große Bedeutung sowohl in der Routinediagnostik wie auch in der biowissenschaftlichen Forschung. Bei niedrigen Konzentrationen der Antigene limitiert die Diffusionsgeschwindigkeit den gesamten Meßprozeß. Deshalb ist es vorteilhaft, die Bindung der Antigene an die Antikörper in homogener Lösung durchzuführen. Dabei kann die Geschwindigkeit der Immunreaktion durch die Anwendung eines Antikörperüberschusses erhöht werden. Bekannterweise wird angestrebt, nur die gebildeten Immunkomplexe an die fixierte Fängersubstanzen, z. B. Antispezies- Antikörper, Protein A oder mittels des Paars Biotin/Avidin an eine Festphase bzw. an eine Sensoroberfläche zu binden. Zur Bindung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind seit einiger Zeit Staphylokoken - Protein A sowie Protein G, ein rekombinanter Streptokokken Fc Rezeptor, fixiert an einen unlöslichen Träger, etabliert. Beide Systeme sind mit den Nachteilen erheblicher Kosten sowie der eingeschränkten Spezifität verbunden. So binden beide Proteine vorzugsweise IgG verschiedener Spezies in unterschiedlicher Stärke. Während IgM von beiden Proteinen kaum oder wesentlich schwächer gebunden wird, bindet sich humanes IgG3 an Protein A nicht. Der Hauptnachteil besteht darin, daß beide Proteine sowohl monomere als auch in Immunkomplexen (Antigen- Antikörper-Komplexe) vorliegende Antikörper binden, so daß ein selektives Entfernen und Anreichern von Immunkomplexen aus dem in homogener Phase vorliegenden Immungleichgewicht (Antigen + Antikörper; Antigen-Antikörper-Komplex) nicht möglich ist. Der Mangel an Selektivität der aufgelisteten Fängersubstanzen wirkt sich besonders nachteilig beim Nachweis von zirkulierenden Immunkomplexen (Antigen-Antikörperkomplexen) aus. Darüber hinaus belegen zahlreiche Untersuchungen, daß die Wiederverwendbarkeit der nicht-selektiven Fängersubstanzen in immobilisierter Form für serielle Messungen problematisch ist: Ihre Regenerierung geht mit Veränderungen der Fängereigenschaften und -kapazität einher, was ihre Handhabbarkeit einschränkt.Immunosensors are further developments in the field of Laboratory diagnostics used immunoassays. Among ingredients in physiological fluids are in particular antigens, antibodies, haptens, cells, viruses and To understand immune complexes or immunoglobulin aggregates. Antigens are mostly minor components in their respective Surroundings. As is known, their evidence is based on the selective, noncovalent binding of the antigen to specific antibodies. The application of the method known as immunoassay for Determination of antigens is of great importance in both Routine diagnostics as well as in life science research. At low concentrations of the antigens, the Diffusion speed the entire measuring process. That's why it is advantageous to bind the antigens to the antibodies in perform homogeneous solution. The speed of the Immune response by using an excess of antibodies increase. As is known, only the educated are sought Immune complexes to the fixed capture substances, e.g. B. anti-species Antibody, Protein A or by means of the pair of biotin / avidin to one Solid phase or to bind to a sensor surface. For binding polyclonal or monoclonal antibodies have been around for some time Staphylokoken - Protein A and Protein G, a recombinant Streptococcal Fc receptor, fixed to an insoluble carrier, established. Both systems are more significant with the disadvantages Costs as well as the limited specificity. So tie up both proteins preferably IgG of different species in of different strength. During IgM of both proteins hardly or is bound much weaker, human IgG3 binds not on protein A. The main disadvantage is that both Proteins both monomeric and in immune complexes (antigen Antibody complexes) bind existing antibodies so that a selective removal and enrichment of immune complexes from the in homogeneous phase, immune imbalance (antigen + Antibody; Antigen-antibody complex) is not possible. The Lack of selectivity of the listed capture substances works particularly disadvantageous in the detection of circulating Immune complexes (antigen-antibody complexes). Furthermore Numerous studies show that reusability of the non-selective capture substances in immobilized form for serial measurements is problematic: your regeneration goes with it Changes in catcher characteristics and capacity go hand in hand with what limits their manageability.

Zirkulierende Immunkomplexe sind bei einer Vielzahl von Erkrankungen in erhöhten Konzentrationen im Serum nachweisbar und können pathologische Folgereaktionen auslösen (Adv. Immunol. 28 (1979) 89, Clin. Chem. 28 (1982) 1259). Circulating immune complexes are found in a variety of Diseases detectable in elevated concentrations in the serum and can trigger pathological secondary reactions (Adv. Immunol. 28 (1979) 89, Clin. Chem. 28 (1982) 1259).

Eine bekannte Methode ist es, Immunkomplexe aufgrund ihrer Fähigkeit, C1q, eine Subkomponente der Komplementkomponente C1, zu binden, nachzuweisen. Beschriebene C1q-Festphasen-Immunoassays arbeiten mit an Polystyrol adsorptiv gebundenem C1q (J. Immunol. 116 (1976) 232, J. immunol. methods 40 (1981) 313, Mol. Immunol. 18 (1981) 157) bzw. an siliziumdioxidhaltigem Material (DD 214 695). Zirkulierende Immunkomplexe (Antigen-Antikörper-Komplexe) entstehen in der Auseinandersetzung des Organismus mit endogenen oder exogenen Antigenen. Verantwortlich für ihre Eliminierung ist der C1-Komplement-Protein-Komplex, der die Immunkomplexe über die Subkomponente des C1, das C1q, bindet. Die beiden anderen Subkomponenten C1r und C1s binden nicht an Immunkomplexe. Voraussetzung für die Bindung von Immunkomplexen an C1q ist eine Konformationsänderung des Immunglobulins, die nur durch Alteration (Denaturierung) oder Bindung eines Antigens erzielt wird. Somit bindet C1q nicht monomeres Immunglobulin, jedoch (fast) alle Immunkomplexe. Dazu gehören z. B. IgG2a und IgM bei der Maus. Diese Selektivität der Bindung von Immunkomplexen ist Voraussetzung zur Bindung von präformierten Immunkomplexen an das an einer festen Phase befindliche C1q. Auch in US-A 4,551,435 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur selektiven Entfernung immun-spezifisch erkennbarer Substanzen unter Bildung von Immunkomplexen aus biologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Knochenmark, beschrieben, wobei die Flüssigkeit mit einem Adsorbens in Kontakt gebracht wird, das einen nicht immun-spezifischen Faktor darstellt, wie z. B. C1q, rheumatoider Faktor, Fc-Rezeptor und Fc Rezeptor-tragende Zellen, wobei diese nicht immun-spezifischen Faktoren an eine feste Phase gekoppelt sein können. Die entsprechende Vorrichtung umfasst eine Kammer, welche eine Oberfläche aufweist, an welcher der nicht immun-spezifische Faktor gebunden ist sowie die Möglichkeiten des Ein- und Austritts der zu behandelnden Flüssigkeit gegeben ist, so dass diese mit der feste Phase, an der die nicht immun-spezifischen Faktoren gebunden sind, in Kontakt gebracht wird. Beim Passieren der Flüssigkeit werden die Immunkomplexe adsorbiert. Aus Clin. Exp. Immunol (1976), 24(3), 396-400 sind Plastikbecher bekannt, an deren Oberfläche C1q zum Nachweis von Immunkomplexen gebunden ist, wobei die Detektion durch radiomarkiertes anti-human IgG erfolgt. Desweiteren sind in JP-A 032333358 wasser unlösliche Träger beschrieben, an die C1q gebunden vorliegt, ebenfalls mit dem Ziel, eine Immunkomplex-Bildung nachzuweisen. Der Einsatz von C1q auf einem Immunosensor ist bisher noch nicht gelungen.A well known method is to build immune complexes based on their Ability to C1q, a subcomponent of the complement component C1 bind to demonstrate. Described C1q solid phase immunoassays work with C1q adsorptively bound to polystyrene (J. Immunol. 116 (1976) 232, J. immunol. methods 40 (1981) 313, Mol. Immunol. 18 (1981) 157) or on material containing silicon dioxide (DD 214 695). Circulating immune complexes (antigen-antibody complexes) arise in the interaction of the organism with endogenous or exogenous antigens. Is responsible for their elimination the C1 complement protein complex, which is the immune complex via the Subcomponent of C1 that binds C1q. The two others Subcomponents C1r and C1s do not bind to immune complexes. One requirement for the binding of immune complexes to C1q Conformational change of the immunoglobulin, which is only due to alteration (Denaturation) or binding of an antigen is achieved. Consequently C1q binds non-monomeric immunoglobulin, but (almost) all Immune complexes. These include e.g. B. IgG2a and IgM in the mouse. This Selectivity of the binding of immune complexes is a prerequisite for Binding of preformed immune complexes to that of a fixed one C1q in phase. Also in US-A 4,551,435 are a method and an apparatus for selective removal immune-specifically recognizable substances with the formation of immune complexes biological fluids, such as blood or bone marrow, described, the fluid is brought into contact with an adsorbent that has a non-immune-specific factor represents such. B. C1q, rheumatoid factor, Fc receptor and Fc receptor-bearing cells, these non-immune-specific factors can be linked to a solid phase. The corresponding device comprises a chamber which has a surface which the non-immune-specific factor is bound and the options for entry and outlet of the liquid to be treated is given, so that it with the solid phase, to which the non-immune-specific factors are linked. At the Passing the liquid, the immune complexes are adsorbed. From Clin. Exp. Immunol (1976), 24 (3), 396-400, plastic cups are known, at their Surface C1q is bound for the detection of immune complexes, the detection by radiolabeled anti-human IgG. Furthermore, JP-A 032333358 contains water described insoluble carriers to which C1q is bound, likewise with the aim of Detect immune complex formation. The use of C1q on an immunosensor has not yet succeeded.

Hiervon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe die zugrunde einen Immunosensor zu schaffen, der sich durch eine hohe Selektivität und Sensitivität, eine schnelle Ansprechbarkeit und eine gute Regenerierbarkeit bei der wahlweisen quantitativen Bestimmung von Bestandteilen in Flüssigkeiten auszeichnet. Proceeding from this, the invention is based on the object to create an immunosensor that is characterized by a high Selectivity and sensitivity, quick responsiveness and good regenerability with the optional quantitative Determination of components in liquids.

Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe mit einem Immunosensor und einem Meßverfahren, wobei der Immunosensor dadurch gekennzeichnet ist, daß auf einer Membran, die vor oder direkt auf dem Meßwertaufnehmer angeordnet ist, das Protein C1q als Fängersubstanz immobilisiert ist.According to the invention, the object is achieved with a Immunosensor and a measurement method, the immunosensor is characterized in that on a membrane in front of or The protein C1q is arranged directly on the sensor is immobilized as a capture substance.

Die Immobilisierung des Proteins C1q kann sowohl kovalent als auch adsorptiv auf der Membran erfolgen. Die im wesentlichen kovalente Bindung wird dadurch erreicht, daß eine aus regenerierter Zellulose bestehende Membran mit einem Silan wie Aminopropyltriethoxysilan chemisch aktiviert wird, anschließend eine Behandlung mit Glutardialdehyd durchgeführt wird und daran das Protein C1q gebunden wird, wobei ein bestimmter Anteil an adsorptiver Bindung ebenfalls vorliegt.The immobilization of the protein C1q can be both covalent and done adsorptively on the membrane. The essentially covalent Binding is achieved in that one from regenerated Cellulose existing membrane with a silane like Aminopropyltriethoxysilane is chemically activated, then treatment with glutardialdehyde is carried out and on it the protein C1q is bound, a certain proportion of adsorptive binding is also present.

Eine im wesentlichen adsorptive Bindung des Proteins C1q erreicht man durch einfaches Behandeln der Proteinlösung mit einer geeigneten Membran, ohne daß eine chemische Aktivierung der Membranoberfläche vorgesehen ist.An essentially adsorptive binding of the protein C1q is achieved by simply treating the protein solution with a suitable membrane without chemical activation of the Membrane surface is provided.

Als Membranmaterialien können Zellulose, Zellulosederivate, PVC, und andere synthetische Polymere eingesetzt werden.Cellulose, cellulose derivatives, PVC, and other synthetic polymers can be used.

Als Meßwertaufnehmer sind insbesondere elektrochemische, optische oder massensensitive Meßwertaufnehmer geeignet.Electrochemical and optical sensors are particularly suitable as sensors or mass-sensitive sensors.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß ein Immunosensor, der mit dem Protein C1q als Fängersubstanz beladen ist, mit einer Meßlösung kontaktiert, die als Bestandteile Antikörper und/oder Antikörperabkömmlinge, Antigene, Haptene enthält,
daß nach dem Meßvorgang der Immunosensor mit einer regenerierenden Lösung in Kontakt gebracht wird, die eine Dissoziation zwischen dem Protein C1q und dem zu bestimmenden Bestandteil bewirkt,
und daß anschließend ein weiterer Bestandteil bestimmt wird. Als besondere Ausführungsform der Erfindung werden als Antikörper und/oder Antikörperabkömmlinge polyklonale Antikörper und/oder monoklonale Antikörper oder deren chimäre oder bispezifische Abkömmlinge, Kombinationen oder Gemische der genannten Typen verwendet.The method according to the invention is characterized in that
that an immunosensor, which is loaded with the protein C1q as a capture substance, contacts a measuring solution which contains antibodies and / or antibody derivatives, antigens, haptens as components,
that after the measurement process the immunosensor is brought into contact with a regenerating solution which causes a dissociation between the protein C1q and the component to be determined,
and that another component is then determined. As a special embodiment of the invention, polyclonal antibodies and / or monoclonal antibodies or their chimeric or bispecific derivatives, combinations or mixtures of the types mentioned are used as antibodies and / or antibody derivatives.

Als Antigene werden Proteine, Nukleinsäuren, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Haptene, Zellen, Bakterien, Viren oder Gemische derselben eingesetzt.Proteins, nucleic acids, glycoproteins, Carbohydrates, haptens, cells, bacteria, viruses or mixtures the same used.

Die Dissoziationsreagenzien, die für die Abtrennung des zubestimmenden Bestandteils von der Fängersubstanz zwecks Regenerierung des Immunosensors der Regenerationslösung zugesetzt werden, sind erfindungsgemäß saure oder basische Lösungen, Ionen, chaotrope Substanzen oder organische Lösungsmittel.The dissociation reagents required for the separation of the component to be determined from the capture substance Regeneration of the immunosensor added to the regeneration solution acidic or basic solutions, ions, chaotropic substances or organic solvents.

Zirkulierende Immunkomplexe werden direkt aus der Meßlösung gebunden. Zur Bestimmung von Antigenen werden der Meßlösung Antikörper zugesetzt, die mit dem zu bestimmenden Antigen reagieren. Die entstehenden Immunkomplexe werden an das immobilisierte C1q gebunden. Dabei erfolgt die Anzeige der Bindung der Immunkomplexe an das fixierte C1q mit einem piezoelektrischen oder Oberflächenwellendetektor.Circulating immune complexes are made directly from the measurement solution bound. The measurement solution is used to determine antigens Antibodies added with the antigen to be determined react. The resulting immune complexes are transferred to the immobilized C1q bound. The binding is displayed the immune complexes to the fixed C1q with a piezoelectric or surface wave detector.

Zur Bestimmung der Antigene wird der Antikörper gegebenenfalls mit einem Enzym markiert. Bei Verwendung von IgM- und/oder IgG- Antikörpern wird mindestens ein Antikörper markiert. Die Markierung erfolgt entweder mit einem Enzym, das ein leicht nachweisbares Produkt erzeugt, oder einem Fluoreszenzmarker, wobei die Bestimmung mittels amperometrischer oder potentiometrischer Elektrode, eines Fluorimeters oder eines Feldeffekttransistors erfolgt.To determine the antigens, the antibody may also be used labeled with an enzyme. When using IgM and / or IgG Antibodies are labeled with at least one antibody. The Labeling is done either with an enzyme that is an easy one generated detectable product, or a fluorescent label, wherein determination using amperometric or potentiometric Electrode, a fluorimeter or a field effect transistor he follows.

Der erfindungsgemäße Immunnosensor ist gekennzeichnet durch schnelle Ansprechbarkeit, gute Handhabbarkeit sowie gute Regenerierbarkeit. Überraschenderweise gelang der Nachweis, daß sich immobilisiertes C1q als Fängersubstanz mehr als 100 mal ohne jeglichen Verlust der biologischen Eigenschaften bei Anwendung entsprechender Regenerierungslösungen wiederverwenden läßt. Durch Ausnutzung der biospezifischen Eigenschaften des C1q - an einer Membran oder Sensoroberfläche immobilisiert - wurde es möglich, die Antigen-Antikörper-Reaktion in homogener Phase durchzuführen und die so gebildeten Immunkomplexe ebenso wie (zirkulierende) Immunkomplexe und/oder Immunglobulinaggregate spezifisch und selektiv aus dem Immungleichgewicht zu entfernen und selektiv an das an der festen Phase befindliche C1q zu binden und nachzuweisen. Neben der Beschleunigung der Antigen-Antikörper- Reaktion wird gleichzeitig eine effektive Trennung der gebundenen Antikörpermoleküle von den freien, nicht gebundenen Antikörpern erzielt, wodurch sich eine hohe Konzentration an Immunkomplexen pro Flächeneinheit der festen Phase ergibt.The immunosensor according to the invention is characterized by quick response, good handling and good Recoverability. Surprisingly, it was proven that immobilized C1q as a capture substance more than 100 times without any loss of biological properties when used appropriate regeneration solutions can be reused. By exploiting the biospecific properties of the C1q - an immobilized on a membrane or sensor surface - it was possible the antigen-antibody reaction in a homogeneous phase perform and the immune complexes thus formed as well (Circulating) immune complexes and / or immunoglobulin aggregates to remove specifically and selectively from the immune imbalance and selectively bind to the C1q on the solid phase and demonstrate. In addition to accelerating the antigen-antibody Reaction becomes an effective separation of the bound at the same time Antibody molecules from the free, unbound antibodies achieved, which results in a high concentration of immune complexes per unit area of the solid phase.

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Sensors ermöglicht erstmalig die wahlweise selektive Bestimmung von (zirkulierenden) Immunkomplexen, Antigenen und Antikörpern. Er ist auch für niedrige Konzentrationen (10 µg/ml) geeignet und nach erfolgter Messung regenerierbar.The use of the sensor according to the invention enables for the first time the optional selective determination of (circulating) Immune complexes, antigens and antibodies. He is also for low concentrations (10 µg / ml) are suitable and after Regenerable measurement.

Die Erfindung wird an den folgenden Beispielen näher erläutert:The invention is illustrated by the following examples:

example 1

Eine aus regenerierter Zellulose bestehende Membran (20 µm Dicke) wird mit Aminopropyltriethoxysilan (Chemiewerk Nünchritz) chemisch aktiviert und anschließend mit 3%igem Glutardialdehyd (Serva) modifiziert. An die auf der Zellulosemembran befindlichen Aldehydgruppen wird humanes C1q aus 0,01 M Phosphat-Puffer, pH 8,0 mit 9,2 µg/ml C1q gebunden.A membrane made of regenerated cellulose (20 µm thick) becomes chemical with aminopropyltriethoxysilane (chemical plant Nünchritz) activated and then with 3% glutardialdehyde (Serva) modified. To those on the cellulose membrane Aldehyde groups become human C1q from 0.01 M phosphate buffer, pH 8.0 bound with 9.2 µg / ml C1q.

Nach Blocken mit 2% Kälberserum im PBS-Puffer erfolgt der Nachweis des gebundenen C1q mit einem monospezifischen Kaninchen-anti human-C1q-Antiserum und nachfolgender Detektion mit einem Ziege- anti-Kaninchen-IgG-Peroxydase-Konjugat. Durch Messung der Farbbeladung (Diaminobenzidin) wird die C1q-Konzentration an der Membran bestimmt.Detection is carried out after blocking with 2% calf serum in the PBS buffer of the bound C1q with a monospecific rabbit anti human C1q antiserum and subsequent detection with a goat anti-rabbit IgG peroxidase conjugate. By measuring the Color loading (diaminobenzidine) is the C1q concentration at the Membrane determined.

Ein anderes mit C1q beladenes Membranstück von 1,5 × 1,5 cm wird über die Stirnfläche einer auf +400 mV polarisierten Pt-Elektrode gespannt und in eine mit einem Magnetrührer versehene Meßzelle horizontal eingebracht. 50 µl der Tyreotropin (TSH) enthaltenden Meßprobe werden in die in der Meßzelle befindlichen 0,5 ml 0,1 Mol/l Tris-Puffer gegeben und 10 µg mit alkalischer Phosphatase markierte monoklonale Antikörper gegen TSH zugesetzt.Another 1.5 × 1.5 cm membrane piece loaded with C1q is over the end face of a Pt electrode polarized to +400 mV clamped and in a measuring cell provided with a magnetic stirrer introduced horizontally. Containing 50 µl of the tyreotropin (TSH) The test sample is placed in the 0.5 ml 0.1 mol / l in the measuring cell Tris buffer added and 10 ug with alkaline phosphatase labeled monoclonal antibodies against TSH added.

Nach einer Inkubationszeit von 1 h wird die Lösung aus der Meßzelle entfernt, anschließend zweimal mit 0,5 ml 100 mM Tris- Puffer gespült. Danach wird 0,5 ml Tris-Puffer pH 8 in die Meßzelle eingefüllt und das Erreichen eines stabilen Grundstroms der "Enzymimmunoelektrode" abgewartet. Hierauf werden 50 µl 0,5 mM p-Aminophenylphosphat-Lösung in die Meßzelle injiziert. Der innerhalb von 30 sec auftretende Stromanstieg der durch die alkalische Phosphatase des TSH-Antikörpers hervorgerufen wird, ist der TSH-Menge in der Meßprobe proportional, d. h. über eine Eichkurve für TSH wird die Konzentration in der Meßprobe ermittelt. Nach dem Meßvorgang erfolgt die Regenerierung des Sensors durch 30minütiges Einwirken von 3 M KSCN auf die C1q-AK- Membran.After an incubation period of 1 h, the solution from the Measuring cell removed, then twice with 0.5 ml 100 mM Tris Buffer flushed. Then 0.5 ml of Tris buffer pH 8 in the Measuring cell filled and reaching a stable base current waited for the "enzyme immunoelectrode". Then 50 ul 0.5 mM p-Aminophenylphosphat solution injected into the measuring cell. The within 30 seconds the current increase caused by the alkaline phosphatase of the TSH antibody is caused proportional to the amount of TSH in the sample, d. H. over a The calibration curve for TSH is the concentration in the test sample determined. The regeneration of the Sensors by 30 minutes of 3 M KSCN acting on the C1q-AK Membrane.

Example 2

In einer gerührten elektrochemischen Meßzelle, bei der ein mit C1q beladenes Membranstück von 0,5 × 0,5 cm vor eine auf +4 mV polarisierte Graphit-Elektrode gespannt wurde, werden unterschiedliche Konzentrationen an hitzedenaturierter, intestinaler, alkalischer Phosphatase (CIAP) vom Kalb (16-0 µg/ml) mit einem monoklonalen Anti-CIAP-Antikörper der Maus (IgM E1F1) in 0,5 ml Verdünnungspuffer (0,01 M Phosphat-Puffer + 0,05 M NaCl + 1,5% Tween 20 + 5% Kälberserum; pH 7,4) zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit Waschpuffer (0,01 M Phosphat-Puffer + 0,05 M NaCl + 0,05% Tween 20; pH 7,4) werden die an C1q gebundenen Immunkomplexe mit Schaf-anti-Maus-POD- Konjugat (1/1000 in Verdünnungspuffer; 100 µl/well; 2 h bei 37°C) nachgewiesen. Die gebundene POD-Aktivität wird nach dreimaligem Spülen mit Waschpuffer durch Substratzugabe (1,6 mM Kaliumhexacyanoferrat-II, 0,2 mM H₂O₂ in 0,15 M Citrat/Phosphat- Puffer; pH 4,5) elekrochemisch (amperometrisch) gemessen. Der aufretende Stromanstieg steht in proportionaler Beziehung zu der ab C1q gebundenen Menge an Immunkomplexen. Mit dieser Methode kann CIAP in Konzentrationen von 16-4 µg/ml nachgewiesen werden.In a stirred electrochemical measuring cell, in which a piece of membrane loaded with C1q of 0.5 × 0.5 cm was stretched in front of a graphite electrode polarized to +4 mV, different concentrations of heat-denatured, intestinal, alkaline phosphatase (CIAP) are removed from the calf (16-0 µg / ml) with a mouse monoclonal anti-CIAP antibody (IgM E1F1) in 0.5 ml dilution buffer (0.01 M phosphate buffer + 0.05 M NaCl + 1.5% Tween 20 + 5% calf serum; pH 7.4) incubated for two hours at 37 ° C. After rinsing three times with washing buffer (0.01 M phosphate buffer + 0.05 M NaCl + 0.05% Tween 20; pH 7.4), the immune complexes bound to C1q are washed with sheep-anti-mouse-POD conjugate (1st / 1000 in dilution buffer; 100 µl / well; 2 h at 37 ° C). The bound POD activity is rinsed three times with washing buffer by adding substrate (1.6 mM potassium hexacyanoferrate-II, 0.2 mM H ₂ O ₂ in 0.15 M citrate / phosphate buffer; pH 4.5) electrochemically (amperometric) measured. The rising current rise is proportional to the amount of immune complexes bound from C1q. With this method, CIAP can be detected in concentrations of 16-4 µg / ml.

Example 3

Es werden unterschiedliche Konzentrationen an hitzedenaturierter CIAP (4-0 µg/ml) mit einem monoklonalen Anti-CIAP-Antikörper der Maus (IgM E1F1) und einem zweiten monoklonalen Anti-CIAP- Antikörper der Maus (IgG E1F2), der zuvor POD-markiert wurde, in 0,5 ml Verdünnungspuffer einer gerührten elektrochemischen Meßzelle, bei der ein mit C1q beladenes Membranstück von 0,5 × 0,5 cm vor eine auf +4 mV polarisierte Graphit-Elektrode gespannt wurde, zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die gebundene POD- Aktivität wird nach dreimaligem Spülen mit Waschpuffer und Substratzugabe (1,6 mM Kaliumhexacyanoferrat-II, 0,2 mM H₂O₂ in 0,15 M Citrat/Phosphat-Puffer; pH 4,5) elektrochemisch (amperometrisch) gemessen. Der Stromanstieg steht in proportionaler Beziehung zu der an C1q gebundenen Menge an Immunkomplexen. Mit dieser Methode kann CIAP in Konzentrationen von 4-0,04 µg/ml nachgewiesen werden.Different concentrations of heat-denatured CIAP (4-0 µg / ml) with a monoclonal anti-CIAP antibody of the mouse (IgM E1F1) and a second monoclonal anti-CIAP antibody of the mouse (IgG E1F2), which previously POD-labeled was incubated for two hours at 37 ° C. in 0.5 ml dilution buffer of a stirred electrochemical measuring cell in which a 0.5 × 0.5 cm membrane piece loaded with C1q was stretched in front of a graphite electrode polarized to +4 mV. The bound POD activity is electrochemically (amperometric) after rinsing three times with washing buffer and adding substrate (1.6 mM potassium hexacyanoferrate-II, 0.2 mM H ₂ O ₂ in 0.15 M citrate / phosphate buffer; pH 4.5) measured. The current increase is proportional to the amount of immune complexes bound to C1q. With this method, CIAP can be detected in concentrations of 4-0.04 µg / ml.

Example 5

C1q wird auf die silanisierte Oberfläche einer Goldelektrode auf einem 25 MHz Schwingquarz mittels Glutaraldehyd nach bekannter Vorschrift fixiert. Der beladene Schwingquartz wird in eine Durchflußzelle eingebracht und mit einem Oszillator und Frequenzzähler zur Signalauswertung verbunden.C1q is applied to the silanized surface of a gold electrode a 25 MHz quartz crystal using glutaraldehyde according to known Regulation fixed. The loaded Schwingquartz is in one Flow cell introduced and with an oscillator and Frequency counter connected for signal evaluation.

Analog Beispiel 1 wird zur Bestimmung von TSH die Meßprobe mit (nichtmarkierten!) Antikörpern in der Tris-Puffer enthaltenden Meßzelle für eine Stunde inkubiert. Dabei erfolgt die Antigen- Antikörperreaktion in der homogenen Meßlösung und die sukzessive Bindung der Immunkomplexe an das auf den Schwingquarz fixierte C1q.Analogous to Example 1, the measurement sample is used to determine TSH (Unlabeled!) Antibodies in the Tris buffer containing Measuring cell incubated for one hour. The antigen Antibody reaction in the homogeneous measurement solution and the successive Binding of the immune complexes to that fixed on the quartz crystal C1q.

Danach wird die Meßzelle gespült und die Resonanzfrequenz ausgewertet. Bei Bindung des Immunkomplexes tritt eine konzentrationsproportionale Frequenzerniedrigung von 100-5000 Hz ein. Damit ist über eine Kalibrierungskurve eine Bestimmung zu TSH in Serumproben möglich.Then the measuring cell is rinsed and the resonance frequency evaluated. When the immune complex binds one occurs Frequency reduction in proportion to the concentration of 100-5000 Hz on. This is a determination of TSH via a calibration curve possible in serum samples.

Die Regenerierung des C1q-Sensors erfolgt analog zu Beispiel 1.The C1q sensor is regenerated in the same way as in Example 1.

Claims

1. Immunosensor for the quantitative determination of constituents in liquids, consisting of an electrochemical, optical or mass-sensitive transducer, characterized in that the protein C1q is immobilized as a capture substance on a membrane which is arranged in front of or directly on the transducer.

2. Immunosensor according to claim 1, characterized, that the protein C1q is covalently bound to the membrane.

3. immunosensor according to claim 1, characterized, that the protein C1q is adsorptively bound to the membrane.

4. Immunosensor according to one of claims 1 to 3, characterized, that the membrane is made of natural or synthetic polymers consists.

5. Immunological measuring method for the quantitative determination of components from liquids using an immunosensor according to one of the preceding claims, wherein the immunosensor with a measurement solution is contacted, which contains immune complexes, and in which after the measurement process the immunosensor is brought into contact with a regenerating solution that the Dissociation between the protein C1q and the immune complexes causes.

6. Immunological measuring method according to claim 5, in which already existing Immune complexes which are components to be determined.

7. Immunological measuring method according to claim 5, in which the antibody and / or Antibody derivatives, antigens or haptens the components to be determined and include these components before contact with the immunosensor Immune complexes are formed.

8. Immunological measurement method according to claim 7, in which the antibodies and / or Antibody derivatives polyclonal and / or monoclonal antibodies or their chimeric or bispecific descendants or combinations or mixtures thereof are.

9. The immunological measurement method according to claim 8, in which the antigens, proteins, Nucleic acids, glycoproteins, carbohydrates, haptens, cells, bacteria, viruses or Mixtures of the same are.

10. Immunological measuring method according to one of claims 5 to 9, in which as regenerating solution acidic or basic solutions, ions, chaotropic substances or organic solvents can be used.