DD217633A1 - Phasenfluorometer - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der zeitaufgeloesten Fluoreszenzspektroskopie im Picosekunden- und Nanosekundenbereich. Die Anwendung ist in Phasenfluorometern auf der Basis sinusfoermig modulierter Lichtquellen bzw. modensynchronisierter kontinuierlich arbeitender Laser moeglich und zweckmaessig. Ziel der Erfindung ist, phasenfluorometrische Messungen ohne wellenlaengenabhaengige zusaetzliche Phasenverschiebungen des Detektorsignals durchfuehren zu koennen. Die Aufgabe besteht darin, eine Phasenfluorometeranordnung anzugeben, in der wellenlaengenabhaengige zeitliche Verzoegerungen des Fluoreszenzdetektorsignals die Messung der Phasenverschiebung des Fluoreszenzsignals gegenueber dem Anregungssignal nicht beeinflussen. Das Fluoreszenzlicht wird mittels Modulatorkristall und Polarisationsweiche sinusfoermig gegenphasig mit der Modulationsfrequenz der Anregungslichtquelle auf zwei Photodetektoren gelenkt, deren Ausgaenge mit einem Gleichspannungs-Differenzverstaerker verbunden sind. Das Ausgangssignal des Differenzverstaerkers steuert ueber eine Verzoegerungseinheit die Phasenlage des Modulatorsignals so, dass am Ausgang des Differenzverstaerkers ein Nullsignal entsteht. Die sich einstellende Phasenverschiebung des Modulatorsignals ist gleich der durch den Fluoreszenzprozess bewirkten Phasenverschiebung. Diese Phasenverschiebung bzw. die Fluoreszenzabklingzeit werden direkt angezeigt. Figur
Description
Dr. Klaus Berndt Berlin,, den 10. 6. 1983
Zustellungsbevollmächtigt:
Akademie der Wissenschaften der DDR Zentralinstitut für Optik und Spektroskopie - Patentbüro
1199 Berlin-Adlershof, Rudower Chaussee β
Phasenfluorometer
Anwendungsgebiet der Erfindung '' '
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der zeitaufgelb'sten Fluoreszenzspektroskopie im Picosekunden- und Im lianosekundenbereich. Die Anwendung ist in Phasenfluorometern auf der Basis sinusförmig modulierter Lichtquellen bzw, modensynchroni3ierter kontinuierlich arbeitender'laser, möglich und zweckmäßig·
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~ "." " ~ λ " "" *' _ 2 — Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Zur Untersuchung des zeitlichen Verlaufes von Fluöreszenzprozessen werden häufig Phasenfluorometer angewendet. In einem Phasenfluorometer wird die Probe in der Regel mit sinisförmig moduliertem Licht angeregt. Das Fluoreszenzlicht ist ebenfalls sinusförmig moduliert, weist.aber gegenüber der Anregungsstrahlung eine Phasenverschiebung auf, aus der die Fluoreszenzabklingzeit berechnet werden kann. Werden Photo-multiplier zum nachweis des Fluoreszenzlichtes : benutzt, so besitzen die,erzeugten Photoelektronen eine mit wachsender Wellenlänge abnehmende Äustrittageschwindigkeit. Die Fluoreszenzlicht-Photoelektronen benötigen infolgedessen je nach:Wellenlänge unterschiedliche Zeiten bis zum Erreichen der ersten Dynode. Dies führt zu einer wellenlängenabhängigen zusätzlichen Phasenverschiebung des Photostromes, woraus erhebliche Meßfehler resultieren können. In Detektoren auf der Basis des inneren phötöelektrischen Effektes treten ebenfalls wellenlängenabhängige" Signalverzögerungen auf. ·
Zur meßtechnischen Erfassung wellenlängenabhängiger Verzögerungszeiten sind verschiedene Verfahren bekariht geworden . . /Müller, A. u.a., Rev. Sei. Ins tr. 3£> 1-21.4 (1965); Bauer, R.K. u.a., Opt. Common. 28, 91 (1979);. Jameson, D.M., u.a., J. Phys. Chem. 85,, 953 (1981)/. .... Diese Verfahren sind teils relativ aufwendig, teils aber verfügen sie nur über eine geringe Genauigkeit. In jedem Falle ist es sehr unbequem, die gemessenen Phasenverschiebungen des Fluoreszenzsignals gegenüber dem Anregungssignal wellenlängenabhängigen Korrekturen zu unterziehen.
Ziel der Erfindung .,- .
Ziel der Erfindung ist, phasenfluorometrische Messungen ohne wellenlängenabhängige zusätzliche Phasenverschiebungen durchführen zu können.
- r. r π ι
λ η η ... -4 Λ ίίΟ,Λ
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Phasenfluoromet er anordnung anzugeben, in der wellenlängenabhängige zeitliche Verzögerungen des Fluoreszenzdetektorsignals'die Messung der Phasenverschiebung des Fluoreszenzsignals gegenüber' dem Anregungssignal nicht beeinflussen.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß als Anregungsstrahler eine sinusförmig modulierte Lichtquelle vorhanden ist, in deren Strahlengang sich die fluoreszierende Probe befindet. Im Strahlengang der Lichtquelle ist vor der fluoreszierenden Probe ein Strahlteiler zur Ablenkung eines kleinen Anteils der Strahlung auf einen Hilfsphotodetektor angeordnet. Erfindungsgemäß befinden sich im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe nacheinander eine erste Linse, eine Lochblende, eine zweite Linse, ein Wellenlängenfilter sowie zwei Polarisatoren mit dazwischen angeordnetem Modulatorkristall. Der zweite Polarisator ist als Polarisationsweiche ausgeführt, in deren beiden Ausgangsstrahlengängen sich je ein Photodetektor befindet» Die Signalausgänge der beiden Photodetektoren sind mit den Eingängen eines Gleichspannungs-Differenzverstär-. kers verbunden« Der Ausgang des Hilfsphotodetektors ist über eine variable elektrische Verzögerungseinheit und einen frequenzselektiven Verstärker an den Modulatorkri3tall geführt, an den außerdem eine Gleichspannungsquelle angeschlossen ist. Die variable elektrische Verzögerungseinheit besitzt einen Steuereingang, der mit'dem Ausgang des,Differenzverstärkers verbunden ist. Die Verzögerungseinheit verfügt zusätzlich über einen separaten Ausgang.mit einer der eingestellten Verzögerung proportionalen Gleichspannung, an- den ein anzeigendes Spannungsmeßgerät angeschlossen ist. > Im Betrieb erzeugt die sinusförmig mit der Frequenz f = GJ/27Γ •modulierte Anregungs strahlung eine Fluoreszenzstrahlung,, die durch den Ausdruck
F(t) = a[i +{m/d + CCOr)2)1/2'} · sin (COt - Q + öQ)] (1) gegeben ist. In (1) bedeuten A eine Konstante, m den Modu-'
lationsgrad der Anregungsstrahlung, . f die Fluoreszenzabklingzeit der untersuchten Probe, "θ die durch den. Fluoreszenzprozeß bewirkte Phasenverschiebung und 9 die mittels der variab-1 len elektrischen Verzögerungseinheit einstellbare Verschiebung des Modulatorsignals gegenüber dem'Fluoreszenzsignal, Für gekreuzte Polarisatoren ist die Transmission am Modulatorkristall
• , T1 = Tm sin2 (U/Uir )·. ', ; ' , (2)
wobei .T die maximale Transmission, U die angelegte Spannung und Ofp die sogenannte Halbwellenspannung bedeuten. Die Gleichspannung wird so eingestellt, daß für U=O die beiden Photodetektoren gleiche zeitlich gemittelte Lichtleistungen erhalten« In diesem Fall ergibt sich für die Transmission, bezogen auf den ersten Photodetektor, ;
T1Ct). = T
m[i/2 + (U1nAT1P) -sin Wt].... (3)
In (3) ist U die Amplitude des sinusförmigen Modulationssignals» Da die Gesamttransmission in beiden Kanälen gleich T
. .." .'. . . · . - m. sein muß, erhält man für den zweiten Kanal
' siniot
Für den zeitlich gemittelten Strom am Ausgang des Differenzverstärkers ergibt sich mit
I = I1-I2 = .(qMV/T) J F(t) [,T1Ct) -T^t)] dt (5)
- 0 schließlich:der Ausdruck
Γ = [AT U mqMV/Ui 1+(COt)2)1^2 · cos (θ - 9 ) , (ο)
in dem q den Quantenwirkungsgrad und M die innere Verstärkung der beiden Photodetektoren, V die Verstärkung des Differenzverstärkers sowie T die Periodendauer des Modulationssignals bedeuten» In der variablen elektrischen Verzögerungseinheit wird zunächst eine konstante Grundverzögerung so ein-
gestellt, daß eine entsprechende konstante Phasenverschiebung 0 = ΤΓ/2 entsteht. Pur eine fluoreszierende Probe mit "C=O
ο .
und damit 9 = 0 wird dann I = 0. Ist f Φ 0, so entsteht am Ausgang des Differenzverstärker ein Strom, der über den Steuereingang der Verzögerungseinheit die Grundverzögerung solange, ändert, bis wieder T = 0 erreicht ist. Die sich.selbsttätig einstellende Änderung de'r konstanten Phasenverschiebung ist gleich der durch den Fluoreszenzprozeß bewirkten Phasenverschiebung ©. Sie kann am anzeigenden Spannungsmeßgerät abgelesen werden. Bei entsprechender Sichung des Meßgerätes kann auch die Fluoreszenzabklingzeit direkt abgelesen werden. In der erfindungsgemäßen Anordnung werden mit den beiden Photodetektoren nur zeitlich gemittelte Lichtleistungen registriert, Dadurch können sich wellenlängenabhängige Versögerungszeiten innerhalb der Detektoren nicht auf die Messung der Phasenverschiebung auswirken«
Die beiden Polarisatoren im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe sind zur Selektion verschiedener Polarisationskomponenten des Fluoreszenzlichtes, drehbar ausgeführt. Bine Variante der Erfindung besteht darin, daß auch der erste Polariaator eine Polarisationsweiche ist. An den dadurch entstehenden zweiten optischen Ausgang kann eine gleiche Phasenmeßanordnung angeschlossen werden, mit der die Phasenverschiebung ,der senkrecht zur ersten Anordnung polarisierten .Strahlungskomponente analysiert wird; . , Weitere Varianten der Erfindung ergeben sich, wenn im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes hinter dein ersten Polarisator ein Li chtablenksy stein zur Bestrahlung der beiden Photodetektoren angeordnet .ist, dessen Steuereingang mit dem Ausgang des frequenzselektiven Verstärkers verbunden ist. Die Gleichspannungsquelle und der Modulatorkristall sowie der zweite Polarisator sind in diesem Falle nicht.erforderlich. Als Lichtablenksystem kann auch ein akustooptischer Modulator ' dienen. - .
Eine letzte Variante ist dadurch gegeben, daß an die Ausgänge der beiden Photodetektoren Impulszähler sowie eine Subtrahier-Schaltung angeschlossen sind, deren Ausgang über einen Zählratenmesser mit dem Steuereingang der Verzögerungseinheit verbunden ist. . ' .
- " ' ; -: -' - δ -. . Ausführungsbeispiel
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausfiihrungsbeispiel · •näher erläutert werden,, In der zugehörigen Zeichnung ist das Schema des Phasenfluorometers dargestellt. Zur Fluoreszenzanregung dient eine sinusförmig modulierte Lichtquelle L, in deren Strahlengang die fluoreszierende, ·, Probe 3? angeordnet ist. Zwischen der lichtquelle L und der Probe F befindet sich im Strahlengang ein Strahlteiler T zur Ablenkung eines kleinen Anteils der Strahlung auf den Hilfs- . photodetektor HD. Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe F sind nacheinander die Linsen Ί1 und L2 mit dazwischen befindlicher Lochblende B, ein Wellenlängenfilter W sowie zwei Polarisatoren P1 und P2 mit dazwischen befindlichem Modulatorkristall M angeordnet. Der Polarisator P2 ist eine Polarisationsweiche, in deren beiden Ausgangsstrahlengängen sich je ein Photodetektor. D1 bzw. D2 befindet. Die Signalausgänge der Photοdetektoren DI 'und D2 sind mit den Eingängen des Gleichspannungs-Differenzverstärkers DV verbunden. Der Ausgang des Hilfsphotodetektors HD ist über die variable elektrische Verzögerungseinheit EY und den auf die Modulationsfrequenz abgestimmten selektiven Verstärker SY an den Modulatorkristall M geführt, an* den außerdem die-Gleichspannungsquelle GS'angeschlossen ist. Die Verzögerungseinheit EY besitzt einen Steuereingang, der mit dem Ausgang des Differenzverstärkers DV verbunden, ist, Sie verfügt zusätzlich über einen separaten Ausgang mit einer der eingestellten Verzögerung proportionalen Gleichspannung, an den ein anzeigendes Spannungsmeßgerät A angeschlossen ist. ,
Soll mit dem erfindungsgemäßen Phasenfluorometer eine Zeitauflösung von ca, 'Ips' erzielt werden, so kann als Lichtquelle beispielsweise ein Argonlaser verwendet werden, dessen Strahlung durch stabile 2-Moden-Oszillation mit 500 .MHz moduliert ist« Die Lochblende B muß in diesem Falle einen Öffnungsdurchmesser kleiner 0o3 mm haben, denn so" wird erreicht, daß nur Fluoreszenzlicht aus einem hinreichend kleinen Volumen registriertund bezüglich seiner Phasenlage analysiert werden kanno
Als Modulatorkristall eignen sich elektrooptisch^ Materialien, die im W'ellenlängenbereich der untersuchten Fluoreszenzstrahlung transparent sind. Es ist eine große Zahl von Substanzen bekannt, die sich für diesen Zweck eignen. Genannt seien beispielsweise ADP, KDP, KD+P, LiHbO-, KTH, SBH, Zn1Te, GaAs und BM. Von entscheidender Bedeutung bei der Verwendung des Modulatorkristalls zur Phasenmessung in der erfindungsgemäßen An- · Ordnung ist einerseits, daß sich der Bereich hoher Transmission bis ins IR erstreckt und andererseits, daß Modulationsfrequenzen bis zu einigen GHz zugänglich sindo ' > Pur Pluoreszenzuntersuchungen im sichtbaren- Spektralgebiet eignen sich Photomultiplier vorteilhaft als Detektoren. In V er-1 bindung mit dem hochohmig auslegbaren Eingang des; Differenzverstärkers ist ein extrem empfindlicher Fluoreszenznachweis bei großer Zeitauflösung möglich. Fordert man ein Signal von 1 V an 1 MOhm am Eingang des Differenzverstärkers, so ist dafür bei einer inneren Verstärkung von 10 ein Primär—Photostrom von. 10 · A am Photomultiplier notwendig. Bei 1. Hz Bandbreite ergibt sich für das Signal-Rausch-Verhältnis ein Wert von ca. 10*.; Die beiden Photomultiplier werden vorteilhaft aus demselben Netzgerät gespeist.
Pur Fluoreszenzmessungen im infraroten Spektralbereich kommen . beispielsweise Bolometer und pyroelektrische Detektoren; in Präge. Auch hier ist ein relativ 'hochempfindlicher.Nachweis möglich, da mit geringen Bandbreiten gearbeitet werden kann. Es ist in der erfindungsgemäßen Anordnung auch die Verwendung kontinuierlich, arbeitender modensynchronisierter Laser als modulierte Anregungsliciit.quelle vorteilhafte Der frequenzselektive Verstärker--wird-in diesem Fall auf die Folgefrequenz der Laserinipulse abgestimmt. Auch.hier stellt sich die variable Verzögerung selbsttätig so ein, daß die Bedingung 9 = ©erfüllt ist, wenn 0 von dem konstanten Grundwert aus gezählt
wird, der sich für tr= 0 ergibt. Bei Verwendung modensynchronisierter Laser sind durch Erzeugung der zweiten bzw. dritten Harmonischen kurzwelligere Bereiche für die Anregungsstrahlung zugänglich« .
Claims (1)
- ErfindungsanspruchPhasenfluorometer rait sinusförmig modulierter Anregungs-Iichi:quelle, mit einer im Strahlengang der Lichtquelle befindlichen Probe und mit einem im Strahlengang der Lichtquelle vor der Probe angeordneten Strahlteiler zur Ablenkung eines kleinen Anteils der Strahlung auf einen Hilfsphotodetektor,gekennzeichnet dadurch, daß im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe nacheinander zwei Linsen mit dazwischen · befindlicher Lochblende, ein· Wellenlängenfilter sowie .zw.ei. Polariaatoren'mit dazwischen befindlichem Modulatorkristall angeordnet sind, wobei der zweite Polarisator eine Polarisationsweiche ist, in deren beiden Ausgangsstrahlengängen sich je ein Photodetektor befindet,und die Signalausgänge der Photodetektoren mit den Eingängen eines Gleich3paniiungs-Differenzverstärkers:verbunden sind, daß der Ausgang des Hilfsphotodetektors über eine variable elektrische Verzögerungseinheit und einen frequenzselektiven-Verstärker an den Modulatorkristall geführt ist, an den außerdem eine Gleichspannungsquelle· angeschlossen ist, daß die variable elektrische Verzögerungseinheit einen Steuereingang besitzt, der . mit dem Ausgang des Gleichspannungs-Differenzv.erstärkers verbunden ist, und daß die variable elektrische Verzögerungseinheit über einen separaten Ausgang mit einer der 'eingestellten Verzögerung proportionalen Gleichspannung verfügt., an den ein Spannungsmeßgerät angeschlossen ist.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD25486983A DD217633A1 (de) | 1983-09-16 | 1983-09-16 | Phasenfluorometer |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD25486983A DD217633A1 (de) | 1983-09-16 | 1983-09-16 | Phasenfluorometer |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD217633A1 true DD217633A1 (de) | 1985-01-16 |
Family
ID=5550457
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD25486983A DD217633A1 (de) | 1983-09-16 | 1983-09-16 | Phasenfluorometer |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DD (1) | DD217633A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0363219A1 (de) * | 1988-10-07 | 1990-04-11 | Medex, Inc. | Phasenverschiebungssauerstoffühler |
-
1983
- 1983-09-16 DD DD25486983A patent/DD217633A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0363219A1 (de) * | 1988-10-07 | 1990-04-11 | Medex, Inc. | Phasenverschiebungssauerstoffühler |
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