DD213691A1 - Verfahren zur herstellung eines stimulators der zytodifferenzierung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Stimulators der Zytodifferenzierung, der industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer morphologischen Differenzierung als auch in ihrem Biosynthesevermoegen fuer krebschemotherapeutisch wertvolle Anthracyclin- Antibiotika stimuliert und daher in der pharmazeutischen Industrie bei der Produktion von Wirkstoffen von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer bisher unbekannten, niedermolekularen Verbindung, die auf Grund der chemischen Konstitutionsanalyse als stereochemisch einheitliches2-(6'-Methylheptanolyl)-3-hydroxymethyl-4-butanolid bezeichnet werden kann.Herstellung des Stimulators ST43683wird der Stamm ZIMET43683der Art Streptomyces viridochromogenes verwendet.Durch aerobe Submersfermentation des Stammes ZIMET43683in Medien mitgeeigneten C-,N- Quellen und Mineralsalzen wird der Stimulator gebildet, mit Hilfe extraktiver Verfahren aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatografische Methoden gereinigt. Die mikrobiologische Aktivitaetsbestimmung erfolgt mit Hilfe der Indikatormutante Streptomyces griseus ZIMET 43682.

Description

Verfahren zur Herstellung eines Stimulators der Zytodifferenzierung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Stimulators der Zytodifferenzierung bei industriell bedeutsamen Mikroorganismen, der sowohl die Ausprägung morphologischer Merkmale als auch die Bildung von Sekundärmetaboliten zu stimulieren vermag und daher in der mikrobiologischen und pharmazeutischen Industrie bei der mikrobiellen Wirkstoff-Produktion von potentiellem Nutzen ist»

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung eines Effektors, der die Biosynthese der in der Chemotherapie von Krebserkrankungen eingesetzten Anthracyolin-Antibiotika induziert und stimuliert«

Charakteristik der bekannten 'technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen spezifische Signalstoffe produzieren, die das Einschalten der Zytodifferenzierung einschließlich des SekundärStoffwechsels bewirken bzw· den koordinierten Ablauf dieser Vorgänge regeln» Bisher sind bei Streptorayceten, d* h« bei der für die industrielle Wirkstoffproduktion bedeutsamsten Gruppe von Mikroorganismen, folgende Effektoren im o, g. Sinne bekannt?

— der Induktor der Streptomycinbiosynthese und Luftmycel*» bildung bei Streptomyoes griseue (KI-EIIiEH et al«, 1976, Bioorg, Khim. (Moskau), 2, 1142-1147; KHOKHLOY et al_e> 1973, Uov® Acta Leopoldina Suppl* 7, 289-298J TOVAROVA et al*, 1970, Izvest, Akad* Nauk SSSR (Ser» Biol«) 2s

427-34; KHOlQiLOY et al,, 1973_S Z. AlIg₀ Mikrobiol. 647-655), der als sogenannter Α-Faktor (2-(6~Methyl-heptanoyi)-3~hydroxymethyl*»4~butanolid) in der Literatur beschrieben ist;

- der Induktor der Staphylomyoinproduktion durch Streptomyces virglniae, ein C^-Butyrolacton-Derivat (YANAGIMOTO et al·, 1971, J· Ferment. Technol, 49j 611-614; IMAGIMOTO et al·, 1979, Hakkogogaku, 57* 6-14)j

- der C-iaktor bei Streptomyces griseus» ein Protein-Effektor der Sporenbildung (BIRO et al«, 1980, Eur· J· Biochem., 103, 359-363);

- das Antibiotikum Pamamycin, ein Induktor der Luftmyce !bildung bei Streptpmype3 alboniger mit bisher unbekannter Struktur (McCMS u. POGELL, 1979, J· Äntibiot* 32, 673-678);

- das Sporulationspigment von Streptomyces venezuelae (SCRIBNEIi et al·, 1973, Appl. Microbiol·, 2£, 873-879),

- das fethylenomycin, ein Inhibitor der Luftmyoe!bildung in SCPI-Plasmid-Mangelmutanten (KIHBY et al», 1973, Nature, 254, 265-267)J

r*·: der Oosynthesefaktor I, ein Flavinderivat mit unbekannter Struktur, wirksam als Coenzym eines "Dehydrogenaseßchrittes der Tetracyclinbiosynthese (EuLLER et al,, 1960, J. Amer«, Chem» Soc» 82, 5002) und

- die 4,5-Dihydroxydecansäure-4~laotone (L-Faktoren) als Induktoren der Leukaemomycin- und Sporenbildung bei geblockten Mutanten von Streptomyoes griseus (ERITT et al«, 1981, Z_e AlIg. Mikrofciol., 22,, 91-95, GRAEE et al», 1982, J. An'tibiot. 21» 57-62, (JRAi¹E et al«, 1981. DDR-WP C 12 P/ 232 491 2)·

Die erwähnten Wirkstoffe, auch Stimulatoren, Effektoren oder Bioregulatoren genannt, sind hinsichtlich ihrer Struktur und Wirkungsweise untersucht worden, um Möglichkeiten für ihren Einsatz bei der Steuerung von i^lermentationspro.zessen sowie für ihre Nutzung als Pharmaka aufsufinden*

Aus der Gesamtheit der bei Streptomyceten. bisher bekannten Bioregulatoren sind die L-* und A-Paktoren sowie die zu ihrer Her-

stellung erarbeiteten Verfahren als nächstliegender Stand der Technik anzusehen«

Hierzu ist einerseits anzumerken, daß die bisher bekannten L-Faktoren (^,S-Dihidroxydeoansäure-^lactoae) eine vergleichsweise niedrige Stimulationsaktivität aufweisen®

Das ursprüngliche Verfahren zur Herstellung des Α-Faktors, ein Fermentationsverfahren, liefert andererseits diesen Wirkstoff trotz aufwendiger Aufarbeitungsschritte nur in sehr geringen Ausbeuten« Inzwischen ist zwar die chemische Synthese des A-Faktors gelungen (KLEINER et al, 1977, Bioorg. Khim« (Moskau, 2» 424-426£fc jedoch fällt dieser Stimulator dabei als Raoemat an.

Aus dem chemisch synthetisierten, racemischen A~Faktor ist durch anschließende chemische Reduktion weiterhin ein Gemisch mehrerer stereoisoraerer Derivate mit reduzierter C6-Keto~Gruppe, d, h. ein Gemisch mehrerer 2(6^l-Methylheptanolyl)-»3-hydroxymethyl-4-butanolide, erhalten werden. Dieses Derivate« Gemisch besitzt keine biologische Aktivität gegenüber Streptomycin-bildenden Stämmen von Streptomyces gyiseus (KLEINER et al·, 1977, Bioorg· Khira. (Moskau), 2, 424-426; ONOPRIENKO et al., 1979, Abstracts Int. Symp, von Antibiotics, Weimar/ GDR, May 14-18, p. C-14).

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines neuen Stimulators der Zytodifferenzierung, insbesondere der leukaemomycin-Produktion, bei Streptomyces-Stämmen, um die Palette derartiger Bioregulatoren um einen auf mikrobiologischem Wege herstellbaren Vertreter zu erweitern, der für biotechnologische Anpassungen in der mikrobiologischen Industrie von potenteillem Nutzen ist» Der herzustellende Stimulator soll bei Zusatz zu industriell bedeutsamen Streptomyceten-Kulturen, die weder Luftmycel noch Sporen ausdifferenzieren und keine Anthracyclin-Antibiotika zu synthetisieren vermögen, sowohl die Dif~ ferenzierung als auch die Anthracyclin-Biosynthese anschalten und fördern·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe augrunde, ein technologisch einfaches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe ein neuer Stimulator der Zytodifferenzierung, der o# g„ Anforderungen genügt, aus einem Mikroorganismus durch dessen Kultivierung auf einem leicht zugänglichen Medium unter Verwendung billiger Einsatzstoffe hergestellt, mit Hilfe einer spezifischen Methode nachgewiesen (Eritt et al» 1982, Z* Allg» Mikrobiol» 2£, 91-95) sowie mit ohromatografischen Methoden isoliert und gereinigt werden kann»

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Währmedium mit entsprechenden Kohlenstoff« und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen ein Mikroorganismus oder seine Mutanten und Varianten gezüchtet werden· Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Verwendung finde*, ist aus einer Population der Art Streptomyoes viridoohromogenea isoliert und unter der Registriernummer ZIMST 43683 in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstr» 11, hinterlegt worden«

Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43683 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyo-» phil getrocknetes Sporenmaterial bzw« an Glucose/Gelatine (5 #ig) lyophilisierte Mycelfragmente werden auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 ⁰C und 37 ⁰O, vorzugsweise 28 ⁰C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die au Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt* Das Nährmedium besteht aus kohlenstoff- und Stiokstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können die in der Antibiotika-Industrie üblichen Einsatzstoffe verwendet werden. Die Fermentation des Bildners; ZIMET 43683 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentern sowie in V2A-Stahltanks durch-

geführt werden.

Die in der Fermentation gewonnene Kulturlösung wird mit Hilfe eines Separators in Mycel und Kulturfiltrat getrennt« Vorzugsweise letzteres wird bei einer Azidität von pH 5 bis pH 7 für die Extraktion mit organischen lösungsmitteln, insbesondere Butylacetat, versetzt. Durch Einengen der Butylaoetatextrakte wird ein Rohprodukt erhalten, das an trockenem Zellulosepulver adsorbiert, nachfolgend duroh Elution mit Wasser wieder in Lösung gebracht sowie durch Reextraktion mit Ether weiter angereichert wird. Das dabei anfallende Produkt wird durch präparative Dünnschichtchromatografie bis zur gasohromatografisehen Homogenität gereinigt. Die so erhaltene hochreine Substanz stellt bei Raumtemperatur ein farbloses Öl dar· Im Massenspektrum (hochauflösendes Massenspektrometer JEOI JMS-D-100, Direkteinlaßsystem, 120 ⁰C, 75 ev Elektronenstrom) treten die in Abb. 1 angeführten charakteristischen Fragmente auf» Die charakteristischen Maxima im IR-Spektrum (Hicolet Fourier transform instrument) sind: (GDCl₃) (οπΓ¹): 1010,1036,1080,1125,1172,1240,1260,1390,1470, ^max· 1520,1767, (gesätt· 5-Ringlacton), 3625 (zusammen mit 1036s primäre 0H~Gruppe) und 3440 (zusammen mit 1080: intramolekulare Η-Bindung, sekundäre 0H-Gruppe)» Eine für den Α-Faktor charakteristische C0-Bande bei 1720 cnT¹ (Mort, 1981, Tetrahedron Lett», 22., 3431-32) fehlt bei gleichzeitiger Anwesenheit einer Co-OH-Gruppe. Das TJV-Spelstfcrum zeigt eine schwache Absorption bei 215 mn (£ - 120)«

Die Bruttozusammensetzung der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz, die die Bezeichnung ST 43683 erhielt, wurde zu C₁₃H₂₄O^ bestimmt, und ihr Molekulargewicht beträgt 244. Diese Parameter wie auch die relative Konfiguration werden durch die 200 MHz ¹H-KMR-Angaben (Bruker ViIP 200/SY) bestätigt (^f⁰⁰⁰¹S ppm: H2, 8.65, J₂₃ * 9.4; J₂₆ = 4·6; H3, 2.76; J₃₄₃ » 8.1; ⁸·⁶? ^J35a ^{= 5}"^{8; J}3,5b = ⁶·²» ^H4a> ^{4e42i J}4a4b * "⁸^ 3,97; H5a, 3.75; J₅^₅₁₃ » -10.6; H6, 4.03; -J₆ y* 6*7; HT, H8, H9, H10, 1.1-1.75; H11, 1.49; J_{11 12} = 6*8; H12,H13, 0*87j Kopp lung s konstant en in Hz) .Der relativ hohe Viert der Kopplungs«·

konstanten J₂₃ = 9·4 Hz steht in Übereinstimmung mit der trans-Anordnung der Substituenten, entsprechend einer 2S, 3S- bzw_f 2R,3R-Konfiguration der chiralen Zentren am Butyrolacton-Ring (Sevastionoff u· Pfau, 1967,. Bull. Soc. Chinu Prance ig62, 4162-71).

Die Zuordnung der Struktur wird zusätzlich durch die ¹ ^-Angaben (25.16 MHz Varian XL-100/15) unterstützt! C^^CDC13 ^Ppm: C1, 177,79 (0)02, 49.46 (d); C3, 40.34 (d); C4, 68,82 (t); C5, 62.88 (t); C6, 71.14 (d); 07, 34.25 (t)j C8, 26,72 (t); C9, 27.62 (t); 010., 39.24 (t); 011, 28.22 (d); C12, 22.73 CO; C13, 22.73 (q).

Auf Kieselgelfolien zeigt St 43683 folgende R_f-Werte: 0.26 (CHCWMeOH, 95:5, v/v) und 0,18 (Benzen/Ether, 1:1,

Ihrer physikochemischen Charakterisierung nach stellt die neue Substanz ST 43683 ein 2-(6^l-Methylheptanolyl)-3-hydroxymethyl-4-butanolid dar. Die Neuheit dieser Substanz wird darin gesehen, daß im Ergebnis des beschriebenen Verfahrens, über den Stand der Technik hinausgehend, ein 2-(6'-Methylheptanolyl)-3-hydroxymethyl-4-butanolid mit sehr hoher stereochemiecher Reinheit in bezug auf die Konfigurationen am 02 und 03 anfällt.

Die Substanz ST 43683 ist, wie überraschend gefunden wurde, biologisch aktiv. Sie vermag bei Stämmen des Leukaemomycin-' Bildners Streptomyoes griseus sowohl die biochemische als auch die morphologische Differenzierung anzuschalten und zu stimulieren. Wird nach der bei Eritt et al., 1982, Z. AlIg. Mikrobiol., 22_ (2), 91^-95 angegebenen Nachweismethode (siehe unten) vorgegangen, so weist der Stimulator ST 43683 eine im Vergleioh zu den bekannten L-Faktoren (4,5-Dihydroxydecansäure-4«lactonen) eine 5fach stärkere Stimulationsaktivität in bezug auf die Biosynthese wie auf die morphologische Differenzierung auf. Damit wird mit vorliegendem Verfahren erstmals ein A-Faktorähnliches Molekül auf mikrobiologischem Wege herstellbar, welches biologische Aktivität bei Stämmen des Leukaemomyoin-Bildners Streptomyoes griseus zeigt. .

Der nachweis der Wirkung des Stimulators der Zytodifferenzie-

rung ST 43683 erfolgt mit Hilfe einer speziellen Methode, die sowohl die Stimulierung der Luftmycel- und Sporenbildung als auch die der Leukaemomycin-Biosynthese nachzuweisen gestattet» Details der mikrobiologischen Analytik sind bei Eritt et al«, 1982, Z. AlIg. Mikrobiol,, 22j 91-95 beschrieben. Als Indikator-Stamm wird eine Mutante von Streptomyces griseus verwendet, die sowohl in der Differenzierung des Luftmycels und der Sporen wie auch in der Anthraeyclin-Biosynthese genetisch geblockt ist. Der für die Durchführung der mikrobiologischen Analytik des Stimulators ST 43683 notwendige Indikatorstamm ist unter der Registriernummer ZIMET 43682 in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 Jena, Beutenberg« aitraße 11, hinterlegt worden«

Ausführungsbeispiele

An nachstehenden Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden«

1· Mycelfragmente bzw· Sporen des Stimulator-Bildners ZIMBT 43683, der 10 Tage auf dem für Streptomyceten Üblichen Hafermehl-Agar amers angezüchtet wurde, werden als Impfmaterial für Vorzucht-Kulturen in folgendem Submers-Medium einge— setzt:

0,6 % Bacto-Pepton; 0,3 # Hefeextrakt; 0,05 # CaCO-; Leitungswasser ad 100 #; pH 7,2; Sterilisation; 120 ⁰C, 30 Mn, Die Vorzuohtkulturen befinden sich in lOO-ml-Steiltrustflaschen ä* 20 ml Füllung und werden 48 Std, bei 28 ⁰C auf einem Schütteltisch (180 U/min) bebrütet. Durch stufenweise Maßstabsvergrößerung wird das auf diese Weise gewonnene Submers-Mycel zur Beimpfung von 400 l-Permentoren mit Submers-Medium folgender Zusammensetzung verwendet: 3 % Glucose; 1 ^ch Sojamehl; 0,3 # WaCl; 0,3 % CaCO₃; pH 7,0 nach Sterilisation (125 ⁰C, 60 Min·)· Während der Fermentation bei 27 ⁰C bis 2$ ⁰C, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 260 U/min und einer Luftzufuhr von 400 l/min durchgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen silikonhaltiger Schaumschutzmittel

kontrolliert werden· Each lOOstündiger Fermentationsdauer wird der höchste Gehalt an ST 43683 bestimmt»

300 1 einer nach Beispiel 1 gewonnenen lOO-'Std.-Kulturlösung des Stammes ZIMET 43683 werden auf pH 5,0 bzw· pH 7,0 eingestellt, mit Hilfe eines Separators in Myeel und KuI-turfiltrat getrennt und entsprechend dem in Abb* 2 dargestellten Schema aufgearbeitet,

Nach Extraktion der Kulturlösung mit 0,2 Vol. Butylacetat und Einengen der Lösung werden 80 g Rückstand erhalten» der in 300 ml Diethylether gelöst und mit 200 g Cellulosepulver für die Säulenchromatographie versetzt wird. Nach Entfernen des Ether© im Vakuum wird das Gelluloseadsorbat in eine Säule gefüllt und mit 4 1 Wasser eluiert. Die wäßrige Lösung wird dann 3 mal mit je 2 1 Ether extrahiert, Nach Trocknen der lösung und Abdampfen des Lösungsmittels verbleiben ca» 5 g Rückstand, aus dem durch präparative DünnschichtChromatographie an Silufol-Kieselgel unter Verwendung von Ben« zen/Bther (1:1, v/v, zweifacher Lauf des Chromatogramms) eine angereicherte Fraktion von ST 43683 erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 280 mg· Die zweite Feinreinigung erfolgt durch präparative Dünnschichtohromatographie auf Silufol-Kieselge^Folien unter Verwendung von CHCl^/Methanol (95:5, v/v)· Ausbeutet 60 mg. In einer dritten dünnephichtohroma« tographischen Stufe (Silufol, Benzen/Ether, 1:1, v/v) werden 17 mg des reinen Stimulators ST 43683 erhalten. Die 98 #ig© Reinheit des Produktes wurde durch gasohromatpgraphisohe Analyse (OV 101, uaschrom Q, 140 ° Säulentemperatur) bewiesen. Das sp erhaltene Produkt wurde für die Untersuchung der biolpgischen Wirkung eingesetzt·

pH 7,5 und pH 8,3 liegt, kultiviert wird und

- der hierbei gebildete neue, stereoohemisch einheitliche Stimulator ST 43683« der durch die Summenfor» mel C-]3^H2Zl°4 sowie durch die Struktur eines 2-(6'-Methylheptanolyl)-3—hydroxymethyl-4-butanolides; charakterisiert ist und im Einklang mit einer 2S, 3S- bzw, 2RjSS-AnOrdnung eine trans-Konfiguration der Substituenten an C2 und G3 aufweist, aus dem KuI-turfiltrat bei einer Azidität von pH 5 bis pH 7 mittels üblicher organischer Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit an sich bekannten chromatographischen Methoden gereinigt wird*

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet daduroh, daß die Kultivierung des Stammes ZIMET 43683 in 400 1-Fermentoren bei 28 ⁰G während eines Zeitraumes von 4 Tagen und unter einer Luftzufuhr von 400 l/min erfolgt.

Hierzu 2 Seiten Abbildungen.

2261^0

m/z .19&1377

m/z 145.0494

_m/z

m/z 1160471 (oder die enantiomere (2R,3R}-form) ICsH&Og*

Abb, 2 Aufarbeitungsschema

100 Std,-»Kultur Streptpmvces yiridpohrpmo^enes

I yO2

Kulturflüssiftkeit 300 1 Myzel

Extraktion mit 0«2 Vol» Butylacetat

I flückstand (80 g)

lösen, in E-fc&er (300 ml) Misohen mit 200 g Cellulose'· pulver für die Säule&ffiliromato·"· graphie

Verdampfen des Lösungsmittels

Elution des Zellaloseadsorbates mit

4: 1 Wasser

Wäßrige Lb'aunp

Extraktion mit

3x2 1 Ether

IHüokstand (5 g)

Preparative DC, Silufol φenzien/Ether_> 1:1, v/v}

Aktive Fraktion C280 mg; 2maliger Lauf)

Präparative DC, Silufol CHCWMeOH, 95s5, v/v

ΊAktive Fraktion C60

Präparative DC, Silufol Benzene/Aoeton, 1:1, v/v,3maliger Lauf

% reines Produkt (17

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   1· Verfahren zur Herstellung eines Stimulators der Zytodifferenzierung auf mikrobiοlogiaehern Wege, gekennzeichnet dadurch, daß

   - der Mikroorganismus Streptomyoes viridoohromoffenes ZIMET 43683 unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 25 ⁰C bis: 37 ⁰C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen bei einer Azidität, die zu Fermentationsbeginn zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende dieses Prozesses zwischen