DD141035B1 - Verfahren zur immobilisierung von biologischem material - Google Patents

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Gebiete der Biochemie und der Mikrobiologie· Sie bezieht sich auf die Immobilisierung von Proteinen, Zellorganellen und Zellen an Glasfaservorfiltern, wodurch der Aufbau einer kontinuierlich arbeitenden mikrobiologischen Reaktionskammer ermöglicht wird.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisherige Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material erfordern eine vorherige chemische Modifizierung der Glasoberflächen, mittels schwer zugänglicher oder teurer Chemikalien· Ein weiterer Nachteil chemischer Immobilisierungen liegt in der mehrstufigen Immcöilisierungsprozedur und der Beeinflußbarkeit der Immobilisierung durch die Temperatur. Ein anderes Verfahren erfordert die Hohlglasfasermaterialien zur Immobilisierung. Schließlich beruhen einige Verfahren auf einer Zurückhaltung des biologischem Materials mittels Filtern und beinhalten deshalb den prinzipiellen Nachteil der Verstopfung. Die nachteiligen Verfahren sind in folgenden Patentschriften beschrieben:

US - PS 3 519 538 3 9ЗО 951 4 078 971 3 652 761 3 983 000

GB-PS 1 491 261

1· Alonso, G* L.; Arrigo, D. M, ; Terradas, S. E.; Nikonov, J. M.; Nespral, D·; Palomba, S· E. (1977) Biochim. Biophys. Acta, Bd. 468, S* 3I - 50

2· Panten, U.; Ishida, H.; Schauder, P.; Frerichs, H.; Hasselblatt, A.; (1977) Analyt. Biodon, Bd. 82, S. 317 -

3. R- Van der Meer und Toger, J,M· (1974) FEBS-Lett Bd. 67, S. 36 - 40

4. Allen, D. D.; Largis, E* E.; Miller» E. A.; Ashmore, J. (1973) d· Appl· Physiol., Bd. 34, S. 125 - 127

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens, mit dem eine nahezu quantitativ verlaufende Immobilisierung möglich ist und keine chemische Vorbehandlung der Glasoberfläche erfordert. Das au der Glasoberfläche immobilisierte biologische Material soll sich quantitativ wieder ablösen lassen und so mit dem Verfahren eine schnelle Wiederverwendung der Glasoberflächen ermöglicht werden.

Wesen der Erfindung

Die technische Aufgabe besteht darin, alle chemischen Vorbehandlungen von Glasoberflächen zu vermeiden und geeignete Glasmaterialien mit einer großen Oberfläche und einer hohen Adsorptivität für Proteine, Zellorganellen und Zellen zu finden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen-Verfahrens werden neuartige metabolische Untersuchungen des genannten biologischem Materials unter - in vivo - ähnlichen Bedingungen ermöglicht. Ein Nachteil der bekannten technischen Lösungen, die chemische Vorbehandlung der Glasoberfläche, wird vermieden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren tritt das bei den bekannten technischen Lösungen auf einem Piltereffekt beruhenden Verfahren nachteilige Verstopfen der Filter nicht auf«

Merkmale der Erfindung

Der Erfindung liegt die Tatsache zugrunde, daß kommerziell gebändelte Glasvorfilter (z. B. Typ GP 92 der Pa. Schleicher und Schüll (BRD) und vom Typ AP 20 und AP 25 der Pa. Millipore (USA) ohne vorherige chemische Behandlung eine hohe Adsorptivität für Proteine, Zellorganellen und Zellen besitzen» Dabei kann mittels elektronenmikroskopischer Untersuchung der Filter eine Zurückhaltung des biologischen Materials durch Siebv?irkung ausgeschlossen werden<> Die Immobilisierung des biologischen Materials wurde in der Weise ausgeführt, daß einer der oben genannten Filter in einerReaktionskammer plaziert wurde· Durch die Reaktionskannaer v?ird ein geeignetes Medium hindurchgepumpt· Das biologische Material wurde mit dem Mediumstrom in die Reaktionskammer transportiert· Die Adsorption des biologischen Materials an den Glasvorfiltern ist im Bereich von O - 45° C unabhängig von der Temperatur und zeigt im Bereich von pH 5 ~ 8»5 »ur eine·geringe Abhängigkeit vom pH-Wert. Die Filter lassen sich von dem adsorbierten biologischen Material durch kurzzeitiges Durchspülen der Reaktionskammer mit einer Lösung einer oberflächenaktiven Substanz regenieren· Wesentliche Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens sind:

- die. Möglichkeit zur"Langzeitinkubation

~ Untersuchungen unter konstanten metabolischen Bedingungen

- Verhinderung der Anreicherung störender Stoff-wechselprodukte

- ständige Zufuhr der Ausgangsstoffe und von Sauerstoff

- rasche reversible Änderung der Stoffwechselsituation

- Durchführung von biochemischen Synthesen·

Das Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material soll nachstehend erläutert werden:

Das für die Untersuchung verwendete biologische Material -wurde nach entsprechenden Standardvorschriften.aus lebenden Organismen isoliert· Eine bestimmte Menge des biologischen Materials wurde in der Weise in eine geeignete Resktionskammer eingebracht, daß es vom strömenden Medium zum Glasfaservorfilter transportiert wird* Es wird ein kurzer Zeitraum abgewartet, um das nicht immobilisierte biologische Material auszuspülen.

liach einer begrenzten Anfasgsperiod'e wird kein weiterer Verlast von biologischem Material beobachtet*

Ausführungsbeispiel

Messung des SauerstoffVerbrauchs von isolierten Mitochondrien· Die für die Messung des SauerstoffVerbrauchs'verwendeten Mitochondrien -werden nach entsprechenden Standardvorschriften aus der Leber von Ratten isoliert /5/· Von der Mitochondriensuspension werden 0,5 1 in die Reaktionskammer so eingebracht» daß die Mitochondrien vom strömenden Medium zum Glasvorfilter transportiert werden· Die Zusammensetzung des Mediums wurde so ausgewählt, daß es eine Aufrechterhaltung der nativen Punktionen der Mitochondrien für einen längeren Zeitraum gewährleistete /6/· Die Konzentration des im Medium gelösten Sauerstoffs wurde nach Durchgang durch die Reaktionskammer mit einer Sauerstoffelektrode gemessen· Durch kontinuierliche Zuführung von Reagenzien, die sauerstoffverbrauchende Prozesse der Mitochondrien stimulieren, konnte der Sauerstoffverbrauch auf einen Maximalwert gesteigert werden, der einem Mehrfachen des Ruheverbrauchs entspricht· Durch geeignete Wahl der stationären Konzentration dieser Reagenzien konnten konstante Geschwindigkeiten des SauerstoffVerbrauchs, die eiuem Wert zwischen dem oben genannten Maximal- und Ruhewert entsprechen, eingestellt werden· Der so eingestellte Sauerstoffνerbrauch konnte über mindestens eine halbe Stunde aufrechterhalten werden»

Nach Beendigung des Versuches wurde der Filter der Reaktionskammer entnommen und die Menge der immobilisierten Mitochondrien über ihr Proteinequivalent bestimmt /7/·

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material, wie Zellorganellen, Zellen, Zellverbänden, Proteinen und Enzymen dadurch gekennzeichnet, daß die genannten biologischen Strukturen an GIasvorfiltern auf Bor-Silikat-Basis unter Ausnutzung der Eigenschaft dieser Filter, proteinhaltiges Material zu adsorbieren, immobilisiert werden, wobei 5 - 100 % des eingesetzten biologischen Materials im Temperaturbereich von 0 - 45°C immobilisiert werden und der Vorgang^ der Immobilisierung keine Vorbehandlung der Filter oder des biologischen Materials erfordert, sondern spontan bei der Durchströmung der Filter mit dem Medium, in welchem das biologische Material gelöst oder.suspendiert ist, erfolgt, und das auf erfindungsgemäße Weise immobilisierte biologische Material in einer geeigneten Eeaktionskammer in einem Durchflußsystem zur Synthese oder zum Abbau von Stoffen, zur Zellkultivierung und zur Simulation von Stoff«echselvorgängen abgesetzt wird·