CZ87597A3 - Molekula DNK kódující lidský papilomavirus typu 6A a použití této molekuly - Google Patents
Molekula DNK kódující lidský papilomavirus typu 6A a použití této molekuly Download PDFInfo
- Publication number
- CZ87597A3 CZ87597A3 CZ97875A CZ87597A CZ87597A3 CZ 87597 A3 CZ87597 A3 CZ 87597A3 CZ 97875 A CZ97875 A CZ 97875A CZ 87597 A CZ87597 A CZ 87597A CZ 87597 A3 CZ87597 A3 CZ 87597A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hpv6a
- dna molecule
- human papillomavirus
- dna
- papillomavirus type
- Prior art date
Links
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims description 41
- 241001502561 Human papillomavirus type 6a Species 0.000 claims abstract description 214
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 104
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 20
- 241000701589 Human papillomavirus type 6b Species 0.000 description 19
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 18
- 108010021066 nicotinamide riboside kinase Proteins 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 9
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001428582 Human papillomavirus type 6 Species 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- -1 elixirs Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 1
- 244000144927 Aloe barbadensis Species 0.000 description 1
- 235000002961 Aloe barbadensis Nutrition 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000201835 Froelichia floridana Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710163801 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 101100053835 Mus musculus Zfta gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 101710132593 Protein E2 Proteins 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M Sodium oleate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 1
- 235000011399 aloe vera Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012216 bentonite Nutrition 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J dicalcium hydroxide phosphate Chemical compound [OH-].[Ca++].[Ca++].[O-]P([O-])([O-])=O CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 229940042472 mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940078555 myristyl propionate Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002721 polycyanoacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 102200029613 rs35593767 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- YRZGMTHQPGNLEK-UHFFFAOYSA-N tetradecyl propionate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CC YRZGMTHQPGNLEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- 229930195724 β-lactose Natural products 0.000 description 1
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical compound O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Molekula DNK kódující lidský papilomavirus typu 6A a použití této molekuly.
Oblast techniky
Vynález se týká molekul DNK kódujících čištěný lidský papilomavirus typu 6A a jejich derivátů.
Dosavadní stav techniky
Infekce papilomaviry (PV) se vyskytuje u různých živočichů, mezi něž patří lidé, ovce, psi, kočky, králíci, opice, hadi a krávy. Papilomaviry infikují epiteliální buňky, obvykle vyvolávají benigní epiteliální nebo fibroepiteliální nádory v místě infekce. Papilomaviry jsou druhově specifická infekční agens; lidské papilomaviry infikují pouze člověka.
Papilomaviry se na základě hostitele, kterého infikují, mohou zařazovat do odlišných skupin. Lidské papilomaviry (HPV) se dále rozdělují na více než 70 typů v závislosti na homologii DNK sekvence. Papilomaviry se jeví být typové specifickými imunogeny. Imunita neutralizující infekci jedním typem papilomaviru nezaručuje imunitu proti jiným typům papilomavirů.
U lidí různé typy lidských papilomavirů (HPV) způsobují různá onemocnění. Lidské papilomaviry (HPV) typu 1,2,3,4,7,10 a 26 až 29 způsobují u lidí s normální a narušenou imunitou benigní bradavice. Lidské papilomaviry (HPV) typu 5,8,9,12,14,15,17,19 až 25,36 a 46 až 50 způsobují u lidí z narušenou imunitou mělké leze. Lidské papilomaviry (HPV) typu 6,11,34,39,41 až 44 a 51 až 55 způsobují benigní kondylomata na sliznicích pohlavních orgánů a dýchacího ústrojí. Lidské papilomaviry (HPV) typu 16 a 18 způsobují epiteliální dysplazie genitálních sliznic a jsou spojovány s většinou karcinomů in šitu a invazivních karcinomů děložniho čípku, pochvy, vulvy a anální trubice.
Papilomaviry jsou malé (50 až 60 nm) , ikosaedrické, DNK viry, bez virového obalu. Nesou až ošum časných a dva pozdní geny. Otevřené čtecí rámce (ORF) virového genomu jsou označeny El až E7 a Ll a L2, kde E značí časný (early) a L značí pozdní (latě). Ll a L2 otevřené čtecí rámce kódují virové kapsidové proteiny. Časné geny (značeny E) odpovídají za funkce jako jsou replikace viru a transformace buňky.
Protein označený Ll je hlavní kapsidový protein a jeho molekulární váha je 55 až 60 kDa. Protein označený L2 je méně významný kapsidový protein, jehož předpokládaná molekulární váha je 55 až 60 kDa, elektroforéza na poiyakrylovém gelu stanovila hodnotu jeho molekulární váhy na 75 až 100 kDa. Imunologická data naznačují, že většina L2 proteinu leží uvnitř proteinu Ll. Otevřený čtecí rámec Ll je mezi různými papilomaviry vysoce stálý. Protein L2 je mezi různými papilomaviry méně stálý.
Geny označené jako Ll a L2 jsou vhodnými cíli pro imunoprofylaxi. Také některé Časné geny se jeví jako potenciální cíle pro vývoj vakcíny. Studie na systémech králičích papiloraavirů (cottontail rabbit papilomavirus; CRPV) a hovězích papilomavirů (BPV) ukázaly, že zvířata imunizovaná těmito proteiny, které byly exprimovány v bakteriích, nebo použitím vektorů vakcinie, byla chráněna proti virové infekci. Exprese papilomavirových genů Ll v expresních systémech bakulirů nebo použitím vektorů vakcinie vede k vytvoření partikul!, které jsou podobné virovým partikulám (virus-like particles; VLP) . Tyto partikule se používají k vyvolání imunologické odezvy, vzniká vysoký titr protilátek neutralizující virus, což způsobuje ochranu proti viru.
Lidské papilomaviry typu 6 a 11, které jsou pouze řítce spojovány s malignitou, způsobují přibližně 90% případů z výskytem condyloma acuminatum, benigních lézi sliznic pohlavních orgánů a dýchacího ústrojí. Typ 6 lidského papilomaviru byl určen v těchto lézích třikrát častěji než typ 11Úplná nukleotidové sekvence lidského papilomaviru typu 6b, který je původní izolát lidský papilomavirus typ 6, je uvedena v Schwarz, E., et al. 1983. EMBO J. 2:2341-8. Na základě restrikčních paternů vzniklých enzymatickým štěpením byly určeny další subtypy lidského papilomaviru typu 6, což je popsáno v publikacích Gissmann, L., et al. 1983. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:560-3; Mounts, P., et al. 1982. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:5425-9.
Několik skupin ukázalo, že lidský papilomavirus typu 6a je převažující suptyp vyskytující se v biopsiích pacientů s výskytem condyloma acuminatum v USA a v Evropě. Současné zprávy naznačují, že lidský papilomavirus typu 6a je prototyp lidského papilomaviru typu 6, jak se uvádí v Kitasato, H., et al. 1994. J. Gen. Virol. 75:1157-1162. Odhaduje se, že v USA jedno procento mužů a žen ve věkové skupině 15 až 49 let dochází k lékaři s výskytem condyloma acuminatum. Bohužel, účinná léčba nemocí způsobených lidskými papilomaviry neexistuje. Proto je vakcína značně žádoucí. Určení sekvence pozdních a časných genů většiny běžných lidských papilomavirových subtypů je kriticky důležitá pro vývoj profylaktické a léčebné vakcíny.
Omezené sekvenční informace o lidském papilomaviru typu
6a (HPV6a) obsahují dlouhou regulační oblast (LCR) a E6 a E7 otevřené čtecí rámce. Přihláška popisuje klonování lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) získaného z biopsie z condyloma acuminatum, určení úplné sekvence virové DNK a odpovídajících aminokyselinových sekvencí hlavních otevřených čtecích rámců lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a).
Vynález se týká molekul DNK kódujících čištěný papilomavirus typu 6a (HPV typ 6a; HPV6a} a použití molekul
DNK.
Podstata vynálezu
Vynález se týká molekul DNK kódujících čištěný lidský papilomavirus typu 6A (HPV typ 6a; HPVSa) a jejich derivátů. Takové deriváty zahrnují, ale nejsou omezeny pouze na, peptidy a proteiny kódované DNK, protilátky specifické k DNK nebo protilátky specifické k proteinům kódovaných DNK, vakcíny obsahující DNK nebo vakcíny obsahující proteiny kódované DNK, imunologické kompozice obsahující DNK nebo proteiny kódované DNK, soupravy obsahující DNK nebo RNK, které jsou odvozené od DNK nebo proteinů kódovaných DNK.
Lidský papilomavirus typ 6 je hlavní kauzativní agens benigních lézí sliznic pohlavních orgánů a dýchacího ústrojí (condyloma acuminatum). Byla určena úplná nukleotidová sekvence lidského papilomaviru typu 6b, který je původní izolát lidského papilomaviru typu 6. Na základě restrikčních paternů vzniklých enzymatickým štěpením byly určeny další subtypy lidského papilomaviru typu 6.
Několik skupin ukázalo, že lidský papilomavirus typu 6a je převažující suptyp vyskytující se v biopsiích pacientů z condyloma acuminatum v USA a v Evropě. Odhaduje se, že v samotných USA jedno procento mužů a žen ve věkové skupině 15 až 49 let docházejí k lékaři s výskytem condyloma acuminatum. Bohužel, účinná léčba nemocí způsobených lidskými papilomaviry neexistuje. Proto je vakcína značně žádoucí. Určení sekvence pozdních a časných genů většiny běžných
Remington's Pharmaceutial farmaceuticky přijatelné lidských papilomavirových subtypů je kriticky důležitá pro vývoj profylaktické a léčebné vakciny.
Omezené sekvenční informace o lidském papilomaviru typu 6a (HPV6a) obsahuji dlouhou regulační oblast (LCR) a E6 a E7 otevřené čtecí rámce. Přihláška popisuje klonování lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) získaného z biopsie z condyloma acuminatum, určení úplné sekvence virové DNK a odpovídájících aminokyselinových sekvencí hlavních otevřených čtecích rámců lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Vynález se týká molekul DNK kódujících čištěný papilomavirus typu 6a a deriváty molekul DNK.
Farmaceuticky využitelné kompozice obsahující DNK nebo proteiny kódované DNK se mohou tvořit podle známých metod jako je přidáni farmaceuticky přijatelných nosičů. Příklady takových nosičů a metod tvoření kompozic se nachází v Sciences. Za účelem vytvoření kompozice vhodné pro účinnou aplikaci, tyto kompozice obsahují účinné množství proteinu nebo partikul! podobných virovým partikulím (virus-like Takové kompozice mohou obsahovat proteiny podobné virovým partikulím (virus-like odvozené z více než jednoho typu lidského particles; VLP) nebo partikule particles; VLP) papilomaviru.
Léčebné nebo diagnostické kompozice podle vynálezu se podávají osobě v množství, které je dostatečné pro léčení nebo diagnostiku papilomavirových infekcí. Účinné množství může kolísat podle řady faktorů, takových jako jsou individuální kondice, váha, pohlaví a věk. Jiné faktory zahrnují způsob podání. Většinou se kompozice podává v dávkách v rozmezí přibližně od lpg do lmg.
Existují různé způsoby podávání farmaceutických kompozic, jako jsou podkožní, lokální, ústní, mukosální, intravenozní a intramuskulární.
Vakcíny podle vynálezu obsahují DNK, RNK nebo proteiny kódované DNK, které obsahují antigenní determinanty nezbytné pro vyvolání tvoření neutralizujících protilátek v hostiteli. Takové vakcíny jsou dostatečně bezpečné, aby se mohly podávat bez nebezpečí klinické infekce; nemají toxické vedlejší účinky; mohou se podávat účinným způsobem, jsou stabilní a kompatibilní s vakcínovými nosiči.
Vakcíny se mohou podávat rozličnými způsoby: ústně, parenterálně, podkožně, mukozálně, intravenózně nebo intramuskulárně. Dávka kolísá v závislosti na kondici, pohlaví, váze a věku osoby; na způsobu podání; a typu papilomaviru, který se ve vakcíně použil. Vakcína se může podávat ve formě kapsulí, suspenzí, elixírů nebo kapalných roztoků. Vakcína se může tvořit s imunologicky přijatelným nosičem.
Vakcíny se podávají v množství, které je účinné pro léčbu, což znamená v množství dostatečném pro vyvolání imunologicky ochranné odezvy. Účinné množství pro léčbu může kolísat podle typu papilomaviru. Vakcína se může podávat v jedné nebo více dávkách.
DNK a deriváty DNK podle vynálezu se mohou používat při tvoření imunogenních kompozic. Takové kompozice, po jejich zavedení do vhodného hostitele, jsou schopny vyvolat v hostiteli imunní odezvu.
DNK nebo její deriváty se mohou používat pro tvorbu protilátek. Zde použitý termín protilátka zahrnuje polyklonální i monoklonální protilátky, stejně jako jejich fragmenty takové, jako jsou Fv, Fab a F(ab}2 fragmenty, které jsou schopné vazby na antigen nebo hapten.
DNK a deriváty DNK podle vynálezu se mohou používat pro skríning lidských papilomavirů a určení serotypu infikujícího lidského papilomaviru. DNK, rekombinantní proteiny, partikule podobné virovým partikulím (virus-like particles; VLP) a protilátky se používají pro vytvoření soupravy vhodné pro detekci a serotypování lidských papilomavirů. Taková souprava by měla obsahovat nejméně jeden oddělený kontejner, ve kterém bude těsně uzavřen nosič. Nosič by měl zahrnovat reagencii, kterou je DNK lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a), rekombinantní protein Lidského papilomavirů (HPV) nebo partikule podobné virovým partikulím (virus-like particles; VLP) nebo protilátky proti lidskému papilomavirů (anti-HPV protilátky), vhodnou pro detekci rozličných typů lidských papilomavirů. Další součástí nosiče, pro účel detekce, může být značený antigen nebo enzymové substráty a podobně.
DNK a od ní odvozené proteiny se také používají jako markéry pro určení molekulární váhy a velikosti molekul.
Vzhledem k tomu, že genetický kód je degenerován, může se používat více než jeden kodón pro kódování jednotlivé aminokyseliny, a proto aminokyselinová sekvence může být kódována libovolnou sadou podobných oligonukleotidů DNK. Pouze jeden člen této sady bude shodný se sekvencí lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a), ale bude schopný za vhodných podmínek hybridizovat s DNK lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) dokonce i v přítomnosti oligonukleotidů DNK s chybným párováním. Při alternativních podmínkách oligonukleotidy DNK s chybným párováním mohou stále hybridizovat s DNK lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) a tak umožňují detekci a izolaci DNK, která kóduje lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a).
Čištěná DNK lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) podle vynálezu nebo její fragmenty se mohou používat pro izolaci a čištění homologů a fragmentů lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) z jiných zdrojů. Za tímto účelem se nejdříve DNK lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) smíchá za vhodných hybridizačních podmínek se vzorkem, který obsahuje DNK kódující homology lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a). Dále se může izolovat komplex hybridizované DNK, z něhož se může získat DNK kódující homologní DNK.
Je známo, že různé kodóny, které kódují specifické aminokyseliny, obsahují podstatné množství nadbytečné informace. Proto se tento vynález také týká těch sekvencí DNK, které obsahují alternativní kodóny kódující konečnou translaci shodné aminokyseliny. Pro účely této specifikace sekvence nesoucí jeden nebo více zaměnitelných kodónú se budou definovat jako degenerovaná varianta. Předmětem vynálezu jsou také mutace. Jde o mutace sekvence DNK nebo ranslačního proteinu, který v podstatě nemění konečné fyzikální vlastnosti exprimovaného proteinu. Například náhrada valinu leucinem, argininu lysinem nebo asparaginu glutaminem nemůže změnit funkčnost peptidu.
Je známo, že sekvence DNK kódující peptid se mohou změnit tak, aby kódovaly peptid mající vlastnosti odlišné od těch, jenž charakterizují přirozeně se vyskytující peptid. Metody pozměňující sekvence DNK zahrnují, ale nejsou omezeny na místně cílenou mutagenezí.
Zde používaný termín funkční derivát lidského papiíomaviru typu 6a (HPV6a) znamená látku, která má biologickou aktivitu (buď funkční nebo strukturní), která se podstatně podobá biologické aktivitě lidského papiíomaviru typu 6a (HPV6a). Termín funkční deriváty zahrnuje fragmenty, varianty, degenerované varianty, analogy a homology nebo chemické deriváty lidského papiíomaviru typu 6a (HPV6a). Termín fragment se vztahuje na libovolný polypeptidu lidského papiíomaviru typu 6a (HPV6a). Termín varianta znamená molekulu podstatně podobnou strukturou a funkcí buď celé molekule lidského papiíomaviru typu 6a (HPV6a) nebo jejímu fragmentu. Molekula je podstatně podobná lidskému papiíomaviru typu 6a (HPV6a), jestliže obě molekuly mají podstatně podobnou strukturu nebo jestliže obě molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. Proto, jestliže dvě molekuly mají podstatně podobnou aktivitu, jsou považovány za varianty dokonce, jestliže struktura jedné z molekul se nenachází u té druhé nebo dokonce, jestliže dvě aminokyselinové sekvence nejsou identické. Termín funkční derivát nezahrnuje lidský papilomavirus typu 6b (HPV6b).
Termín analog znamená molekulu podstatně funkčně podobnou buď celé molekule lidského papilomaviru typu 6a (HPVSa) nebo jejímu fragmentu.
Pro klonování DNK lidského papilomaviru typu 6a (HPVSa) se mohou používat různé metody. Tyto metody zahrnují, ale nejsou omezeny na přímou funkční expresi genů lidského papilomaviru typu 6a (HPVSa), po níž následuje konstrukce cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPVSa) nebo knihovny genomové DNK ve vhodném expressivním vektorovém systému. Další metodou je skríning cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPVSa) nebo knihovny genomové DNK, vytvořené v bakteriofágu nebo v plazmidovém vektoru, pomocí značené oligonukleotidové sondy odvozené z aminokyselinové sekvence lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Další metody zahrnují skríning cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPVSa} nebo knihovny genomové DNK, vytvořené v bakteriofágu nebo v plazmidovém vektoru, neúplnou DNK, která kóduje lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) . Tato parciální DNK se získá amplifikací DNK fragmnetu lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) pomocí specifické polymerázové řetězové reakce (PCR), pro kterou je třeba vytvořit degenerované primery z aminokyselinové sekvence čištěného lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Další metoda je izolace RNK z buněk produkujících lidský papilomavirus typ 6a (HPVSa) a translace RNK na protein pomocí in vitro nebo in vivo translačního systému. Translace RNK na peptid nebo protein povede k produkci nejméně části proteinu HPVSa, který se může určit například aktivitou tohoto proteinu nebo imunologickou reaktivitou s anti-HPV6a protilátkami. Při této metodě se může zkoumat celková RNK izolovaná z buněk produkujících lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) pro přítomnost RNK kódující při nejmenším část lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Další frakcionace celkové RNK proběhne oddělením RNK lidského papilomaviru typu 6a od ostatní RNK. Peptid nebo protein produkovaný touto metodou se může zkoumat za účelem poskytnutí aminokyselinových sekvencí, které se používají pro vytvoření primerů pro produkci cDNK lidského papilomaviru typu 6a. Dále RNK používaná pro translaci se může zkoumat za účelem poskytnutí nukleotidových sekvencí kódujících lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) a sond vhodných pro skríning knihovny cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a). Tyto metody jsou v oboru známy a jsou uvedeny například v publikaci Sambrook,j., Fritsch,E.F., Maniatis,T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.
Je zřejmé, že další typy knihoven stejně jako knihovny vytvořené z jiných buněk nebo buněčných typů se mohou použít pro izolaci DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a). Další typy knihoven zahrnují, ale nejsou omezeny na knihovny cDNK odvozené z jiných buněk nebo buněčných linií, které obsahují lidský papilomavirus typ 6a nebo knihovny genomové DNK.
Řada metod je vhodná pro přípravu knihoven cDNK. Tyto metody se uvádějí například v publikaci Sambrook, J., et al. jak je shora uvedeno. Je zřejmé, že DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a se může také izolovat z vhodné knihovny genomové DNK. Pro vytvoření knihoven genomové DNK se může použít řada metod, které se popisují v publikaci Sambrook,J., at al. jak je shora uvedeno.
Klonovaná DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo její fragmenty, které je možné získat zde popsanými metodami, se mohou po molekulárním klonování do expresních vektorů obsahujících vhodný promotor a další vhodné transkripční regulační elementy rekombinantně exprimovat. Tyto vektory se vnáší do prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk za účelem produkce rekombinantního lidského papilomaviru typu 6a. Metody pro uvedené manipulace se plně popisují v publikaci Sambrook. J., et al. jak je shora uvedeno a jsou známy v oboru.
Expresívní vektory se zde definují jako sekvence DNK, které se vyžadují pro transkripci klonovaných kopií genů a translaci jejich mRNK ve vhodném hostiteli. Takové vektory se mohou používat pro expresi eukaryontních genů v různých hostitelích jako jsou bakterie, sinice, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky hub a živočišné buňky. Specificky vytvořené vektory umožňují přenos DNK mezi hostiteli takovými jako jsou bakterie-kvasinka nebo bakterie-živočišná buňka nebo bakterie-buňky hub nebo bakterie-buňky obratlovců. Vhodně konstruovaný expresívní vektor by měl obsahovat: počátek replikace pro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, selekční markéry, omezený počet restrikčních míst, potenciál pro vysoký počet kopií a aktivní promotory. Promotor se definuje jako sekvence DNK, která řídí RNK polymerázu, aby se navázala na DNK a tak inicijovala syntézu RNK. Silný promotor se vyznačuje vysokou frekvencí iniciace transkripce. Expresívní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na klonovací vektory, modifikované klonovací vektory, specificky vytvořené plazmidy nebo viry.
Různé savčí expresívní vektory se nohou používat k expresi DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo jejích fragmentů v savčích buňkách. Běžně dostupné savčí expresívní vektory, které mohou být vhodné pro rekombinantní expresi lidského papilomavirů typu 6a, zahrnují, ale nejsou omezeny na pcDNA3 (Invitrogen) , pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593}pBV-1(8-2) (ATCC37110) , pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt(ATCC 37199), pRSVneo(ATCC 37198), pSV2dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC 37460) a %ZD35(ATCC 37565).
Různé bakteriální expresívní vektory se mohou používat k expresi DNK lidského papilomavirů typu 6a nebo jejích fragmentů v bakteriálních buňkách. Běžně dostupné bakteriální expresívní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na pETIIa (Novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia}.
Různé expresívní vektory hub se mohou používat k expresi DNK lidského papilomavirů typu 6a nebo jejích fragmentů v buňkách hub. Běžně dostupné expresívní vektory hub zahrnují, ale nejsou omezeny na pYES2 (Invitrogen) a Pichia expresívní vektor (Invitrogen).
Různé expresívní vektory hmyzích buněk se mohou používat k expresi DNK lidského papilomavirů typu 6a nebo jejích fragmentů v hmyzích buňkách. Běžně dostupné expresívní vektory hmyzích buněk zahrnují, ale nejsou omezeny na pBlue Bac III (Invitrogen).
Expresívní vektor obsahující DNK, kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) , nebo její fragmenty se může použít pro expresi HPV6a proteinů nebo fragmentů HPV6a proteinů v buňce, tkáních, orgánech nebo v živočiších (zahrnují se i lidé). Hostitelské buňky mohou být prokaryontní nebo eukaryontní, zahrnují, ale nejsou omezeny na bakteria jako je E.coli, buňky hub jako je kvasinka, savčí buňky zahrnující, ale nejsou omezeny na buněčné linie lidského, hovězího, prasečího, opičího původu a linie pocházející z hlodavců, dále hmyzí buňky zahrnující, ale nejsou omezeny na buněčné linie získané z Drosophila a z housenek bource morušového. Vhodné a dostupné buněčné linie získané ze savčích druhů zahrnují, ale nejsou omezeny na L buňky L-M(TK) (ATCC CCL 1.3), L buňky L-M(ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573, Raji(ATCC CCL 86), CV-1(ATCC CCL 70), COS1 (ATCC CRL 1650), COS-7(ATCC CRL 1651), CHO-K1(ATCc CRL 1651), CHOK-K1(ATCC CCL 61), 3T3(ATCC CCL 92), NIH/3T3(ZTCC
CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C1(ATCC CCL 26) a MRC-5(ATCC CCL 171).
Expresívní vektory se mohou vnést do hostitelských buněk za použití jedné z řady metod, mezi něž patří transformace, transfekce, lipofekce, fúze protoplastů a elektroporace. Buňky obsahující expresívní vektory se klonálně pomnožují a zkoumá se jejich schopnost produkovat HPV6a protein. Pro určení klonu hostitelských buněk exprimujících lidský papilomavirus typu 6a se může použít několik způsobů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na imunologickou reaktivitu s protilátkami proti lidskému papilomaviru typu 6a a prokázání jisté aktivity hostitelských buněk, která je spjata s výskytem lidského papilomaviru typu 6a. Jde o navázání ligandů specifických pro lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) nebo o signální transdukci, která se definuje jako odezva zprostředkovaná interakcí HPV6a specifických ligandů s lidským papilomavirem typu 6a.
K expresi fragmentů DNK lidského papilomaviru se také používá in vitro produkovaná syntetická mRNK nebo přirozená mRNK. Syntetická mRNK nebo mRNK izolovaná z buněk produkujících lidský papilomavirus typu 6a se může účinně překládat v různých bezbuněčných systémech, které zahrnují, ale nejsou omezeny na extrakty moučných červů a extrakty retikulocytů, stejně jako v buněčných systémech, které zahrnují, ale nejsou omezeny na preferovanou mikroinjektáž do žabích oocytů.
Následuje exprese HPV6a proteinu(ů) v hostitelské buňce. HPV6a protein se izoluje za účelem získání jeho čisté formy. Existuje několik vhodných a dostupných metod pro čištění HPV6a proteinu. Jak se zde popisuje, rekombinantní HPV6a protein se může čistit z buněčného lyzátu samostatnou aplikací nebo různými kombinacemi metod, mezi něž patří frakcionace pomocí solí, iontoměníčová chromatografie, vylučovací chromatografie, adsorpční chromatografie na hydroxylapatitu, chromatografie založená na hydrofobních interakcích.
Dále rekombinantní HPV6a protein může být oddělen od jiných buněčných proteinů použitím imunoafinitních kolon obsahujících monoklonální nebo polyklonální protilátky, které jsou specifické pro plnou délku vznikajícího HPV6a proteinu nebo jeho polypeptidového fragmentu. Existuje řada metod pro přípravu monoklonálních a polyklonálních protilátek. Monoklonální a monospecifické protilátky zde používané jsou definovány jako jediný druh protilátek nebo vícečetný protilátkový druh s homogenní vazebnou charakterakteristikou vzhledem k HPV6a proteinu. Homogenní vazebnost je zde definována jako schopnost určitého druhu protilátek vázat se na specifický epitop nebo antigen.
Je zřejmé, že metody pro produkci monospecifických protilátek se mohou využít k přípravě protilátek, které jsou specifické vůči fragmentům HPV6a polypeptidů nebo vůči celé délce nascentního HPV6a polypeptidů. Mohou se tedy tvořit protilátky, které jsou specifické pro zcela funkční HPV6a protein nebo jeho fragmenty.
Tento vynález se týká metod vhodných pro vyhledávání sloučenin, které modulují expresi DNK nebo RNK kódujících HPV6a protein stejně jako funkci(e) HPV6a proteinu(ů) in vivo. Sloučeniny, které modulují tyto aktivity mohou být DNK, RNK, peptidy, proteiny nebo neproteinové organické molekuly.
Tyto látky mohou, zvýšit nebo utlumit expresi DNK nebo RNK kódující HPV6a protein nebo mohou ovlivnit funkci tohoto proteinu. Pro detekci zmíněných látek existuje řada testů. Jeden druh testů jsou tzv. ano/ne testy, které se používají pro určení změn v expresi nebo ve funkci. Test se může hodnotit kvantitativně srovnáním exprese nebo funkce testovaného vzorku se standardním vzorkem.
Jestliže souprava obsahuje DNK lidského papilomaviru typu 5a, fragmenty DNK lidského papilomaviru typu 6a, protilátky proti DNK lidského papilomaviru typu 6a nebo proti HPV6a proteinu, může se připravit RNK lidského papilomaviru typu 6a nebo HPV6a protein. Takové soupravy se používají pro detekci DNK, která hybridizuje s DNK lidského papilomaviru typu 6a, nebo pro detekci přítomnosti HPV6a proteinu(ů) nebo peptidových fragmentů ve vzorku. Taková charakterizace je využitelná pro různé účely mezi něž patří, aie nejsou omezeny na soudní analýzy a epidemiologické studie.
Nukleotidové sekvence, které jsou komplementární k DNK sekvenci kódující lidský papilomavirus typu 6a, se mohou syntetizovat za účelem tzv. antisense terapie (brání transkripci DNK) . Mezi molekuly s uvedenou schopností patří DNK, stabilní deriváty DNK jako jsou fosforothioaty a nebo methylfosfonáty, RNK, stabilní deriváty RNK takové jako 2'-0alkylRNK nebo jiné antioligonukleotidové napodobeniny lidského papilomaviru typu 6a. Anti-molekuly lidského papilomaviru typu 6a se vnáší do buněk mikroinjektáží, lipozomovou kapsulací nebo pomocí v buňce exprimováného vektoru, který nese anti-sekvenci. HPV6a antisense terapie se může zvláště využít při léčení onemocnění, kde je nutné redukovat aktivitu lidského papilomaviru typu 6a.
Termín chemický derivát popisuje molekulu, která obsahuje další chemické části, které normálně nejsou součástí molekuly. Takové chemické části mohou zlepšit například rozpustnost, poločas rozpadu, absorbci základní molekuly. Naopak chemické části mohou i utlumit nežádoucí vedlejší účinky základní molekuly nebo její toxicitu. Příklady takových chemických částí jsou popsány v různých publikacích jako je Remington's Pharmaceutical Sciences.
Látky, které se určují metodami zde uvedenými, se mohou užívat samostatně ve vhodných dávkách stanovených rutinními testy za účelem dosažení optimální inhibice lidského papilomaviru typu 6a nebo jeho aktivity, přičemž se minimalizuje potenciální toxicita. Navíc se může vyžadovat současné nebo následné podávání dalších agens.
Výhodné je podávat látky podle vynálezu jedenkrát denně nebo rozdělit celkovou denní dávku do více dávek. Látky se mohou podávat různými způsoby například: intranasálně, transdermálně, formou čípků, ústně a podobně.
Při kombinované léčbě s více než jedním aktivním agens, kde aktivní látky existují v oddělených dávkových formách, se mohou tyto látky podávat současně nebo rozloženě v jiném čase.
Dávkový režim látek podle vynálezu je závislý na mnoha faktorech, například typ, specie, věk, váha, pohlaví a zdravotní stav pacienta; pacientova funkce ledvin a jater; a zvláště použitá aktivní látka. Lékař může snadno určit a předepsat účinné množství léku, které je nutné pro prevenci, kontrolu nebo zastavení postupu příznaků. Určení rozmezí koncentrace léku, ve kterém je látka účinná a ne toxická, vyžaduje optimální přesnost. Účinná koncentrace aktivní látky je závislá na kinetice její dostupnosti v cílových místech, což zahrnuje distribuci, rovnováhu a vylučování léku.
U metod podle vynálezu zde popsané látky mohou tvořit aktivní přísady a jsou většinou podávány ve směsi s vhodně vybranými farmaceuticky přijatelnými ředidly nebo nosiči (zde jsou shrnuty pod název nosné materiály) s ohledem na zamýšlenou formu podávání, to je orální tablety, kapsule, elixíry, syrup, čípky, gely a podobně, v souladu s běžnou farmaceutickou praxí.
Například za účelem ústního podávání tabletových nebo kapsulových forem se může aktivní látka kombinovat s orálním, netoxickým, farmaceuticky přijatelným, inertním nosičem jako je etanol, glycerol, voda a podobně. Pokud je to nutné, do směsi se dále mohou začlenit pojivá, maziva, dezintegrační a barvící činidla. Vhodná pojivá jsou škrob, želatina, přírodní cukry jako jsou glukóza nebo beta-laktóza, kukuřičná sladidla, přirozené nebo syntetické gumy jako jsou akácie, tragekant nebo alginat sodný, karboxymethylceluloza, polyethylenglykol, vosky a podobně. Maziva, která se používají v těchto dávkovačích formách zahrnují oleát sodný, srearat sodný, stearat hořečnatý, benzoat sodný, acetat sodný, chlorid sodný a podobně. Dezintegrační činidla zahrnují škrob, methylcelulozu, agar, bentonit, xanthanovou gumu a podobně.
Lokální přípravky obsahují aktivní složku, která může být ve směsi s různými nosičovými materiály dobře známými v oboru, jsou to alkoholy, gel aloe vera, allantoin, glycerin, oleje s vitaminem A a E, minerální olej, PPG2 myristylpropionat a podobně, tvoří například alkoholické roztoky, lokální čističe, čistící krémy, kožní gely, pleťové vody nebo krémové nebo geiové šampóny.
Látky podle vynálezu se mohou také podávat pomocí lipozomálních zaváděcích systémů, jako jsou malé unilamelární váčky, velké unilamelární váčky a multilarnelární váčky. Liposomy se mohou tvořit z různých fosfolipidů, jako jsou cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny.
Látky podle vynálezu se mohou také zavádět pomocí monoklonálních protilátek, které slouží jako jednotlivé nosiče, s nimiž je molekula látky spojena. Látky podle vynálezu se mohou také spojovat s rozpustnými polymery, které slouží jako cílitelné nosiče. Takové polymery zahrnují polyvinylpyrrolidon, kopolymer pyranu, polyhydroxypropylmetha krylamid-fenol, polyhydroxyethylaspartamid-fenol nebo polyethyleneoxid-polylysin substituovaný palmitoylovým zbytkem. Dále se látky podle vynálezu mohou vázat na biologicky rozložitelné polymery, které se používají pro řízené uvolňování léků, jsou to například polymer kyseliny mléčné, polyepsilon kaprolaktonu, kyselina polyhydroxykaprolaktonová, kyselina polyhydroxybutanová, polyortoestery, polyacetaly, polykyanoakryiaty a zesíťované nebo kopolymery hydrogelů.
poiydihydropyrany, amfipatické blokové
Přehled obrázků na výkresech
Na obrázku č. 1 je znázorněna nukleotidová sekvence lidského papilomaviru typu 6a.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Extrakce nukleové kyseliny z biopsie.
Od 25-ti letě pacientky po porodu se získala velká vulvární léze condyloma acuminatum. Fragment této léze se zamrazil v kapalném dusíku, pak se zpracoval Braunovým mikrodismembratorem II (B.Braun Instruments, Melsungen, Germany}. Výsledný materiál se rozpustil v 0,6 % (hmotnost/objem) dodecylsulfátu sodném (SDS), natrávil se proteinasou K v množství 50 gg/ml a extrahoval se směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol. DNK se vysrážela etanolem a její množství se určilo UV spektrofotometricky. Přítomnost DNK s vysokou molekulární váhou se prokázala elektroforezou na agarosovém gelu a následným obarvaním ethidium bromidem.
Příklad 2: Typování DNK lidského papilomaviru.
DNK lidského papilomaviru (HPV) se určila použitím hybridního záchytového testu, který se nazývá Vira Type Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD) . Užívané HPV sondy se rozdělily na dvě části, jejichž složení je dáno vztahem každého typu k maligním nádorům genitálního traktu. Skupina sond označena jako skupina A obsahuje málo rizikové typy lidského papilomaviru (HPV), jsou to typ 6, 11,42,43 a 44. Sonda B obsahuje vysoce rizikové typy 16,18,31,33,35,45,51 a 56. Za účelem určení subtypu lidského papilomaviru (HPV) se celková DNK štěpila restrikčními endonuklazami Pstl, BamHI a HindlII a následující Sothernův přenos proběhl za vysoce přísných podmínek, teplota tání byla 15°C.
Příklad 3: Klonování genomu lidského papilomaviru typu 6a.
Celková DNK, která se extrahovala ze vzorku HPV6apozitivní biopsie, se štěpila endonukleazou HindlII. Dále následuje dělení na základě velikosti na 0,8 % preparačním gelu vyhotoveném z agarosy tající za nízké teploty. Z gelu se vyřízla oblast obsahující DNK o velikosti přibližně 8 000 párů baží (bp) a agarosa se štěpila s enzymem Gelase™ (Epicentre Technologies, lne., Madison, WI), vzorek se ligoval do vektor pUC18 (Pharmacia, lne., Piscataway, NJ) štěpeným eznymem HindlII a pak defosforylovaným. Následovala transformace kompetentních DH5 buněk E.coli (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD) . Z plazmidové knihovny se vybraly klony pozitivní na HPV6a pomocí hybridizace kolonií s oligonukleotidem odvozeným z pozitivního řetězce DNK značeným 32P. Oligonukleotid je komplementárního k 3'- konci LI genu lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) (5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'; SEQ ID NO:1). Izoloval se plazmid pUC18 obsahující 8,1 kbp velký genom lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) a charakterizoval se pomocí štěpení restrikčním enzymem a Southernovým přenosem. Tento plazmid se označil jako pUC18-HPV6a. Plazmidová DNK se připravila použitím Quigen™ Plasmid Maxi kit (Qu igen lne., Chatsworth, CA).
Příklad 4: Sekvenční analýza plazmidu pUC18-HPV6a.
Za účelem určení celé sekvence lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se na základě uveřejněné sekvence lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) syntetizoval sekvenční primer. Sekvenovaly se oba řetězce celého 8,1 kbp velkého genomu lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) pomocí dideoxy řetězové terminační metody za použití soupravy PRISM™ a automatizovaného sekvenátoru Applied Biosystems (ABI) (č. 373A) . Při sekvenaci se postupovalo podle instrukcí výrobce (ABI, lne., Foster City, CA). V případech, kde antikódující a kódující sekvence nesouhlasí, syntetizovaly se další HPV6a specifické primery za účelem znovu sekvenovat spornou oblast v obou směrech.
Srovnání celé sekvence lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se zveřejněnou sekvencí lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) je znázorněno na obrázku číslo 1. Báze znázorněny pod sekvencí lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) odpovídají sekvenci lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b). Sekvence DNK HPV6a a HPV6b jsou z 97% shodné, obsahují z celkového počtu 8 010 párů baží 229 párů baží odlišných. Ve srovnání se sekvencí lidského papilomaviru typu 6b (HPV6b) se našly nejpodstatnější rozdíly v dlouhé regulační oblasti (LCR; v poloze nukleotid 7 205 až nukleotid 106). Nezávisle na několika jednotlivých změnách nukleotidů v dlouhé regulační oblasti lidského papilomaviru typu 6a, se našly dvě inzerce. Jedna je 94 párů baží velká a nachází se v poloze nukleotid
350 a druhá je 19 párů baží velká a je umístěna v poloze nukleotid 7 804. Ve srovnání s genomem lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) se našla v poloze nukleotid 7 615 delece o velikosti 6 párů baží.
Příklad 5: Sekvenční změny otevřených čtecích rámců lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) ve srovnání s lidským papilomavirem typu 6b (HPV6b).
V sekvenci lidského papilomavirů typu 6a (HPV6a) se určily otevřené čtecí rámce. Hlavní otevřené čtecí rámce (ORF) se přeložily do aminokyselinových sekvencí a srovnaly se se sekvencemi lidského papilomavirů typu 6b (HPV6b).
Pouze otevřený čtecí rámec (ORF) hlavního kapsidového proteinu LI byl shodný se sekvencí lidského papilomavirů typu 6b (HPV6b). Všechny ostatní otevřené čtecí rámce vykazují změny aminokyselin, které jsou shrnuty v tabulce 1. Minorní kapsidový protein L2 vykazuje 5 odlišných aminokyselin; každý otevřený čtecí rámec F6 a E7 vykazuje změnu jedné aminokyseliny. V proteinu označeném El je 6 aminokyselin odlišných, v proteinu E2 je to 11 aminokyselin. V proteinu označeném E4 se našly 4 odlišné aminokyseliny. Otevřený čtecí rámec E5a měl změny na čtyřech místech a otevřený čtecí rámec E5b na sedmi místech.
Tabulka č. 1 srovnání sekvenčních změn nacházejících se v otevřených čtecích rámcích E6, E7, El, E2, E4, E5 a L2 lidského papilomavirů typu 6a a lidského papilomavirů typu 6b
Otevřené čtecí Poloha Poloha Změna rámce nukleotid aminokyselina aminokyseliny
E6 252 50
His—»Gln
| E7 | 792 | 88 | Asp—>Asn |
| El | 1535, 1536 | 235 | Leu—»Ala |
| 1670 | 280 | Leu—»val | |
| 1741 | 303 | Glu-»Asp | |
| 2208 | 459 | Thr-+Ser | |
| 2557 | 575 | Asp-+Glu | |
| 2654 | 608 | Thr->Ala | |
| E2 | 2802 | 27 | His—>Asp |
| 2974 | 94 | Arg—>Lys | |
| 3148 | 142 | Asn—»Thr | |
| 3153 | 144 | Thr-»Ser | |
| 3272 | 193 | His—>Gln | |
| 3388 | 222 | Leu—>Pro | |
| 3450 | 227 | Lys —>G 1 n | |
| 3643 | 307 | Arg—>Lys | |
| 3693 | 324 | Ser—>Pro | |
| 3735 | 338 | Asp—>His | |
| 3765 | 348 | Asp—>Asn | |
| 3794 | 357 | Ser—>Arg | |
| E4 | 3272 | 6 | Ile—>Asn |
| 3388 | 60 | Gly—>Glu | |
| 3461 | 69 | Pro—»His | |
| 3552 | 99 | Asp—>Glu | |
| E5a | 3935 | 16 | Phe—>Leu |
| 4004 | 40 | Glu-»Asp | |
| 4137 | 84 | Tyr—>His | |
| 4150 | 88 | Thr—>Asn | |
| 4235 | 25 | Met—>Val | |
| 4297 | 45 | Lys—>Asn | |
| 4314 | 51 | Asn^-hr | |
| 4323 | 54 | Asp—»Ala | |
| 4343 | 61 | Tyr—>His | |
| 4346, | 4347 | 62 | Thr-»Asp |
| 4353 | 64 | Asp-»Ala | |
| 4646, | 4647 | 75 | Gin—»Gly |
| 4976 | 185 | Val—»Ile | |
| 5021 | 200 | Val->Ile | |
| 5490 | 356 | Gly->Asp | |
| 5597 | 392 | Leu—»Ile |
Příklad 6: Subklonování cDNK lidského papiíomaviru typu 6a (HPV6a) do expresívních vektorů.
Za účelem exprese HPV6a proteinu v transfektovaných hostitelských buňkách a in vitro transkripce/translace se cDNK kódující lidský papilomavirus typu 6a subklonovala do několika vektorů. Mezi tyto vektory patří pBluescript IISK+ (kde se exprese reguluje pomocí promotorů T7 nebo T3} , pcDNK I/Amp (kde se exprese reguluje promotorem cytomegaloviru (CMV)), pSZ9016-l (kde se exprese reguluje promotorem dlouhé koncové repetice HIV (LTR)) a vektor pVL1393, který se dá přenést do bakulírů (zde se exprese řídí promotorem polyhedrinu (PH)) za vzniku rekombinantních bakulirů obsahujících sekvenci DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a).
a) pBluescript IISK+:HPV6a. Klon cDNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se získal v plné délce z bakteriofágu lambda neúplným štěpením restrikčním enzymem EcoRi a ligoval se do vektoru pBluescript IISK+, který byl štěpen enzymem EcoRi a ošetřen telecí fosfatasou (calf intestine phosphatase, CIP) . Izolovaly se subklony, ve kterých HPV6a následoval za T7 nebo T3 promotorem.
b) pcDNK I/Amp:HPV6a. Za účelem přímého klonování HPV6a se jeho DNK získala štěpením restrikčními endonukleázami EcoRV a Xbal z izolovaného plazmidu pBluescript IISK+:HPV6a, ve kterém je sekvence DNK lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) orientovaná po směru transkripce od promotoru T7 . Výsledný EcoRV a Xbal fragment lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se po vyčištění ligoval do vektoru pcDNK I/Amp, který se štěpil enzymy EcoRV a Xbal za působení telecí fosfatasy (calf intestine phosphatase, CIP) . Po ligaci je DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) orientována po směru transkripce od promotoru cytomegaloviru (CMV).
c) pSZ9016-l:HPV6a. HPV6a se získal částečným štěpením pBluescript IISK+:HPV6a pomocí enzymu EcoRi a izolací 1,3 kilobazí velkého fragmentu z agarosového gelu. Výsledný EcoRi fragment HPV6a se ligoval do enzymem EcoRi štěpeného vektoru pSZ9016-l, který byl ošetřen telecí fosfatasou (calf intestine phosphatase; CIP) . Vybraly se subklony, kde HPV6a je orientován po směru transkripce od promotoru dlouhé koncové repetice HIV (LTR).
d) pVL1393:HPV6a a pVLl393:T7 HPVSa HA. Přímé klonování DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) do vektoru pVL1393, který se dá vnést do bakulovirů, probíhá v několika krocích. Nejdříve se uvolní HPV6a z vektoru pcDNKI/Amp:HPV6a štěpením s enzymy BamHI a Xbal, pak následuje ligace výsledného 1,3 kilobazí velkého fragmentu do vektoru pVL1393 štěpeného enzymy BamHI a Xbal a ošetřeného telecí fosfatasou (calf intestine phosphatase+ CIP) za vzniku vektoru pVL1393:HPV6a. HPV6a je epitop označený na svém 5'konci otevřeného čtecího rámce lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) manipulací T7 tag a na 3'-konci je to FluHA epitop. Tímto způsobem modifikovaná DNK lidského papilomaviru typu 6a se ligovala do restrikčních míst BamHI/Xbal vektoru pV11393 za vzniku pVL1393:T7 HPVóa HA.
Příklad 7: Exprese HPV6a polypeptidu pomocí in vitro transkripce/translace a transfekce do hostitelských buněk.
Vektory obsahující sekvence DNK lidského papilomaviru se používají pro translaci HPV6a polypeptidu v lyzátu králičích retikulocytů, v savčích hostitelských buněk a v hmyzích buňkách, které jsou infikovány bakuliry. Experimentální postupy jsou v podstatě ty, které popisují instrukce výrobce,
a) in vitro transkripce/translace. DNK plazmidu pBluescript IIISK+:HPV6a se linearizoval štěpením pomocí enzymu BamHI po směru transkripce inzertu HPV6a. Linearizovaný plazmid se čistil a sloužil jako templát pro transkripci {run-off transcription) za použití T7 RNK polymerázy v přítomnosti m7G(5')ppp(5')G. Výsledné transkripty lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se čistí srážením s LiCl a používají se pro translaci HPV6a v lyzátu králičích retikulocytů, které jsou ošetřeny nukleázou, za přítomnosti L-[J5S] methioninu.
b) Exprese v savčích buňkách. Po transfekci savčích hostitelských buněk s vektory pcDNK I/Amp:HPV6a (regulace promotorem cytomegaloviru (CMV)) nebo pSZ9016-l:HPV6a (regulace promotorem dlouhé koncové repetice HIV) následuje exprese HPV6a proteinu. Ve druhém zmiňovaném případě se buňky ko-transfektovaly s plazmidem pSZ90161:TAT, který exprimuje TAT. V obou případech plazmidů exprimujících HPV6a se buňky COS-7 transfektovaly buď DEAE-dextranem nebo lipofekcí pomocí Lipofektaminu (BRL).
c) Exprese v hmyzích buňkách. Vektor pVL1393:T7 HPV6a HA, který je vhodný pro přenos do bakulirů a obsahuje lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a) , se používá k produkci rekombinantních bakulirů (Autographa californica) pomocí in vivo homologní rekombinace. Epitop označený HPV6a se pak exprimuje v hmyzích buňkách Sf9 (Spodoptera frugiperda), které rostou v suspenzní kultuře s následující infekcí rekombinantním bakulirem, který obsahuje lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a).
Příklad 8:
Látky, které ovlivňují aktivitu lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se mohou určit pomocí různých metod. Metoda určující látky, které ovlivňují HPV6a se skládá z kroků:
a) smíchání testované látky s roztokem obsahující HPV6a za účelem vytvoření směsi;
b) měření aktivity HPV6a ve směsi; a
c) srovnání HPV6a ve směsi se standardem.
Látky, které ovlivňují aktivitu lidského papilomaviru typu 6a (HPV6a) se mohou použít pro farmaceutické kompozice. Takové farmaceutické kompozice jsou použitelné při léčení nemocí nebo stavů, které jsou charakterizovány infekcí lidským papilomavirem typu 6a (HPV6a).
Příklad 9:
DNK, která se svou strukturou blíží k DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a (HPV6a), se detekuje sondou. Vhodná sonda se může odvodit od DNK, která obsahuje celou nebo část nukleotidové sekvence znázorněné na obrázku 1, od RNK kódovaná DNK, která obsahuje celou nebo část nukleotidové sekvence znázorněné na obrázku 1 nebo lze použít degenerované oligonukleotidy odvozené z části sekvence znázorněné na obrázku 1.
Seznam sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID č.I:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 34 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (iii) znázornění sekvence: SEQ ID č.:l
GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC
Informace o sekvenci SEQ ID č.2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 8010 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNK (iii) znázornění sekvence: SEQ ID č.:2
H m H WS S. S z™ “ ' Z™ Z-»*-» A 1 fTVTS Ί* rRz™*™ * S » mz·' λ 5 «,
Λ ^<1 k A A A j. A „ .aAÁAá λ ΛΑΛ4 *ΛΛ**Γ*Λ\λ Λ . Am « -JVrrtÁA «'J1'· -zrs,*··<» i z’™·*™ -s s »i / ·» s m s, z· x <-·i« i z ιι«^,·ι « i z“· a z**«**«-n ÍT*ir»s « -s znz*>mi zptu mz* * m Ί z“>·*
\.,VtU*írtL AkJrtO.«*VJ > .^'.ΛΛ'^Λ'. J *. _ -, A-Am <- .A. — .Λ.Ιϊ'^Λ.Λ’· J mmz·· z-· * 1 smrms s Λ m z-··»·· z“»**^ ·/“*Λ * z“·1^*“·''· z™ i z-* m zzszm n mmz* * m » m « ‘'J'*-AAA * « A AX · k Qj k 'μ» k « . * kJX· &AAWAA X 'jVeAQ Jlw.AvrtVn . . aAa
G«“ i mu φΐ i 1 i s. z·-^ ,>*«> kwmrz» » z*''*·*'··'**’*·* mz* m s zn z-nm* i “ ζ“···»ζ·»·—
V» A X A k ΛΛΛ\ι ,,'Ι/νΛ’Λϊ^ 0· * kwX * » s—-JA *A**« '«A X A X AW*w 0» a J X kjk.
>«. _A*JAA-, * Λ x kJW ΑΛΑ * Λ s '/«<** s<»z·* ΛΑ ΛΑ« Χ.ΛΛ1'»’..·
AA LA-AVA1·S/sAS * mu M4 z·* * z· *. Z-**' ’ι** ?fWRz· i 'Fz'*'s mi mz1·“’
A<- . · ÍJA- λ^Π+Λ,'Λ,.Λ
TGlCACaAAC CGCTGxGTGa AGTAGAAAAG GTAArwiC.+T--* CAC -ΑΑΟΟλλ GGCGCGGCTC
ATAAAGGCAA ATCGTACGTG GAAGGGTCGC TGCCTACACT GCTGGACAAC ATGCATGGAA
0
220
L30
240
300
350
420
430
Ξ40
G4 f· ··, mrtrtlrtl * rt· «.Λ\« * imrt rrz A k - •J'—i „ Λ 1 va
ATTCACAACG
ACGGGCGACG
TGGGAAC.^CG
Ζ·-*^4 44 /·· 4 ΖΠ * ‘ Z^^4 rt » 4 4 z“ “ ^rt-rt> 4 z» 4 ζ4·Ζ»Ζ··44 i i . ,-ιΛηννΛ « Λ a - L 4 Λ - · .ίΑν AL·. .'J^.V.^ — .+»AVnC^, .
G-λ Ί i»W4 z-ζ«4 rt. * z* 4. z· «—z- » Ζ-» *1 >/*' «R-R * z—z»»·4 z*.· 4 /—··*·> 4 /·**· vaaa.avia únuAy^ a L.-vj .wjA.-JAvy . vwvavivwiu illTZ 4, Λ 4 Z- 4 4 /*· > Z4Z4rtR,—rt.4 Λ 5 řPH rt.rt»z4 * Zrtrtrt . . ..-AArtLrtA '—λ. . .‘,-.λλΛ .au ijnL- .-v
GGTGGGG^- AG GGkACAGAAA CAGACAGCAG AGAAGTGCAA ^ ·· p 5 rRRX/*!/“ ΖΤ4Ζ·«4Ζ·*«*^4 m^rn ζ·ζ·ζ»*» 4 4 ·, ,ί * rt»z44 4 z* 4
ΛνΛ'-Λ.Λν.ν ,'^J - wwx-Λ ζ,ί -, Lik* -ί'ιΛ'». i Jrtrt JrtVrtirtrtLz . -J . . Ijx. .'-Ji «JVrt
G*W» /··* w n* z* lrtW\J k -.i'—
G AC G GaC .ltí-G
TGTGACAGCA
C4 rtV*. a a 'w - 'J 4
ΛΛ 2.«?r\
| Z^Z^ 4 1 | W fP/ » z«1»4 '-Vrt a a -artW * | AC AG AAAAT G | AGGGGT CGGG | GGGG AC AG\j λ | m.1-1 **W74R4 f^zk ·* 4 W 4 a a A a | ZR4/--4 i,aa»iirfT a a-X^/Vl.LlXa - rt . |
| AGGG*i. AAG AC | GGAACAGGTA | CACAAATATC | AGAC*vAGGAG | zi a l^i·1· 4 rt'*’ 4 Ziza xJrt a VrtWrtVV | TGGAGGACAG |
| ZT>ZkziZizfl rrtZ-» 4 Z akjuw 4 _-L a -JZ-tV. | 4 1IV ''‘fp Z1 4 zi»R Λ -L <-rtJ k LnklAL a | řR^» >, . >WWi— * *▼*<· a «Λ. .VrtaVA | /“»·4 z-· λ « 4 m n mrň 'a.kí.Kj'.rtA , Λ i a | ACACACAATT | C CTGGG AAG C |
| 4 ii 4 z· « 4 mrRz4 rtVrtVWrt.. a a* | TTTAACAGGG | AGG AG*vC ννΛ | CACGGATTAT | IrtZ « WJA, a J | AG*-»rtC i a AAa |
| ACGAAAGTAT | TTAGGTAGTC | CATATGTTAG | 1^4 4 4 *V« *-·Λ.«*ΛΛΛ'ι | ACTATAGGGG | flL<j4ia-lU 4Wrt |
| 4 4 ZiZR/4 4 4 5 m-4 ÁAL» a VJ ΛΛΛ 1 .-Λ | AGTCGACGAT | 44Z—r 4 (Z-z.*.**· 4 *n L <JVrtLW a-Λ 4. | TAAACTTACA | AGACAGGGAA | AAAAGGTAAA |
GGGAC-vkj^w« j
AG^ « rtrt«, 5, Λ 5 /-·-! rt· JV/VVVVJVÍ.-l'AAA C AGGGG_-i /k ·— ' „ _ Λ<5 5 J Ml F4 51 rt»za <“» ί * Art · · Λνν>. _ .-v \*”G ***
AL Λ . Λ a Λ\.ΛΛ n 4 4 rR * * * rtL 4 .-W-Lf\ - ΛΛΛ ί« AAGCAAa - G
ΠΖ'*'** z-» 4 Z*·“^ . +j . aL.avv «
CGAAACTGTT rtřRrtrtrtrt 1 f»li zn <í 4 WV- Λ a Λ a
GGsjAG AGGGG
Z4 4 4 4 zi a (RW,· wfvuvjn · . sj 4
4 4 Z'** A /^iz* * > zH^5 5 ζ» rt«rt» 4 rt 4 rti^,4 Z a m*S íRrt rt zirR> |R^ a a .'•íVlAwwA UWřVlL •.‘'/'ki ÍJ'JA'..A k <Λ)Λ . ,“X 4 ‘•JOX- a Λ — a
GjťviCj^-AGj GAGauAAAC.-t, TGď-j*»,^j GruirtÁvjwj
ACAGGAAGGG ACAGAGAG^jkj GGAG^jrunC.^a AC--v.Gz\G^j^--j\j
CGGGAGGATG CAGGC.ACAGv, ACAjía2-i.TATT-j G^-n-TTG·—i-Ak y wn» ^»RTir· rtrti 5 Rrtwwni *> 1/-14 ζ5ζ·ζ-·^^η aartu”rr^-rri ,T1·' \»„-ik-AL --L LkΛη-G 4 i -λλ Avrun. j’-.-.
TTTAAAAGTG ATAAAACAAC ATGTGCAGAC TGGGTGGTAG
AGCATATCAG AGGGATTTGA AAAATTAATT GAGCCATTAA
TGGCTAACAA ATGCATGGGG AATGGTATTG TTAGTATTAG rt*^4 rt 4 4 rt»4 4 rtirtZRfTyaZ 1 Z«1 ZR H S* ' rtZRrtrt “ 5 4 rtrt»rt»zn4 Z«4rt 4 *
Λ<7 i .^LrtAíj 4 Λ «-Ji .VV.lLv 4--xL*AL a .JJ.·* .tla-UX· a Λ a a ΛΛ
TTAATAGAGC CACGAAAAAT ACAAAGTGuT GkTGCAGCwC
ATATCAAATG CCAGTACAGT TATAGGGGAA GCACCAGAAT
ZRZRZ*· 1 4 rt 4 Z^rt aazW5<Z'Zi.» H rt 5 /«KW/· 5 rt'WH R 1 ·» *rt»R4 5 Z * rv« .v/viv.A. v trj 4 .vj\.rtvn <·λ<? ;«Λν - . « λλλ» ..ΛΛ^Λν rt 4 ř^4 4 ZRrt 4 rt 4 rt> ÍWRRZ· 4 Z**rt 4 Z* * rt^rt 4 4' (T«m Z·· 4 ll*WPz' · trt (jA-AaívaL.Ti .A.b^JALrjrt υΛΛΛ, „ u^aj. * .νΛΛLGGAAGGGj-rt,
Z* * Z* * lW<4'MH1Z» 4 jrwn 4 JW 4 ^a--A
AAGGGGGGAC
Λ S rr*Z4-^» 4 λ <· Ί ΛΛίν i.WUJrt a «.-Xi a -JÍV a a a
GAGGATTTGG f^4 4 k « a -Λ k Λ a ,H4 Ί Z. 4 **WW5 4 4ΛΛνΛ. . «a-ΧΛ
ZR « r^« '
Λ 4 rt z rt>- 1 a <Xrt
TGT.ATTG^TG
G\JrtTAACaAG aJ a 4 4 *Z<Zi
Z^z**^ 4, z* 4 4 ZWWZ* 4 4 rtLrtrt a a >—
GCAAGTATGT GTAGAGATTA TAAACATGGA GrtAATGAGGA
ATAAAACATA GGGGTTCTAA AATAGAAGGC ACAGGAAATT
CTACGACATC AAAATATAGA ATTTATTGGA TTTTTAAGTA
ATGGACAAAG
C4 4 4 4 ΓΛΊ rriziz«4 .wírtzrtlv 4 zi i '4Z-<^f* 4 Z14 rtW Λ 4 <V 4 <- « ,-k 1
GwrtArtC.. AAG
500
550
720
30
340
900
50
2020
2030
2240
2200
2250
2220
30
2440
2500
2550
2520
25S0
2*40
2300
2350
2920
29S0
2040
2100
2250
T “ T Q
ATG^GTGC.^C GGTACGCCAA
GAAATCGTAC TTTTGTATGA
AAATTC2AGC AGG2ATTTT7
C* .RR
Λ'-»'— —Λ i -J i *
AGTATTGACA mm·'“» » m * m* m * '--.'LrtLAÍrVJ i?wpm^ T^mmmm
AATGCAAAC7
GAGoACGAGvj
AGAACTTTAT
GAGACATGAA i x kjx-.· m* *rnmmm*mm A .ΪΛ * L. x- . ,-L w 'χΤ
GCTAGTAACC
AGTAACAACA
TGAACTGTCA
TCAGGATTCA
AACAGTTGTT
Gw «AATGC AT*
AAAAAAACTG CATAGCCATA GTAGGCCCTC CAGATAC -ÍAj
Gmmm* * m* *m rnmmmmm*mm* s“· mm* iwn» rnmm * mmm
A x ..ÍPI XJ-kZVxJ A.-lAJ^Jrl (JVJ . .T, . . ZV*7 A A-,-!. J. A7 x s-n »m * * (—1 m /—>· Xfl * Γ·φ^ f* ·» m m mm * Λ m< m * m m * •'Rmm ''* »' * f* '
A . □'—'ΪΛ1- v <J i . Λ<1 x Λ«Λ * A «W »»Λ . w A - .TAJ-T.
MRl| IR» φϋ rR ,τ* Λ [Π K / * ' * * mm * m * 't ' iWn R^iRlR^ ' Π*/
Α^Λ-Λ A Λ A .T A 'ΛΪΛ.ΛΑΛ..Α4 .T, A 'Jr.Un.-^-. . « i W - ·Λ«Λ*\Λ>
m * * Amm*m* x *mm*mm«*m* mrn* *mm* -ί * m m * m s^s·’*
J/WVJ'..'! Α.ΛΛ Λ^Α.Λ- .W«A--T. . -ΛΛΑ _«ΛΛ* %J _^χ..-Ϊ<.— * — .
ί m* mm* mm* X * m* * m * m* 'X r-p*m* 'Γ'’”1 mm m* m* m* p-m* f ΛχΛ- -Λ'— χ.ΛΛ A<JrtrtijAUfW\ L.4-A .T. . , . Λ^Λ - «.fa -» «fa
CAAATCCATT CGGTTTTGAC AGAAATGGGA AGGCAGTGTA
GGAAATGTTT — x rnmmmmrnmm* ' mmmm* m Λ m A rf Jrt fa *y A\.W ·Λ^λΙ.Λ,
- . * «s_i««
GAAGAAAACA GTACTGACCT AAACAAACAT GTATTGCATT x m«mmrf»* mm* m m»m*m*i,*mm * a λ a m * * * *”** mmm m*m* — mm rtU A 'W A Λ 1 .n * A « A « A «««faA» Λ««^1<-.·Τ«« * J — , ««fa^ _
ACATAGGAAT GCAAGTAGTG CGACCATTAA <-* * a rnp * iPffl * m *mmmmmmmrn * «fa\J x '-J A \« ·— -Jt t— * n'm * m · A m * —«x „nUjirtUA
G^jvjGCAAAAC
T ATGaj AC «G« . •JX.Λ.» * ..Λ
AACAAGTTAC
TGTAGAAGTT
-Ά* k j -b Λ . J j, J *mm * **
AAACACCAC:
mm .*_-v« » * * ja . fa
C «G\j «C AC TG
ACT
AG C AAAAGG A
Gm » m*mm * mm a λ A «fa A Λ * 'J
TAAACGCTGT m* *m*m* a mm Α.ΛΛ. Λ^.ΛΛ * * * * m mmm m » m .-ίΛΛΌ^ x _ fa A χ ,ΛΛ. χ,-ίΤ.
GAACCGTGGA
TTTAAAAAAC
G«TTATGTG\_/ a mm* xv>xwi, m .-aj a.-va^w
| AT G v- TAAGwvr | m * m* m* mm * ·Λ·ΛΑ»Λ· «>*μ» | ACATGTG*jAC | AATTTAAAAC | Λ m* pp»m* mm-·* Λ « ,*X « A A Λ | · mrnmmmm* * λλ^ · . . a .τΛ |
| *AAGAGGCAGA | AAAGTATGGO | AGCACGAAAC | AATGGGAAGT | * mmmm* mmmm A.'ji .Λι·ΛΪΑ | AGCACAGTTA |
| TATGTTCTCm | i ·μ x (nm· V”* * A ΙχΤ.Λα'· A Λ | TCTAGCACTA | CACAAGAAGT | *mmm* mmmMm Z*LA >«r>Ax . . | Grtjr,TGTACTA |
| rn * m * m * mmm .m ’—IΛ X λΟ-.Λ1- w «. — | CGCACAGACG | mm*R * mmmmmrn .'J | mmmmmmm * m A Lí A x- — * »ΛΛ^ | CACGZAGGAA | Gr*\^-j\^AG a G*>— |
| .**Aj-\C m W1» *. | m*m* * xmmx * .-vjníW^-j.-x | mm » mm * mm * m | TCCAACAGTG | * MM^mmm·'*· * * m Λ^— Μ - x Jx-.-i-,—s_ | |
| mm p-»r-»mM*m*m 2 JW. . | rj ί m * m x mm .mm | m * m * m*r,mr· * jrks-,-xsj xMjwrv·, | ACGACAAC2T | CATCACTAAC | .-%.-lTC AC oAC |
| .iGvrt.-^G r»-v-u^aj | .'V\G'k-7JlX^C»'W\fa | x m*R * x m * f ««m n AW A ΛΛ<-*-ύ-> X x | C AG\« TAC G C <x | m* m*.mmmm<. AT. 4Λυ A ^..VL | 'mmmm * * mm· ιυ . * * xrtrtw<J x sJ |
| .kATCTAATTG | mmm | *n»m * m X « <m * x - *η<ιη.Λ«Λ | mm mm* * i, mm * . ΛΛΛ«·^Ρ\ | C «AAC AC AG A | CATTTATTTG |
| ATTTAAT.-u * C | 4mrn*xMMmmm ,-L X v_ x-lťtl* taj A | CACTGGGCGT | CCGCAAAGGC | ACGACATAAA | CATGC2ATTG |
TAACTGTAAC ATATCATAGT
CACCTACTAT TAGGCACAAA
TG AAATG l G
G AGG AAC AAA mm^Rmm^,γμτ» 11
GT*aTTGvjTGT m m m * ». m * rnmm
TGTCACTGCA
AATACAACTG m«m* X xmmmm A . ».ΤΛΛ*^ x , m mm * mmmm * * ΑΛ i .sj x .-i.m * m * mmm * mm A *-Λ<.Λ *\J x Λ - <-»
GTAAAAATAC
TTTGtACATA
GrvnkjCG’^ 4 AG
ΣΣ30
40
2400
4 S0
ΣΞΣΟ
ΣΞ30
2540
Σ00
2~ 50
2320
2330
2940
3000
3050
3220
230
3240
3300
3 50
3420
3430
3540
3500
650
3720
3730
3340 •900
Cr zH χ — — , Ζ^ x* R ' i** ’ 1
- RJ ΙΑ^ΛΛΛ* Α^Χ * ,1*Μ..υΐΙ»^.ΐ<?«^**1 'mz-.x—, r m,—'”ui»m i i^ip^.x. rBz*» i /«mmx ην^,· . . 'J X A.U 4 „ . ilj i * ΛΌ'-Λ. -- Λ X .11» a a Λ a X<4
Ο'ηι—'Τν''··'’'» Z- R z—»*rt R RzrrzrzRz-» zrrr χ—ζπ
».1W a .1*». a .lALrtL a-J Q .... Λ .,1,1. .
Cx-fTI* Ζ··Τ** A xR-fl Z»>^R
W a AL a ΛΛ1^- a 4- a .iL» a - J 4 J i \Λ »R?Ax
GGGTTTGTC
- 1? — a a *.1a a-J 4 a-J a-1 Jrta.l .Ijl U.
rrtax>xn^.i nwmr Z1R ^a^^^a^ * ζ^χ. 1 Λ r z-iR r z-» . 4jl- a <441 a ..1 a J i .1P.L A X l-Λ. Urt a rtlTAAAACTTTT TTTA7ATTTG TAACAGTG7A
GCjACjACvjC aagcgtgcgt cagctacaca
ATGCCCCCCA GATG7AATTC CTAAGGTGGA r ztrz·-·— i i x*»^ .1 a JIíUVAAL· X ,»Ζ*Ζ·ΖΑΖ·''Ί'» Χ-·ΧΤΊ '•JVJVJ áa*kLa «
I^RR /Τΐ^^ι— a „1 a '-^USa . M <t X . , .'AATTGAA
C juTSvG íTT
ZTR R R XRZTRZ» R ZTR a AL a .1*J X <- .1 AC.AACCCC.AA
G7CACACCCT
TCCTACATCC
7G 'P 7Gi* A77G
AATTAC.iTAT
I |R>«x,nR 1« CftR Z— R X-· a a 'a, .Λ.Λ^Λ*a-i-a a'Jl-J xk-'—
CACTCGGAGG
TGCACAAGCT zRrR ****^(^
TATATCAGAT ACA7ATTTAA C77CCACACC
Gui-7ATG7TC
C^lz· ZRlW/R I^ZSZ. a. a Ra w a 'J X 'JJ /-» » R rT»X* R Z* ** R R J ΛΛ a '— «.íl?1··» »ΑΛ
ACAATTACAT
ACTACTACTA
CGACGGGTGG
R rňR z-»* Z’'*’R R R A X ΛίίΛύυΛΛΛ
AGT.ACC «.CTG
CR z**z* R χ-»Λι^Ζ*«· .11- w.VJU a 141»
G»«R* Rz-»z^^ZRt^ rta.mLww alř
AA7GCACG7G
CxaR -ΛΛ,,ΛΛΖ»,»
Gu AAAG i. AC A
GC AG AAG AAA
CC77AGGAAC
X|*Z-z-»^x-»z-» R z· z· — aww iR·.· R ZTWTW R R Z— ,™ —» . a ,1a ..IflLjl.
C^zti»»zti<» r r r z·»
a. - a- a UíWÁ,
G-R R mR fR^WTRR Z* . A.Ai a a-lij r, aa^a^amR R/Rf-Z rtuwi· a AA x LAj
TTC CTTT AG A x· . a X- » a '^W X .I1·—
AGw TT.iC.AG A m R m R ZTR.ZR ' R z· — b al a al X ΟΛΓίΐΛ^
Γ. ,^ΛΙΛί1» a a a
TTGTGCGGTA í^R Χ»ΛΛΖ*Λχ1^Λ a .lUlTJlí1·- a a
TAGAAATGCA
C^)WR, i^Rz-m .la ..-Vi.rtL « zpR ΦΖ’Ζ.·, rnR • Λ. JUrt.,1.^ i^r air rrvrv*^* X .1*a a Λ a ,11 X J
R ZTpZWA R R flWR A - •J X Χ.ΛΛ Xaa
AGwVJU X G i a G
ATGTAACAAG (R^a^VRAmp R Χΐ?1» .1ΛΪ X<JftX
TGTTTTGTAT
GCTATATCAA
GCACAACACG
GTTG ,ρηιρίΑ x- r » ’ r aaaa ΧΧΛΛΛΛ
TGTGGCCCCT
AGvnjji. ji.™ _ .V.CTACCCCT
AAATCCTGTC
R z» R ZTfR ITRR rVWR, R ,1<.Λ,Λ.Λ. . .1
TACTTTT3TG
TCCACCTAGC
C C CTGC A7TT /»X« R z»»» R jRzRíRzR líl/rtlřlífta J X .
TR nV’— , z*RíflR Λ a ^n^a.Aa.R
CR Ζ» fRArtrt R
Λ« X a -J^A X a
CATTCATTAT
C 3 C7CTTGTG
CR rR»R»R R z»z»XX, .1 a a AA1». a a a
TAATACAGTT
J«a- .'Ji .Λ.Λ Λ. , <J<..1a - a U b<J41*a . X .Λ. a
GZMRA r*n^ R zXR R la · a .la a Λ
Z»z< R rpm<Rx«R m
ΙχΧΛ. aU i .1 a . AATG λΤ Ajnu
G- xR i^Rr^R R r Z1
1414 X X .1 X a >1 a íTVR«*R H z— R R R z* x χ αΑ,λλΑ.
*pi ιΉΊ •’Ρ* rf»R <*' .axaLa.aia
ACCATGGGAC
ACATGTAAAG
ATTGGAGATG
Aj^aCu^iv; x *
Cz»' «η^··η * zn^» r
Sr. .a a.1_ * Λ 'ηζ'ζ.χ. r πζ^Ά r zn ,^JUA.X-A.
« r r r mm-rRz''’ SJAAA a „ J X XJla
G— 1 1 ZRR r i i Wňz Z' <,,ΛΑ*.Λί -1^x4
777AC.AGAAC
A77 TCTGCAC
R ZTTR nR«^.>H^»lRR .1 X_1 a — ~ R — a-1
C^»T»^ze.«WZ»RRZ··“· 'la a G aj X 4 lfj
C777CCAC7C
R Z ZR R R Prt ev»j χ .rLaA a
Λ X a —-j Xaa-jlGG AC AACGGG zWW^mR ztv* r «Τ * . . a aa<X\jAÍx1
MM ZR R < R Z·*»
Ljia „oxaLaUm
ACCCAACACC
AC.iC.iAC—j 7
G7GTACACA7
ACAAC»»^Cw7
A7ACACGACT
R fflR Z—» řTVRXRZRXRl ,1 X .RGA X '^USa. — *Π R R řTRz r“ R /-»*TT R _ .“Xrt X JXaAk. a .1
ACACCTGTAA
ZT1Z“· R R řTR^ R ZR R ZR .iJrtA. artLírtij
R řpR zRfRRR Z*'-*'-·· A a-IU a AUV1ÍX
TTACTGGAAC
AAA7A77AAA
C wmÍUR».AG7Gu z**n« χ··“ — a .-Va? X LjRJUla M.
CCATTGTGTC
LaXaw aUlaXl*—al
A7G7ATCAG7
C77C7G7.AAC
CGAC7A7AAC
GTG A7 AG C GG
GCCTA7A7AG
C7CAACGC77 zrRrA r <»zrRzr r r a .AÍíkXAaJA
ACAGACGTGG
GGTCTATGCA
TTrCACCTAT
ATGATACATT
CTGTTACAAA
Gx-ajvíTJíACAC
2?5O
4020
4030
4140
4200
4250
20
4230
4440
4500
4550
4320
4550
4^40
4300
4350
4S20
4930
2040
5100
5150
5220
5230
5240
5400
5450
5520
5530
| CACAGTTCGA | TTGTCAATTC | /·m* s mm mmm „ iW X kí<*.ki «v „ | GTTTTTACAG | m<—mmm — — — m,— * A UUU „„ ,'U | atataacttt | 2 a -t U |
| i— m * z—mm m * » <w -- .iAL .'υΧΛ | /—·—m*mwmm-s s Lr -- X A X ν_Γ4_Κ»ΛΛ | * i—*—m „ .. x^Cr | TCGTGTAACT | i— mmmi—mmm* m '·-.- „ 4JV- « x i.-iL | ctacaggggc | =700 |
| ΤΟ’χ*'χ*Σ*ρ7ΟΑΤΤ | * /— rnmmmmmrn lAk.AW^ X x 4« x | GATTTTATTT | /—.— s — i—mmi— * νΛ.ΛΑΧ«. „ sJV-.T, | TGGTAT?*^ | CACGTAAACG | 5~d0 |
'•JiAftflLui Λχ íLm'» - -ΛTAGCGACAGC ACAGTATATG
ACTCGCACGA
ACATATTTTA
TAAAAC GGG C
Λ mmmi—
Awu 4 <jvj sj i *.
CAACACAACG / * W * *™ —·*— m
U 4 U i. XJSJSJ x kj X
U X U\J X </SJ X ΛΛ
Λ 1 nvfl n mm— * <Π
AA + _ λ - uu --1- „
GTACTAATAC
TACAGGATGG
C<— s \ m» X x — ^.A./UVkí — m * r~> ·χ s x mm m — * Ak .ΛΛΛ JkJU í+i^i-nrpn/·mm ·» /· i^ i φ . UV- w.n.U x
X -ΛΪΛΑ- 1.ΛΛ
CAAGGGGC^G
AACCC «Auvu
ATACGACACG
C ΛΛ * - C - WA mmm x x mm * »—m _ . k-ΛΛ* - Λ λ J' .„ATAG
AAA^Gx. -..λΟλ /-·*·» X * V I I «1 IR .AU xkírtm.„ „ kjmk. uw a - * -.
WI B — I li— χ j— χ ny—m - - -. . w.-VJfl , Uk txx xm»—i—mmmx mm ·— ' λ » mmmm mmmm—x——mx mm·*·' i wn x mm»—m
X ,-xAk- - U ,Λ - *- -ΛΠΛΌ χ , \J „4 XJX· -AkUSJrt J, kru _ * Λ X XJ X _
C* mi—i— i— * ř—»· ' Z—mi— <—X 1—X z— i—m<·· IMR·» — X m*— i—^x< u_· χ „*.* .ikí x . v_ „iT\4JÍ\k_ _ „ „ „klS_.Au X Λτυ X UΛ* '_ — TAACAAAACT GTTGTGGGAA AGGTG7CAGG ATATCAATAC AGAGTATTTA
ACCAGATCCT AACAAATTTG CATTGCCTGA CTCGTCTCTT TTTGATCCCA
TTTGGTATGG GCATCCACAG GCCTAGAGGT GGGCCGGGGA CAGCCATTAG
AAGTGGACAT CCTTTCCTAA ATAAATATGA TGATGTTGAA AATTCAGGGA
CCCTGGACAG GATAACAGGG TTAATGTAGG TATGGATTAT AAACAAACAC m m'TWTV m * mm·— m 1— —i— I— i— 1—1— <W1T m—R—— ——r—1 klU X , UUrtXU x 'JVi.ww* _ ikSAlVslAWl».*! X „ krvjSJX-J xíl
S 1—i— 1—1—I—1— X /—m m mm «——*—mm<
.u-nk.AU ux „uw xuaL· mmm* * x m*mm -JU X ΛΛΛ\»Λν X
AGAACTTATT ACCAGTGTTA
Ci— * m*mmmmm m * m * m χ m·™’'— mmm i*—ř*···—i m i— χ x mmmmm ·— —* mx mmmm·™·' /-¼ Jftk.A.UVJi- υΛΧΛΧ.Λν^υυ . . .'JvjiUU .ΛΑ kruÍk...UV_* UAi , ,υ^ΛΧίΛ
AGATGTTCCT
TGCAGACCCA
G——— — * m m *, m x, mmm* γ λ ws— mm - « x mm* mm tlÍWw.ik-„A— AiuinAn-rt. k —άόλα x Αχ x
AAGo AAC.-JAA
ACATTTTTTT AACAGGGCTG GCGAGGTGGG GGAACCTGTG C2TGATAC0
5320
3 3 0
3540
3000
3050
SLZO
5130
5240
00 □ 3 50
5420
5430 = 40
5500 i——i— m* mmmm χ x x mm — m χ z—»— m z— mm mu i—i— x m m* mm* m* mx m m *—m* x m x m — — -* 7 * kjuw x xvj x4tja ΛΛ.-υυΛυυ x X .kinLrwnk x.-iki-λχλ_λ_ uj._.ink.^u-w 3OCU ‘'TGAGCCAC
GT aactaca:
GGAAGACTGw
-Λ- - X.U
TACG GGTGT TAAGs. GCCCTGC^GT
| mmm* »i— > m _ U4ÍX „ λΧ.-ιλΛ | aT2Q |
| X — ·—mrnmrnm* m -“i-k. * -J X WU X Λ<ϊ | □ 730 |
| mmm » m ·« m* m * • — —Λ\- Λ X Λ4„.Λ | 5340 |
| /-' * mmm * mmm _.\Λ. „ -ΛΧ . * | 5 = 00 |
| ACAATGAATC | 5550 |
| ACATTAGAAG | 7020 |
| CCTGAAAAGG | 7oao |
| GAAAAGTTTT | 7140 |
| UWrt l Λ A ,ιΑλϊ | 7200 |
| iCiuCTGuwC | 7250 |
C* n i L 2. /“»»^»^** ******* ' * Λ Σ f? ’ Δ i. iz·'“·*^ s i m a mu m·» ipa *πζ—*« a ť*^ ζ·*λζπ a m a m a ziaa ·ΛΛΛ<»^1ΛΛ w.nnn AL.AAhAUui ΛΛn i Oj 4 Oj 1.-%TaxGi.iU. \»4.λ*Α*Α*Α λ«λ ιΑΑΑ ZT** m* <*»» ZftA mz«*A /-RV”* ~4AZAAA* • *W KaJ · AaOJ ·Λ'·.υ*«Λ·'ί * A*A*-J J.L» tw «Λ*.·.
:tat
ATA^GTGTO*!* j^,··^.» ιΛλΛζ,ιαλ mmi 4 <J X Oj χ sj χ '.j i. u 4 w Λ .
—r ·, rn a m*»»-¾ zrn. zuj-za a ·λ<·11 ιι 11. -ai *4á<jI\j4V^AA Aí'jí,-UAA'J.l ,-.*ογ iot ; J.OJ , j _.’GTGT
Cl a zn a a a λ a * * a z*^ h z* * /*> z* **«^z»**Aj« a ζ·>*τ? *» a ζ»άζ* -*λλλι*λ λ λ a λλλ. i.wmm
ΛΛΧ.ΆΠΟ.-ΟΛ «. *ΑΛ<» . ΑίΑ^· ·— - - -j 4<JrtO * 0. AL·» 4WWX« , “J X , X__
G- * ι»*Λ^^ ΑΛΑ Z* A Λ A ι^Ά Λ Ζ*·Λ A Λ <Ή A| / a #MZ « A Z* A 1 ZTA A Zrt A ZT* A Zrt A ΖΤΑΛΑΖΤΑΖΤΑΖΤ» *«»»»» A z“· a A (TFA A ΛΑ ZTA
O. J\- „ . Λ<»«1 Ι«*Λ0.Λ«ΛΛϋ ΧΛ Λ«Α·ΑΙ·,Λΐϋ\· ,-ΐλ.ΛΛ . A * Λ * .-. , , , - J - . Α'μΛΛαΛΛ^Λ·
AZRřAmm«» Λ»5Λή γΠπ*λ/α Α A Ζ“· *-» **·*»* φ^τ^ζ'ΆΖΒΖΤνηΖζ· ΛΛΛνΛΛΛΛ α γγ»α λ Α Z»‘ |V|WI lf— Λ Α Λ ΛΑ A I | W RW »«Ζ IMWWl
Λ -X ™ - « « Λ Λ Λ. L Α <70* AA*S A· aJ X Λ Λ — Ajój χ « (jkí Ο» Α« « , Oj*tJ*SA*Í Λ Λ Lba*O0^ » κ-,Ά^ν L,„-AJA, * « , Οί i » ·Λ
CAACGTGT7G CCTGTTAATC CTATATATTT TGTGGGAGGT ACACATTGCG
CA *Ζ*πλ —λ A A λ mz— <— A φ*·λλι m — λζ^αλλ^-· a a λ λ a λ a λ a λλλαλλ λλλλ a λλλλαλ λ « xojo. w.-vVa> . Λ-«ό- 'a·'^ . jo.a.viLa Ao.jVw.tVw'* ,*j
TTACTCATAT GTTTATTGCG ACTGGAATAA ACCTGTCTTT GTGTTATACT TTTCTGCACT
GTAGGGAACT CTTAAAAGCA TTTTTGGGTT GTAGGAGAAC ATTTTTTTGG TGTTACTGTT
TGGTATACAA T.AACATAAAA ATGAGTAACG TAAGGTGACA CACCTGCAAC CGGTTTCGGT . A 4. ο- >.AL ,·ν_ - ·,.λ(.λ.λ... —— -,--Αχ A *ΛΛ A Α ΛΙΤΑΓη JX»·—ΛΛ<» χ □.
'ο aJOJ 1Λ i * J'— V»
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaná a čištěná molekula DNK kódující lidský papilomavirus typu 6a nebo její funkční derivát.
- 2. Izolovaná a čištěná molekula DNK podle nároku 1, která má nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obrázku 1, nebo její funkční derivát.
- 3. Expresívní vektor pro expresi molekuly DNK podle nároku 1 v hostiteli.
- 4. V podstatě čištěný protein, který je kódovaný molekulou DNK podle nároku 1.
- 5. Protein podle nároku 4, vybraný ze skupiny zahrnující HPV6a L2, HPV6a El, HPV6a E2, HPV6a E4, HPV6a E5a, HPV6a E5b, HPV6a E6 a HPV6a EV nebo jeho funkční derivát.
- 6. Monospecifické protilátky imunologicky reaktivní s látkami, vybranými ze skupiny zahrnující molekulu DNK podle nároku 1, RNK komplementární k molekule DNK podle nároku 1 nebo protein kódovaný molekulou DNK podle nároku 1.
- 7. Způsob exprese proteinu lidského papilomavirů typu 6a v hostiteli, vyznačující se tím, že se a} přenese expresívní vektor podle nároku 4 do vhodného hostitele; a že seb) hostitel uvedený v bodě a} kultivuje za podmínek, které umožní expresi proteinu lidského papilomavirů typu 6a z expresívního vektoru.9 *- 35 3. Způsob určení látek, které modulují aktivitu lidského papilomaviru typu 6a, vyznačující sa tím, ž e sea) kombinuje možný modulátor aktivity lidského papilomaviru typu Sa s molekulou DNK podle nároku i, s RNK komplementární k molekule DNK podle nároku 1 nebo s proteinem kódovaným molekulou DNK podle nároku 1; a Se seb) měří účinek modulátoru na molekulu DNK podle nároku i, na RNK komplementární k molekule DNK podle nároku 1 nebe na protein kódovaný molekulou DNK podle nároku i.
- 9. Látka, která je ve způsobu podle nároku 3 aktivní.
- 10. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje látku aktivní ve způsobu podle nároku 3.
- 11. Prostředek, který v jedinci léčeným uvedeným prostředkem vyvolává imunizní odezvu, vyznačující se tím, že obsahuje látku vybranou za skupiny obsahující molekulu DNK podle nároku 1, peptidy kódované molekulou DNK podle nároku 1, RNK komplementární k molekule DNK podle nároku 1 nebo jejich kombinace.
- 12. Vakcína pro prevenci nebo léčbu infekce lidským papiiomavirem, vyznačující se zim, ze obsahuje látku vybranou ze skupiny zahrnující molekulu DNK podle nároku i, pepcidy kódované molekulou DNK podle nároku i, RNK komplementární k molekule DNK podle nároku i nebo kombinace těchto látek.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31046894A | 1994-09-22 | 1994-09-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ87597A3 true CZ87597A3 (cs) | 1998-01-14 |
Family
ID=23202654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ97875A CZ87597A3 (cs) | 1994-09-22 | 1995-09-18 | Molekula DNK kódující lidský papilomavirus typu 6A a použití této molekuly |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6290965B1 (cs) |
| EP (1) | EP0782615A4 (cs) |
| JP (1) | JPH10506014A (cs) |
| AU (1) | AU694269B2 (cs) |
| BG (1) | BG101338A (cs) |
| BR (1) | BR9509076A (cs) |
| CA (1) | CA2200582C (cs) |
| CZ (1) | CZ87597A3 (cs) |
| FI (1) | FI121507B (cs) |
| HU (1) | HUT77337A (cs) |
| NO (1) | NO971347L (cs) |
| NZ (1) | NZ293461A (cs) |
| PL (1) | PL319294A1 (cs) |
| RU (1) | RU2177999C2 (cs) |
| SK (1) | SK35897A3 (cs) |
| WO (1) | WO1996009375A1 (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962981B1 (en) * | 1996-03-25 | 2005-11-08 | Medarex, Inc. | Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen |
| GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| SK2232001A3 (en) * | 1998-08-14 | 2001-08-06 | Merck & Co Inc | Process for purifying human papillomavirus virus-like particles |
| CN1100835C (zh) * | 1998-10-30 | 2003-02-05 | 中国科学院感光化学研究所 | 加入纳米无机化合物粒子的钛溶胶－凝胶涂料及其制法和用途 |
| GB0017990D0 (en) * | 2000-07-21 | 2000-09-13 | Glaxo Group Ltd | Papilloma virus sequences |
| WO2004081178A2 (en) * | 2003-03-06 | 2004-09-23 | Indiana University Research And Technology Corporation | Methods and composition for producing infectious hpv stocks |
| IL156670A0 (en) * | 2003-06-26 | 2004-01-04 | Zvi Zolotariov | Aloe suppositories |
| US20080160040A1 (en) * | 2004-04-15 | 2008-07-03 | Ghim Shin-Je | Plant-produced compositions for treating papillomavirus infection and related methods |
| US7354719B2 (en) | 2004-12-08 | 2008-04-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| US8084207B2 (en) * | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| US20070031826A1 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-08 | My Gene | Diagnostic kit for determining the genotype of a human papilloma virus and method of using thereof |
| AU2006295040A1 (en) * | 2005-09-08 | 2007-04-05 | Kentucky Bioprocessing, Llc | Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications |
| KR100904844B1 (ko) * | 2006-08-28 | 2009-06-25 | 성균관대학교산학협력단 | 인유두종 바이러스（ｈｐｖ）유전자를 포함하는자궁경부암의 치료 또는 예방용 ｄｎａ 백신 |
| BRPI0821311B1 (pt) | 2007-12-21 | 2018-09-18 | Novartis Ag | Ácido nucleico de vetor linearizado, método para produção de uma célula hospedeira de mamífero compreendendo o referido ácido, e método para produção de um polipetídeode interesse |
| JP6153866B2 (ja) | 2010-05-25 | 2017-06-28 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． | 迅速なハイブリッド捕捉アッセイ、及び関連する戦略的に切断されたプローブ |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE122007000098I1 (de) * | 1992-06-25 | 2008-03-27 | Papillomavirus vakzine | |
| CA2189882C (en) * | 1994-05-16 | 2005-09-20 | Kathrin U. Jansen | Papillomavirus vaccines |
| AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
| IL117591A0 (en) * | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
-
1995
- 1995-09-18 CA CA002200582A patent/CA2200582C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-18 NZ NZ293461A patent/NZ293461A/en unknown
- 1995-09-18 SK SK358-97A patent/SK35897A3/sk unknown
- 1995-09-18 BR BR9509076A patent/BR9509076A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-09-18 EP EP95933148A patent/EP0782615A4/en not_active Ceased
- 1995-09-18 PL PL95319294A patent/PL319294A1/xx unknown
- 1995-09-18 RU RU97106340/13A patent/RU2177999C2/ru active
- 1995-09-18 WO PCT/US1995/011859 patent/WO1996009375A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-09-18 CZ CZ97875A patent/CZ87597A3/cs unknown
- 1995-09-18 JP JP8511012A patent/JPH10506014A/ja active Pending
- 1995-09-18 AU AU35918/95A patent/AU694269B2/en not_active Expired
- 1995-09-18 HU HU9702290A patent/HUT77337A/hu unknown
-
1997
- 1997-03-18 BG BG101338A patent/BG101338A/xx unknown
- 1997-03-21 FI FI971203A patent/FI121507B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-03-21 NO NO971347A patent/NO971347L/no not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-03-08 US US09/521,526 patent/US6290965B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO971347D0 (no) | 1997-03-21 |
| MX9702209A (es) | 1997-07-31 |
| FI971203A0 (fi) | 1997-03-21 |
| BG101338A (en) | 1997-10-31 |
| NZ293461A (en) | 1998-04-27 |
| AU694269B2 (en) | 1998-07-16 |
| RU2177999C2 (ru) | 2002-01-10 |
| PL319294A1 (en) | 1997-08-04 |
| FI121507B (fi) | 2010-12-15 |
| HUT77337A (hu) | 1998-03-30 |
| CA2200582C (en) | 2007-03-27 |
| WO1996009375A1 (en) | 1996-03-28 |
| BR9509076A (pt) | 1998-07-14 |
| SK35897A3 (en) | 1998-02-04 |
| CA2200582A1 (en) | 1996-03-28 |
| FI971203A (fi) | 1997-03-21 |
| NO971347L (no) | 1997-05-21 |
| EP0782615A4 (en) | 2001-08-22 |
| EP0782615A1 (en) | 1997-07-09 |
| JPH10506014A (ja) | 1998-06-16 |
| AU3591895A (en) | 1996-04-09 |
| US6290965B1 (en) | 2001-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5840306A (en) | DNA encoding human papillomavirus type 18 | |
| US5820870A (en) | Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine | |
| US6159729A (en) | Synthetic HPV6/11 hybrid L1 DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein | |
| CZ87597A3 (cs) | Molekula DNK kódující lidský papilomavirus typu 6A a použití této molekuly | |
| US5821087A (en) | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA | |
| AU708737B2 (en) | Purified papillomavirus proteins | |
| CA2215834C (en) | Dna encoding human papillomavirus type 18 | |
| WO1996015247A9 (en) | Purified papillomavirus proteins | |
| US6908615B1 (en) | DNA encoding human papilloma virus type 18 | |
| CA2216827C (en) | Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein | |
| CA2204266C (en) | Purified papillomavirus proteins | |
| MXPA97002209A (en) | Dna that codifies for type human papilloma viruses | |
| MXPA97007208A (en) | Desoxirribonucleico acid that codifies for human papilloma virus type 18 and use of my |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |