CZ75197A3 - Monoclonal antibody, hybridoma polypetide polynucleotide, host cell and process for producing polypeptide - Google Patents

Description

Monoklonální protilátka, hybridom, polypeptid, polynúkáecA- ⁸ 2 tid, hostitelská buňka a způsob produkce polypeptidů cn§oa

Oblast techniky ^:í

Vynález se obecně týká proteinů vázajícíc Ϊ v buňkách protein kinasu A. Konkrétněji se vynález týká novýcR’“” proteinů a nukleotidových sekvencí kódujících tyto proteiny, které lokalizují v buňkách protein kinasu A. Vynález zahrnuje tyto aspekty: monoklonální protilátku, hybridom, polypeptid, polynukleotid, hostitelskou buňku a způsob produkce polypeptidu.

Dosavadní stav techniky

Extracelulární signály, jako hormony a cytokiny, modulují mnohé buněčné aktivity aktivací adenylát cyklasy, zvyšováním hladiny cAMP v buňkách a konečně aktivací cAMPdependentní kinasy (PKA). PKA je všudypřítomný enzym, který funguje v mnoha intracelulárních drahách, například při regulaci metabolismu glykogenu reversibilní fosforylací glykogen fosforylasy (Walsh et al., J. Biol. Chem., 243: 3763 až 3765 (1969)) a regulaci signalizace prostřednictvím MAP kinasy inhibicí aktivace Raf-1 pomocí Ras (Vojtek et al. Cell, 74: 205 až 214 (1993) a Hafner et al., Mol. Cell.

Biol. 14: 6696 až 6703 (1994)). Inaktivní PKA existuje jako tetramer, v němž jsou dvě totožné katalytické podjednotky vázány do dimeru zahrnujícího dvě regulační podjednotky.

K aktivaci PKA pomocí cAMP dochází tak, že se molekula cAMP připojí ke každé z regulačních podjednotek (R), přičemž dojde k uvolnění aktivní katalytické podjednotky (C). Byla identifikována pouze jedna forma podjednotky C, ale existují dvě třídy podjednotek R, tj. RI a RII, se zřejmě odlišnými subcelulárními distribucemi. Isoformy RI (Rla a Rip) jsou, jak bylo oznámeno, převážně cytoplasmatické a jsou vyloučeny z jádra, zatímco až 75 % isoforem RII (Rlla nebo RIip) má povahu částic, které jsou spojeny buď s plasmatickou membránou, cytoskeletálními složkami, sekrečními granulemi,

Golgiho aparáty, centrosomy nebo možná jádry (Scott,

Pharmac. Ther. 50: 123 až 145 (1991)). Předpokládá se, že rozdíly (buď fyzikální nebo fyziologické) mezi různými podjednotkami R představují prostředek, pomocí něhož jsou buňky schopny omezit aktivitu pojednotky C na požadovanou dráhu.

Nedávné důkazy ukázaly, že buňky jsou schopny zaměřit aktivitu PKA umístěním inaktivního enzymu v sousedství potenciálních substrátů, přičemž dojde k omezení aktivity podjednotky C po jejím uvolnění vyvolaném navázáním cAMP na podjednotku R. Při tomto rozparcelování dochází k segregaci PKA ve vztahu ke složkám v dané signalizační dráze, což přispívá k specificitě PKA při odpovědích na různé extracelulární stimuly. K rozparcelování PKA dochází alespoň zčásti prostřednictvím interakce nebo omezení podjednotky R specifickými proteiny, které lokalizují nebo zakotvují inaktivní holoenzym na specifických místech uvnitř buňky. Proteiny, které specificky segregují PKA byly označeny zkratkou AKAP (tvořené prvními písmeny anglického názvu A Kinase Anchor Proteins (proteiny zakotvující kinasu A)) (Hirsch et al. J. Biol. Chem., 267: 2131 až 2134 (1992)).

Až dosud byla identifikována řada proteinů AKAP (viz dále uvedená diskuse), které zjevně vážou PKA prostřednictvím společného karboxyterminálního sekundárního strukturního motivu, který zahrnuje amfipatickou oblast šroubovice (Scott a McCartney, Mol. Endo., 8: 5 až 11 (1994)). Vazbu PKA k většině, pokud ne ke všem identifikovaným proteinům AKAP, je možno blokovat za přítomnosti peptidu (Ht31), který napodobuje společnou sekundární šroubovicovou strukturu, zatímco mutant peptidu Ht31 obsahující jednu substituci aminokyseliny narušující škroubovicovou povahu peptidu, nemá žádný účinek na vazbu PKA k AKAP (Carr et al., J. Biol. Chem., 266: 14188 až 14192 (1991)). Přestože se na interakci PKA/AKAP podílí společná sekundární struktura, vykazují proteiny AKAP (nebo homology proteinů AKAP obsažené v různých druzích) obvykle jedinečnou primární strukturu, čehož důkazem je rostoucí počet proteinů AKAP, které byly identifikovány v různých organismech. Jedinečná aminokyselinová struktura především v aminoterminálních oblastech proteinů je zčásti příčinou skutečnosti, že byly proteiny AKAP identifikovány jako jedinečné proteiny v různých specifických typech buněk a v různých specifických intracelulárních oddílech, v nichž bylo rozmístění PKA pozorováno.

Tak například proteiny AKAP, které jsou převážně exprimovány v mozku savců, byly identifikovány u hlodavců (AKAP 150) a krav (AKAP 75) [Bergman et al., J. Biol. Chem. 266: 7207 až 7213 (1991)] a podobný protein existuje i u člověka (AKAP 79) [Carr et al., J. Biol. Chem. 267: 16816 až 16823 (1992)]. Totožnost, pokud se týče aminokyselin a imunologická křížová reaktivita mezi těmito neuronově specifickými proteiny ukazuje, že se jedná o homology v rámci jednoho druhu. Jako další příklad je možno uvést AKAP 100, který se zdá být specifickým pro srdeční a kosterní svaly člověka a krysy a zároveň je v nižším rozsahu exprimován v mozkových buňkách těchto savců. Jako ještě další příklad je možno uvést protein AKAP Ht31 (Carr et al. J. Biol. Chem. 267: 13376 až 13382 (1992)), který je jeví jako specifický pro thyroidní buňky. Naopak AKAP 95 se exprimuje v řadě typů buněk a nevykazuje zjevnou specifičnost vůči typu tkáně nebo buněk.

Pokud se týče rozmístění do specifických oddílů uvnitř buňky, jsou proteiny AKAP 75 a protein asociovaný s mikrotubulemi (MAP-2) [Threurkauf a Vallee, J. Biol. Chem., 257: 3284 až 3290 (1982) a DeCamilli et al., J. Cell. Biol., 103: 189 až 203 (1986)], AKAP 79 [Glantz et al., J. Biol. Chem. 268: 12796 až 12804 (1993)] a AKAP 150 [Glantz et al., Mol. Biol. Cell, 3: 1215 až 1228 (1992)] těsně asociovány cytoskeletálními strukturními proteiny, přičemž AKAP 75 je specifičtěji asociován s postsynaptickými hustotami [Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 16816 až 16823 (1992)]. Ještě další proteiny AKAP jsou rozmístěny v méně rozšířených buněčných strukturách; AKAP 350 je asociován s centrosomy [Keryer et al., Exp. Cell Res., 204: 230 až 240 (1993)],

AKAP 100 se sarkoplasmatickým retikulem v srdeční tkáni krysy [McCartney et al., J. Biol. Chem. 270: 9327 až 9333 (1995)], 85kDa protein AKAP spojuje PKA s Golgiho aparátem [Rios et al., EMBO J., 11: 1723 až 1731 (1992)] a neoznačený protein AKAP je asociován s membránovými vápníkovými kanály. Protein AKAP 95 se zřejmou oblastí vázající zinc finger

DNA se zdá být výhradně obsažen v jádře [Coghlan et al., J. Biol. Chem. 269: 7658 až 7665 (1994)]. Doména vázající DNA v proteinu AKAP 95 má svou úlohu při přímém zapojení PKA do transkripce specifického genu, možná prostřednictvím umístění PKA vzhledem k fosforylačnímu a transkripčnímu faktoru. Jiné různé buněčné aktivity, u nichž bylo prokázáno ovlivnění vazbou AKAP/PKA, byly prokázány narušením této interakce, například narušení vazby PKA/AKAP v T-buňkách vede k reversi cAMP-indukovaného potlačení exprese interleukinu 2 [Lockerbie et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 21A: 76,

Abstrakt D2155 (1995)] a narušení vazby PKA/AKAP v neuronech hippokampu vede k zeslabení proudů v úplných buňkách prostřednictvím receptorů a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionová kyselina/kainát glutamátu [Rosenmund et al., viz výše uvedená citace]. Schopnost proteinů AKAP regulovat expresi IL-2 a regulovat aktivitu glutamátového receptorů v kombinaci s dřívějším zjištěním, že proteiny AKAP jsou schopny vázat kalcineurin, vede k předpokladu řady terapeutických aplikací pro proteiny AKAP a molekuly modulující vazbu AKAP k buněčným složkám.

S ohledem na různorodost jak pokud se týče exprese v různých typech buněk, subcelulární lokalizace a fyziologických aktivit až dosud identifikovaných proteinů AKAP, existuje tedy v tomto oboru potřeba pokračovat v identifikaci nových proteinů AKAP a nukleových kyselin, kterými jsou tyto proteiny kódovány. Jedinečnost primárních struktur AKAP poskytuje cíl pro specificky regulovanou lokalizaci PKA a tím její funkci ve specifických buněčných procesech.

Podstata vynálezu

Jedním aspektem tohoto vynálezu jsou protilátky, které jsou specificky imunoreaktivní s dříve neidentifikovanou molekulou AKAP. Jako příklad protilátky, které se v současné době dává přednost, je možno uvést monoklonální protilátku vylučovanou hybridomem označeným 160C a uloženým ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20859 USA 19. července 1995 pod přírůstkovým číslem HB 11955. Jiné protilátky podle vynálezu zahrnují polyklonální protilátky, rekombinantní protilátky jejich vazebné fragmenty. Do rozsahu vynálezu spadají také buněčné linie, například hybridomy nebo buněčné linie trans formované rekombinantními expresními konstrukty, které produkují protilátky podle vynálezu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou antigeny, které jsou specificky rozpoznávány protilátkami podle vynálezu. Přednostní antigen je označen zkratkou AKAP 120. Antigeny rozpoznávané protilátkami podle vynálezu mohou být identifikovány kteroukoliv z řady imunologických technik, které jsou dobře známy v tomto oboru. Imunospecifické antigeny je například možno izolovat afinitní chromatografií, při níž jsou protilátky podle vynálezu konjugovány k imobilizované pryskyřici a antigen je odstraňován z konkrétní tekutiny. Jako další příklad je možno uvést použití protilátek podle vynálezu při imunoprecipitačních postupech za účelem specifického odstranění antigenu ze směsi proteinů, po němž se imunoprecipitovaný protein podrobí dalšímu dělení za použití elektroforézy. V souvislosti s protilátkami podle vynálezu je dále také možno použít postupů Western Blotting pro identifikaci specificky imunoreaktivních antigenů ve směsi proteinů.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají dále také polynuleotidy kódující antigeny rozpoznávané protilátkami podle vynálezu. Polynuleotidy podle vynálezu zahrnují DNA (genomovou, komplementární a syntetickou) a RNA. Do rozsahu vynálezu spadají i antikódující a kódující polynukleotidy, které jsou komplementární ke kódujícím a nekódujícím polynukleotidům. Polynukleotidy podle vynálezu lze identifikovat kteroukoliv z řady technik, jež jsou v tomto oboru dobře známé. Je-li stanovena aminokyselinová sekvence imunospecifického antigenu, je možno syntetizovat degenerované nebo nedegenerované oligonukleotidové próby pro hybridizaci s klonem kódujícím antigen v knihovně DNA sekvencí. Alternativně je také možno použít podobných nebo jedinečných oligonukleotidových sekvencí při řetězové reakci katalyzované polymerasou (PCR) pro amplifikaci potenciálních klonů kódujících antigen ze směsi polynukleotidů. Polynukleotidy podle vynálezu zahrnují DNA kódující AKAP 120, jakož i polynukleotidy hybridizující za stringentních podmínek k DNA kódující AKAP 120. Označení stringentní podmínky je pro odborníky, kteří rozumějí podmínkám hybridizace, dostatečně srozumitelné.

Ί

Užitečnost tohoto vynálezu je očividná. Protilátky podle vynálezu jsou například obzvláště užitečné pro purifikaci antigenu specificky rozpoznávaného protilátkami, která se provádí ve velkém měřítku. Kromě toho je možno identifikovat typy buněk exprimující antigeny podle vynálezu. Protilátky podle vynálezu jsou také potenciálně užitečné jako modulátory vazebné aktivity antigenu, které jsou specificky rozpoznávány buď prostřednictvím kompetitivní inhibice vazby blokujícími aminokyselinovými sekvencemi požadovanými pro interakci protein/protein, nebo prostřednictvím indukce konformačních změn v antigenu majících za následek zborcení nebo eliminaci sekundární struktury požadované pro vazbu proteinu.

Antigeny, které jsou specificky rozpoznávány protilátkami podle vynálezu, jsou užitečné při řadě aplikací. Tak například je možno těchto antigenů použít při vytváření přídavných protilátek, které mohou vykazovat modulační aktivitu. Tyto antigeny také umožňují identifikaci polynukleotidů, které je kódují. Dále jsou tyto antigeny také užitečné při screeningových postupech, kterými mohou být identifikovány modulátory vazby antigenu k jiným buněčným složkám, například jiným buněčným proteinům nebo buněčným organelám. Takto identifikovaných modulátorů se může potenciálně použít pro regulaci kterékoliv z četných buněčných aktivit, na nichž se podílejí antigeny nebo jejich vazební partneři.

Polynuleotidy podle vynálezu jsou obzvláště užitečné pro rekombinantní produkci antigenů, které kódují. Rekombinantní exprese umožňuje produkci antigenů, jejichž užitečnost byla uvedena výše, ve velkém měřítku. Tyto polynukleotidy jsou také užitečné pro screening, například za použití dihybridové technologie, zaměření na geny, které kódují proteiny, které jsou v interakci s kódovaným antigenem. Modulátory vazby antigenu mohou být také identifikovány metodami screeningu, například pomocí trihybridových technik za použití polynukleotidů podle vynálezu zaměřených na identifikaci genů kódujících proteiny modulující vazbu antigenu. Modulátory vazby AKAP jsou obzvláště užitečné v řadě aplikací. Tak například u malých molekul může být zjištěna schopnost inhibovat bud vazbu PKA/AKAP nebo interakci AKAP se specifickými buněčnými složkami. Sloučeniny tohoto typu budou delokalizovat specifická shromaždiště PKA a ovlivňovat pouze cílovou signalizační dráhu. Identifikace modulátorů vazby AKAP k jiným buněčným složkám může být stejně užitečná. Tak například faktory ovlivňující aktivitu kalcineurinu podobným způsobem, jako to činí nedávno identifikované imunosupresanty, ale s menšími vedlejšími účinky, mohou být užitečné při léčení chorob, v současné době léčených toxičtějšími imunosupresanty. Kromě toho, identifikace faktorů modulujících účast AKAP na buněčných aktivitách může být také užitečná při nahrazování v současné době akceptovaných terapeutických zásahů. Tak například faktory, které regulují regulaci exprese IL-2 prostřednictvím AKAP, mohou být užitečné jako náhrada podávání exogenního rekombinantního IL-2.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

V příkladu 1 je popsáno vytváření protilátek imunoreaktivních proti proteinům AKAP v T-buňkách. Příklad 2 se týká analýzy proteinů rozpoznávaných těmito protilátkami za použití metody Western blot. Příklad 3 popisuje afinitní purifikací proteinu AKAP z T-buněk rozpoznávaného výše uvedenými protilátkami. Příklad 4 popisuje terapeutické aplikace proteinů AKAP a sloučenin modulujících vazbu AKAP.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Produkce anti-AKAP protilátek

A. Polyklonální antiséra

Polyklonální sérum se vytvoří v myších očkovaných rekombinantním proteinem AKAP 79 podle protokolu, který lze v krátkosti popsat takto:

Myši Balb/c o stáří 6 až 8 týdnů se nejprve očkují vždy 50 gg rekombinantního proteinu AKAP 79 ve Freundově úplném adjuvans. Imunogen AKAP 79 byl exprimován v E. coli, jakožto fúzovaný protein s polyhistidinovým ocasem [Carr et al. J. Biol. Chem. 266: 14188 až 14192 (1991)]. Očkování se provádí čtyřikrát za sebou s intervalem dvou až tří týdnů, vždy za použití 50 μg AKAP 79 ve Freundově neúplném adjuvans. Polyklonální sérum se získá po posledním očkování a zkouškou ELISA se potvrdí, že rozeznává AKAP 79.

B. Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátky se vytvoří podle očkovacího protokolu, který je popsán výše pro vytvoření polyklonálního séra. Po posledním očkování se myším vyjme slezina a dále uvedeným způsobem se provede fúze.

Suspenze jednotlivých buněk se vytvoří rozmělňováním sleziny mezi matovanými stranami dvou podložních sklíček mikroskopu ponořených do média RPMI (bez séra) doplněného L-glutaminem (2mM), pyrohroznanem sodným (lmM), penicilinem (100 jednotek/ml) a streptomycinem (100 mg/ml, Gibco, Kanada). Buněčná suspenze se přefiltruje přes sterilní září10 zení pro filtraci buněk s póry o průměru 212 μη (70 - mesh Nirex Cell Strainer, Becton, Dickinson, Parssipany, New Jersey, USA) a buňky se dvakrát promyjí pětiminutovou centrifugací při 200 x g a potom resuspendují ve 20 ml média RPMI. Podobným způsobem se připraví thymocyty odebrané třem neošetřeným myším Balb/c.

Buňky myelomu NS-1 se uchovávají v logaritmické fázi v médiu RPMI doplněném 10 % fetálního hovězího séra (FBS, HyClone Laboratories, lne., Logan, UT, USA) 3 dny před fúzí. Těsně přes fúzí se buňky 5 minut odstředfují při 200 x g a výsledná peleta se dvakrát promyje výše uvedeným způsobem. Po promytí se objem buněčné suspenze upraví RPMI bez séra na 10 ml a 10 μΐ vzniklého přípravku se zředí v poměru 1 : 100. Přibližně 20 μΐ každého zředěného přípravku se smíchá s 20 μΐ 0,4% trypanové modři v 0,85% roztoku chloridu sodného (Gibco), směs se převede do hematocytometru (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL,

USA) a spočítají se životaschopné buňky.

Přibližně 1,7 x 10⁸ slezinných buněk se smíchá s 3,4 x 10⁷ buněk NS-1, směs se odstředí a vzniklý supernatant se zahodí. Buněčná peleta se rozptýlí oťukáním zkumavky, v průběhu 1 minuty se k ní za míchání přidají 2 ml PEG 1500 o teplotě 37°C (50% roztok v 75mM HEPES o pH 8,0) (Boehringen Mannheim) a potom se v průběhu 7 minut přidá 14 ml séraprostého RPMI. Dále se přidá 16 ml RPMI a buňky se 2 minuty odstřeďují při 200 x g. Supernatant se zahodí a buněčná peleta se resuspenduje ve 200 ml RPMI s obsahem FBS (15%), hypoxanthinu sodného (lOOmM), aminopterinu (0,4mM), thymidinu (HAT) (Gibco) (16mM), IL-6 (Mallinckrodt) (25 jednotek/ml) a thymocytů (1,5 x 10⁶ ml“¹). Suspenze se 4 hodiny inkubuje při 37^eC a potom se umístí do 10 96-jamkových misek pro tkáňové kultury s plochým dnem (Corning, Velká Británie) při objemu 200 μΐ/jamka. Třetí, čtvrtý a šestý den se odsátím odstraní vždy přibližně polovina média z každé jamky za použití jehly 18 G (Becton Dickinson) a doplní se čerstvé výše popsané médium, které však obsahuje IL-6 (10 jednotek/ml) a které neobsahuje thymocyty.

Screening na fúzi 160 se provede, když růst buněk dosáhne 60 až 80% konfluence (8 až 10 dní po fúzi) metodou ELISA. Čtyři misky Immulon (Dynatech, Cambridge, MA, USA) se potáhnou při 4°C přes noc úplnou nekonjugovanou kozí protimyší molekulou (Cappel) zředěnou v poměru 1 : 5000 50mM uhličitanovým pufrem o pH 9,6. Misky se třikrát opláchnou PBS s obsahem 0,05 % smáčedla Tween 20 (PBST) a potom se přidá 50 ml supernatantu kultury. Následuje 30 minutová inkubace při 37°C, po níž se misky výše uvedeným způsobem opláchnou a přidá se k nim 50 ml kozího protimyšího IgG(fc) konjugovaného s křenovou peroxidasou (Jackson ImmunoResearch, West Growe, PA, USA). Misky se zakryjí páskou, inkubují výše uvedeným způsobem a třikrát promyjí PBST. Po třetím promytí se přidá 100 μΐ substrátu obsahujícího o-fenylendiamin (Sigma) o koncentraci 1 mg/ml a 30% peroxid vodíku (0,1 ml/ml) ve lOOmM citrátovém pufru o pH 4,5. Barevná reakce se po 6 minutách zastaví přídavkem 50μ1 15% kyseliny sírové. Absorbance při 490 nm se měří na čtecím zařízení pro misky (Dynatech) a jamky vykazující reaktivitu se dále zkoušejí na reaktivitu analýzou dot blot na AKAP 79. Dvě jamky (označení 160C a 160K) se klonují dvakrát nebo třikrát po sobě tak, že se zdvojnásobí zředění v RPMI s fetálním hovězím sérem (FBS) (15%), sodnou solí hypoxanthinu (lOmM), thymidinem (16mM) a IL-6 (10 jednotek/ml). Jednotlivé jamky se hodnotí vizuálně po 4 dnech a zaznamená se počet kolonií v jamkách s nižší hustotou. Zvolené jamky z každého klonování se zkoušejí na reaktivitu s AKAP 79 za použití zkoušky ELISA a analýzy dot blot, jak to bylo popsáno výše. Při posledním klonování se pozitivní jamky obsahující jednotlivé kolonie expandují v RPMI s 10% FBS. Monoklonální protilátky z klo12 novaných buněčných linií se isotypují za použití kitu pro isotypování Isostrip (Boehringer Mannheim) podle doporučeného protokolu výrobce.

Dvě monoklonální protilátky označené 160C a 160K byly identifikovány jako imunoreaktivní s AKAP 79, přičemž u nich byl zjištěn isotyp IgGl.

Příklad 2

Western Blotting

Pro stanovení distribuce antigenů rozpoznávaného polyklonálním sérem a monoklonálními protilátkami identifikovanými v příkladu 1 se provede zkouška Western Blotting za použití proteinového extraktu z buněk různého typu.

Úplný buněčný extrakt z každého použitého typu buněk uvedeného dále se připraví vařením a ultrazvukovým zpracováním buněčných pelet v 160mM Tris HCl o pH 6,8 s přísadou SDS (4%) a DTT (200mM). Bloty Western se připraví podle standardního protokolu (Toubin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 4350 až 4354 (1979)) zahrnujícího elektroforézu 50 až 100 μg proteinu z buněčného extraktu na 10% gelu SDS-page, přenos proteinu na nitrocelulosovou membránu a blokování 5% odtučněným sušeným mlékem v roztoku chloridu sodného pufrovaném Tris (TBS) s obsahem BSA (0,1%) Po blokovacím stupni se membrány inkubují v TBS s obsahem BSA (5 %) s primární a sekundární protilátkou. Sekundární protilátkou je konjugát kozího protimyšího IgG s křenovou peroxidasou (Boehringer Mannheim). Byla pozorována detekce imunoreaktivních proteinových pásů se zvýšenou chemiluminis cencí (ECL).

V extraktu z Jurkatových buněk myší polyklonální sérum specificky rozpoznává 79kD protein kromě proteinu o velikosti asi 120 kD. V jiných buněčných extraktech rozpoznává polyklonální sérum 79kD protein v buněčné linii ledvinového epithelu člověka (HEK 293) a mozku člověka, jakož i známé homology druhu AKAP 79 a AKAP 75 z hovězího mozku a AKAP 150 z myšího mozku.

Monoklonální protilátka 160C rozpoznává jak 120kD protein v Jurkatových extraktech, tak AKAP 79 z mozku člověka, ale nedeteguje 120kD protein v úplných extraktech neutrofilů člověka, promyelocytových buňkách HL60, buňkách Ramos (B), endothelových buňkách HUVETS, fibroblastových buňkách COS nebo epithelových buňkách T84. Protilátka 160K však rozpoznává pouze isoformu AKAP 79 v mozku.

V dalších experimentech se ukázalo, že 79kD protein (jakož i 120kD protein) váže Rlla za použití technik s překrýváním pomocí Rlla a pravděpodobně se tedy jedná o variantu AKAP 79 z mozku člověka v Jurkatových T-buňkách.

Příklad 3

Afinitní purifikace AKAP 120

S ohledem na skutečnost, že monoklonální protilátka 160C je schopna rozpoznat 120kD protein v Jurkatových buňkách, byly učiněny pokusy o purifikaci 120kD proteinu za účelem stanovení jeho vztahu k AKAP 79.

A. Chromatografie na cAMP-Sepharose

Napěstuje se přibližně 1 x 10⁹ Jurkatových buněk v rotačních baňkách obsahujících úplné médium RPMI. Buňky se peletizují, třikrát promyjí roztokem chloridu sodného pufrovaného fosforečnanem a prostého vápníku a hořčíku (CMFPBS) a podrobí lysí v 10 objemech (vztaženo na hmotnost vlhké buněčné pelety) pufru A (Tris HCl o pH 7,4 - 20mM); chlorid hořečnatý - l,5mM; DTT - lmM; chlorid sodný - 0,2M; NP-40 - 0,1% a koktejl inhibitoru proteasy) 60 minut při 4°C. Lysát se 30 minut odstřeďuje při 40 000 x g a výsledný supernatant se nanese na 5 ml suspenze cAMP-Sepharose (Sigma), která byla předběžně ekvilibrována v pufru A. Směs se inkubuje 2 hodiny při 4°C a potom se přenese na lOml sloupec BIORAD pro jedno použití a provede se eluce 10 objemy pufru A (bez NP-40). Pryskyřice se rozdělí na dva stejné díly. Jedna polovina pryskyřice se inkubuje se třemi objemy sloupce 0,5mM peptidu Ht31 v pufru A (bez NP-40) a druhá polovina se inkubuje se třemi objemy sloupce 75mM cAMP v pufru A (bez NP-40). Každá inkubace se provádí 60 minut při teplotě místnosti a poté se suspenze přenese na lOml sloupec pro jedno použití a shromáždí se eluát. Protein v eluátu se zkoncentruje více než desetkrát za použití sloupců CENTRIPREP 10 (Amicon) a potom se provede analýza Western Blot.

120kD protein se specificky eluuje z cAMP-Sepharose jak peptidem Ht31 s amfipatickou šroubovicí, tak cAMP, což potvrzuje, že proteinem je isoforma AKAP a že je protein schopen vázat regulační podjednotku typu II (RII) z PKA.

B. Chromatografie na Calmodulin-Agarose

Výše uvedeným způsobem se připraví a zpracují buněčné lysáty, pouze s tím rozdílem, že se supernatant nanese na pryskyřici Calmodulin-Agarose (Sigma), která byla předem ekvilibrována v pufru A (popsaném výše) s přísadou chloridu vápenatého (0,5mM) a bez NP-40. Po přenesení na sloupec pro jednorázové, použití se pryskyřice promyje stejným pufrem a protein se s pryskyřice eluuje pufrem A s obsahem EGTA (2mM), ale bez chloridu vápenatého nebo NP-40.

120kD protein se specificky eluuje z CalmodulinAgarose, pravděpodobně bud díky přímé vazbě ke kalmodulinu a/nebo nepřímé vazbě ke kalmodulinu zprostředkované asociací s komplexem jiných proteinů vázajících se ke kalmodulinu, jako je například kalcineurin.

Příklad 4

Terapeutické aplikace

Předchozí zjištění, že AKAP 79 váže kalcineurin, je relevantní s ohledem na skutečnost, že kalcineurin je cílem dvou silných a klinicky užitečných imunosupresiv, cyklosporinu a FK506, které oba inhibují aktivitu kalcineurinu. Jak je popsáno dále, jak cyklosporin, tak FK506 jsou užitečné při léčení různých chorob, ale vykazují významné omezující vedlejší účinky. Předpokládá se, že faktory modulující vazbu AKAP/kalcineurin mohou v konečném důsledku modulovat následnou signalizaci v této dráze, ale možná s vyšší specificitou vůči typu buněk, než je specificita pozorovaná u cyklosporinu nebo FK506. Identifikace takového modulátoru, zejména modulátoru s menším rozsahem vedlejších účinků, než je rozsah pozorovaný u jiných imunosupresiv by pravděpodobně měla široké terapeutické využití při léčení řady chorob, které jsou v současné době léčeny cyklosporinem nebo FK-506.

Byly oznámeny četné klinické indikace cyklosporinu a FK-506. Tak například cyklosporin představuje standard pro potlačování imunity po transplantacích, přičemž umožňuje provedení transplantací jater, plic, střev a slinivky břišní, přestože se FK506 obecně považuje za silnější imunosupresivum. Pacienti, u nichž byla provedena transplan16 táce, kteří netolerují nebo nerespondují na cyklosporin nebo

FK506, jsou někdy úspěšně převedeni na jiné léčivo.

Jako další příklad je možno uvést zánětlivou.chorobu střev (IBD) , což je obvyklý termín pro dvě choroby mající různé klinické projevy, tj. Crohnovu chorobu a vředovou koliditu (UC). Cyklosporinu bylo úspěšně použito při léčení Crohnovy choroby, přičemž statisticky významné výsledky léčení se projevily přinejmenším u jednoho z indexů aktivity choroby [Brynskow, Dan. Med. Bull. 41: 332 až 344 (1994)]. Jiné indexy, které nejlépe korelují s resolucí akutních exacerbací, však vykázaly jen nevýznamnou tendenci ke zlepšení. Cyklosporin vykázal také účinnost při prudké akutní vředové kolitidě resistentní vůči steroidům (data nejsou statisticky významná, poněvadž bylo nutno zkoušku ukončit z etických důvodů). Další zkouška na pacientech se sklerotizující cholangitidou a vředovou kolitidou ukázala okrajovou statistickou významnost směrem k mírnějšímu průběhu vředové kolidity. Po vysazení léčení došlo obvykle k recidivě a léčení bylo omezeno s ohledem na toxicitu (Choi a Targan, Dig. Dis. and Sci. 39: 1885 až 1892 (1984)). Kromě toho se imunosupresiv, jako je methotrexate, azathioprine a 6-MP, úspěšně používalo při léčení IBD.

Jako další příklad lze uvést účinnost cyklosporinu při léčení rheumatoidní arthritis (RA). Při několika pokusech, kdy bylo této látky použito jako léčiva druhé nebo třetí volby, tj. u pacientů, kteří nerespondovali na jiné zavedené terapie a přitom byly postiženi prudkou chorobou. Při těchto pokusech se zjistilo, že cyklosporin je obecně stejně účinný a stejně toxický, jako jiná činidla druhé volby, jako je zlato, antimalarické prostředky a azathioprine, D-penicillamine a methotrexate. [Wells a Tugwell, Br. J. Rheum., (suppl. 1): 51 až 56. (1993); Forre et al., Arth. Rheum.,

30: 88 až 92 (1987)]. Tyto pokusy uvádějí pouze léčení velmi prudké aktivní RA, u níž je léčení neúčinné s ohledem na skutečnost, že cyklosporin vykazuje potenciálně nevratnou toxicitu [Dougados a Torley, Br. J. Rheum. 32 (suppl.

1): 57 až 59 (1993)]. Renální toxicita je pravděpodobně převážně zprostředkována renální vasokonstrikcí, která vyvolává exacerbaci nefrotoxicity nesteroidních protizánětlivých léčiv (NSAID) a ledvinovou chorobou, jež je inherentní součástí rheumatoidní arthritis [Leaker a Cairns, Br. J.

Hosp. Med., 52: 520 až 534 (1994); Sturrock et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1149 až 1156 (1994); Ludwin a

Alexopolulou, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 60 až 64 (1993)]. Při asi 10 % biopsií ledvin u pacientů postižených rheumatoidní arthritis, kteří byli léčeni cyklosporinem, byly zjištěny morfologické znaky toxicity cyklosporinu [International Kidney Biopsy Registry of Cyclosporin in Autoimmune Diseases, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 65 až 71 (1993) ] .

Jako ještě další příklad je možno uvést účinnost cyklosporinu při léčení asthmatu dependentního na steroidech. Při jednom pokusu byl malý počet pacientů náhodným způsobem rozdělen do skupin, které dostávaly buď cyklosporin nebo placebo. Cyklosporinová skupina vykazovala zvýšený průtok vzduchu a FVC, jakož i menší počet případů záchrany prednisolonem.

Jako další příklad je možno uvést účinnost cyklosporinu při léčení nefrotického syndromu dependentního na steroidech. Ukázalo se, že pacienti, kterým byla podávána nízká dávka cyklosporinu, měli snížené požadavky na steroid, ale po vysazení cyklosporinu došlo k návratu na původní stav. Formy nefrotického syndromu resistentního vůči steroidům vykazují odpověď na cyklosporin pouze 20 až 30 % případů [Meyrier, Nephrol., Dial. Transplant, 9. 596 až 598 (1994); Hulton et al., Pediatr. Nephrol. 8: 401 až 403 (1994)]

Pokud se týče léčení systemického lupus erythematosus (SLE), jedna studie ukázala statisticky významný pokles indexů aktivity SLE při prospektivní nerandomizované neřízené studii [Tokuda et al., Arthr. Rheumat., 37:

551 až 558 (1994)]. Jiné studie však účinnost u SLE nepotvrdily.

Jako další příklad je možno uvést účinnost cyklosporinu indukovat remisi inzulin-dependentní diabetes mellitus, pokud byl cyklosporin zaveden časně po počátečních projevech. Remise trvaly v průměru asi jeden rok, přestože v některých případech byly i delší - až 850 dnů [Jenner et al., Diabetologia, 35: 884 až 888 (1992); Bougneres et al., Diabetes, 39: 1264 až 1272 (1990)]. Žádný dlouhodobější účinek cyklosporinu nebyl zaznamenán při následujícím rozšíření jedné studie [Martin et al., Diabetologia, 34: 429 až 434 (1991)]. Při jiné studii však došlo v průběhu 12 až 18 měsíců léčení ke zhoršení funkce ledvin, přičemž funkce ledvin se úplně nevrátila na úroveň dosaženou při podávání placeba, což ukazuje, že zřejmě došlo k určitému chronickému poškození ledvin [Feldt-Rasmussen et al., Diabetes Medicine, 7: 429 až 433 (1990)]. Pro zvýšení účinku imunosupresivního léčení v průběhu inzulin-dependentního diabetes mellitus by bylo zapotřebí časnější intervence. Někteří výzkumníci úspěšně zkoušeli profylaktické léčení znaků diabetes u příbuzných pacientů z prvního kolene [Elliott and Chase, Diabetologia, 34: 362 až 365 (1991)].

Jako další příklad je možno uvést účinné léčení lupénky cyklosporinem [Cuellar et al., Balliere’s Clin. Rheum., 8: 483 až 498 (1994); Ellis et al., JAMA 256: 3110 až 3116 (1986)]. Vysokodávková terapie byla účinná při léčení psoriatické arthritis, což je obzvláště prudká forma destruktivní arthritis.. Při přerušení léčení byla obvykle pozorována exacerbace choroby kůže a kloubů. S ohledem na potenciální vedlejší účinky a potřebu průběžné dlouhodobé léčby je cyklosporin indikován pouze v případech psoriatické arthritis, na kterou nezabírají jiné způsoby léčení.

Kromě toho byla demonstrována účinnost léčení prudké atopické dermatitis cyklosporinem při studiích kontrolovaných placebem a dvěma slepými pokusy [Van Joost et al., Br. J. Derm., 130: 634 až 640 (1994); Cooper, J.

Invest. Derm., 102: 128 až 137 (1994)]. Pacienti při této studii dávali přednost vedlejším účinkům léčení zahrnujícím nauseu, abdominální diskomfort, paresthesie, cholestasis a ledvinovou nedostatečnost před neléčenou chorobou. Při jiné randomizované studii kontrolované aplikací placeba a dvěma slepými pokusy se ukázalo, že podáváním cyklosporinu se významně zvýšila kvalita života u pacientů postižených prudkou atopickou dermatitis [Salek et al., Br. J. Derm., 129: 422 až 430 (1993)]. Po přerušení léčby cyklosporinem došlo k rychlé recidivě kožních lézí, ale kvalita života zůstala zlepšena.

Cyklosporinu bylo dále použito při léčení chronické dermatitis rukou, což je choroba u níž byla konstatována prevalence 4 až 22 %, jež se obvykle léčí topickými steroidy, které však u mnoha pacientů nezabírají. Nízké dávky cyklosporinu se ukázaly být jako účinné při otevřené studii u 6 ze 7 léčených pacientů [Reitamo a Granlund, Br. J.

Derm., 130: 75 až 78 (1994)]. Po přerušení podávání cyklosporinu došlo k recidivě přibližně u poloviny pacientů.

Dále bylo také cyklosporinu použito pro léčení urtikárie a angioedému, což jsou idiopathické kožní choroby, které se projevují jako kopřivka a podkožní otoky. Patologie těchto chorob má vztah k žírným buňkám a jejich léčení je často neúčinné. Při jedpé studii byli tři pacienti postižení těmito chorobami nerespondující na jiné léčení léčeni cyklo20 sporinem a všechny symptomy u nich vymizely v průběhu jednoho týdne [Fradin et al., J. Am. Acad. Derm., 25: 1065 až 1067 (1991)]. U všech pacientů muselo být léčení ukončeno s ohledem na vedlejší účinky a po přerušení léčení došlo k recidivě symptomů.

Pokud se týče jiných rheumatologických chorob, uvádějí studie účinné léčení cyklosporinem i u dalších méně častých autoimunitních chorob, jako je Behcetova choroba [Pacor et al., Clin. Rheum., 13: 224 až 227 (1994)], Wegnerova granulomatosa [Allen et al., Cyclosporin A Therapy for Wegner's Granulomatosis in ANCA-Associated Vasculitides, Immunological and Clinical Aspects, Gross ed. Plenům Press (1993)] a imunitně mediovaná thrombocytopenie [Schultz et al., Blood 85: 1406 až 1408 (1995)].

Při mnohých výše popsaných studiích bylo použití cyklosporinu nebo FK506 spojeno s mnoha nežádoucími vedlejšími účinky. Obvykle platí, že obecné potlačení imunity vede ke zvýšenému ohrožení infekcemi a malignancemi a je nepravděpodobné, že imunosupresiva příbuzná AKAP by nezahrnovala podobná rizika. Jiným vedlejším účinkům je však možno se vyhnout, nebo je možno je snížit tkáňovou specificitou AKAP. Nejběžnějším vážným vedlejším účinkem cyklosporinu i FK 506 je nefrotoxicita, která je přinejmenším do určité míry závislá na podané dávce a vyskytuje se u většiny pacientů, obvykle v podobě poklesu rychlosti glomerulární filtrace během léčení. Tento vedlejší účinek je však alespoň zčásti vratný po přerušení podávání léčiva [Leaker and Cairns, viz výše uvedená citace]. Obvykle se nevyvine progresivní ledvinová insuficience, přestože pro definitivní zhodnocení by bylo zapotřebí provést další studie. Chronické poškození bylo pozorováno i u pacientů, kterým byl podáván cyklosporin v nízkých dávkách (3 až 4 mg/kg/den).

Při biopsii byly u 40 % z těchto pacientů pozorovány změny zahrnující intersticiální fibrosu, tubulární atrofii a arteriolopathii [Svarstad et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1462 až 1467 (1994); Young et al., Kidney International, 46; 1216 až 1222 (1994)]. Změny endothelových buněk byly také zřejmé na histologických řezech [Kahan, N. Engl. J. Med., 321: 1725 až 1748 (1989)]. Byl učiněn předpoklad, že se nefrotoxicita dostavuje především v důsledku arteriolární vasokonstrikce a chronické mírné ischemie [Leaker a Carins, viz výše uvedená citace], přestože jsou tato léčiva také přímo toxická vůči tubulárním buňkám a vaskulárním intersticiálním buňkám [Platz et al., Transplantation, 58: 170 až 178 (1994)]. Některé zprávy ukazují, že výskyt a prudkost nefrotoxicity může být o něco vyšší u FK506 [Platz et al., výše uvedená citace].

Jinou uváděnou významnou toxicitou jak cyklosporinu, tak FK 506 je neurotoxicita, která se klinicky projevuje záchvaty, konfusí, slepotou, komatem, bolestí hlavy, ataxií, Parkinsonovským syndromem, paresthesiemi, psychosou, fokálními deficity, akinetickým mutismem, třasem, neuropathií a poruchami spánku [Shimizu et al., Pediatr.

Nephrol., 8: 483 až 385 (1994); Wilson et al., Muscle and Nerve, 17: 528 až 532 (1994); Reece et al., Bone Marrow Transpl. 8: 393 až 401 (1991); Eidelman et al., Transpl. Proč., 23: 3175 až 3178 (1991); de Groen et al., N. Engl. J. Med., 317: 861 až 566 (1987)]. Po transplantaci jater byla mírná až prudká neurotoxicita pozorována u 10 až 20 % pacientů léčených FK 506 a 3 až 12 % pacientů léčených cyklosporinem. Neurotoxicita byla také spojována s abnormalitami v obsahu lipidů v séru a s dysfunkcí jater.

Z jiných vedlejších účinků cyklosporinu a/nebo FK506 je možno uvést hepatotoxicitu, glukosovou intoleranci, hypertensi, hirsutismus, gastrointestinální symptomy, žilní trombózu, pankreatitis a hyperplasii dásní [Morris J.

Heart Lung Transplant. 12: S275 až S286 (1993); Fung et al., Transpl. Proč., 23: 3105 až 3108 (1991); Mason Pharmacol. Rev., 42: 423 až 434 (1989); Kahan, N. Engl. J. Med. 321: 1725 až 1738 (1989); Thomason et al., Renal Failure, 16:

731 až 745 (1994)]. S ohledem na široké využití cyklosporinu a FK 506 a na inherentní vedlejší účinky jejich aplikace by bylo vyvinutí alternativních imunosupresiv výjimečně prospěšné.

Tak například je možné, že delokalizace kalcineurinu z předpokládaného AKAP T-buněk, by mohla inhibovat aktivitu kalcineurinu při aktivaci T-buněk. Tak by bylo možno získat imunosupresivum specifické vůči T-buňkám, které by vykazovalo užitečnost cyklosporinu nebo FK506, ale méně vedlejších účinků. Nedávné pozorování, že delokalizace PKA z AKAP T-buněk zvyšuje expresi IL-2 ve stimulovaných buňkách ukazuje, že PKA lokalizovaná v AKAP určitým způsobem přispívá k regulační roli při expresi IL-2 během aktivace T-buněk. Delokalizace PKA specifická vzhledem k T-buňkám může proto představovat prostředek pro zvýšení sekrece IL-2 in vivo, jehož účinek je srovnatelný s podáváním rekombinantního IL-2. Možná, že by bylo možno takto dosáhout snížení toxicity léčení pomocí IL-2, jak je to uvedeno dále.

IL-2 byl schválen pro léčení metastatického renálního karcinomu a přibližně 15 až 20 % pacientů s metastatickým renálním karcinomem nebo maligním melanomem je respondentních vůči léčení IL-2. Některé z těchto odpovědí jsou trvalé a projevují se déle než 66 měsíců [Dillman, Cancer Biotherapy, 9: 183 až 209 (1994); Whittington a Faulds,

Drugs 46: 446 až 514 (1993)]. Léčení vysokými dávkami (bolus) bylo sice spojeno s několika prudkými vedlejšími účinky (viz dále). Subkutánní podávání nebo léčení pomocí kontinuální infuse poskytlo nízký stupeň odpovědi (12 %) při současném snížení toxicity [Vogelzang et al., J. Clin. Oncol., 11: 1809 až 1816 (1993)].

Léčení pomocí IL-2 (se současným podáváním interferonu a nebo jiných činidel nebo bez něho) bylo zkoušeno i při léčení jiných malignancí. Tak například při přímé aplikaci IL-2 do nádorového lůžka po resekci gliomu vedlo k prodloužené klinické odpovědi, ale nikoliv k vyléčení [Merchant et al., J. Neuro., 8: 173 až 188 (1990)]. Při dalších zkouškách byla oznámena omezená účinnost u lymfomu, [Dillman, viz výše uvedená citace], kolorektálního karcinomu, [Whittington a Faulds, viz výše uvedená citace], omezeného AML [Bruton a Koeller, Pharmacotherapy, 14: 635 až 656 (1994)], rakoviny vaječníků a časné rakoviny močového měchýře [Whittington a Faulds, viz výše uvedená citace]. Počet účastníků každé z těchto studií byl však příliš malý na to, aby to umožnilo zjistit statistickou významnost pozorované účinnosti.

IL-2 byl také používán v kombinaci s adoptivní imunoterapií a bylo ukázáno, že je účinný při léčení metastatického renálního karcinomu [Pierce et al., Sem. Oncol., 22: 74 až 80 (1995); Belldegrun et al., J. Urol., 150: 1384 až 1390 (1993)]. Kromě toho může být IL-2 také účinný při léčení určitých infekčních chorob prostřednictvím snížení bakteriálního zatížení kůže a hladiny antigenů u pacientů s leprosou po intradermální injekci [Kaplan, J. Infect.

Dis., 167 (suppl. 1): S18 až 22 (1993)]. Také bylo pozorováno, že lymfocyty od pacientů postižených tuberkulózou produkují nižší hladinu IL-2 ve srovnání s lymfocyty PPD-pozitivních zdravých kontrolních jedinců [Sanchez et al., Inf. Immun., 62: 5673 až 5678 (1994)], což ukazuje, že léčení IL-2 může mít smysl při léčbě mykobakteriálních infekcí.

Přes potenciální terapeutickou hodnotu IL-2 je tento cytokin také spojen s významnou toxicitou [pokud není uvedeno jinak, jsou zdrojem těchto informaci výše uvedené citace Whittington a Faulds, Dillman a Bruton a Koeller]. Hlavními vedlejšími účinky omezujícími takové léčení je syndrom kapilárního krvácení. Podávání IL-2 zvyšuje vaskulární permeabilitu, což vyvolává intersticiální a plicní edém, přičemž se u pacientů vyvíjí hypotense a značný počet z nich vyžaduje presory. Intenzivní resuscitace kapaliny může vyvolat plicní edém ohrožující život. Až 20 % pacientů může vyžadovat intubaci a mechanickou ventilaci. Podávání ve vysokých dávkách v podobě bolu vyvolává prudší krvácení než podávání v nízké dávce nebo pomalá kontinuální infuse a při některých léčebných režimech může 100 % pacientů vyžadovat podporu ICU při léčení IL-2. Také byly pozorovány myocarditis, kardiomyopathie a srdeční arytmie. Důsledkem hypotense indukované syndromem vlásečnicového krvácení může být akutní selhání ledvin.

IL-2 může také vyvolat prudkou diarrheu s nerovnováhami elektrolytu, cholestázu, thyroidní abnormality a akutní pankreatitidu. U 15 až 20 % léčených pacientů se vyvíjí anémie vyžadující transfuse [Mac Farlane et al., Cancer 75: 1030 až 1037 (1995)]. Může dojít také k thrombocytopenii s krvácením a k defektům vyvolaným koagulací drah. U více než 70 % pacientů dojde ke změnám duševního stavu včetně paranoidních delusí, halucinací, ztráty zájmu, poruch spánku a netečnosti. Také byly oznámeny jevy, jako je koma, poruchy vidění, přechodné ischemické záchvaty a paresthesie. Tyto nevýhody spojené s exogenním IL-2 vyvolávají snahu hledat alternativy, při nichž by například mohla být modulována endogenní produkce IL-2 a tak eliminována nutnost léčení exogenní IL-2. Takové alternativy by mohly být terapeuticky využitelné.

Identifikace proteinů AKAP umožňuje nejen získat možný prostředek pro identifikaci imunosupresivních léčiv a modulátorů produkce IL-2, nýbrž umožňuje i regulovat jiné buněčné aktivity pravděpodobně s ohledem na různé metabolické dráhy, na nichž se proteiny AKAP, jak bylo ukázáno, podílejí. Tak například AKAP 79 je důležitý při regulaci iontových kanálů regulovaných receptorem glutamátu v postsynaptické hustotě neuronů, pravděpodobně prostřednictvím vazby PKA, PKC a kalcineurinu. PKA reguluje aktivitu kanálů regulovaných receptorem AMPA a delokalizace nebo inhibice PKA zeslabuje aktivitu AMPA na iontové kanály. PKC reguluje aktivitu kanálů regulovaných receptorem NMDA a kalcineurin desensitizuje receptor NMDA při reakci na stimuly. Tato pozorování ukazují, že lokalizované kinasy (PKA a PKC) mohou regulovat aktivitu glutamátových receptorů v neuronech. Defosforylace kalcineurinem představuje protiregulační mechanismus receptorů NMDA. Tento model je ve fyziologie kém souladu s výskytem záchvatů indukovaných cyklosporinem nebo FK506.

Úloha glutamátových receptorů je předpokládána při mnoha neurologických chorobách. Glutamát a jiné excitační aminokyseliny mohou vyvolat v neuronech excitotoxicitu a bylo pozorováno, že nadměrná stimulace postsynaptických glutamátových receptorů je toxická vůči neuronům, přičemž vyvolává akutní degeneraci neuronů. Zjistilo se, že hypoxie (například po mrtvici nebo srdeční zástavě) a poškození centrálního nervového systému vyvolává značný výron glutamátu do extracelulárního prostoru. Tento glutamát se potom dostává do interakce s glutamátovými receptory a spouští excitotoxickou kaskádu. Pro ochranu modelových zvířat před poškozením mozku je možno použít antiexcitačních činidel [Olney, Neurobiology of Aging, 15: 259 až 260 (1994)]. Je zajímavé, že antagonisty NMDA jsou toxické k některým typům neuronů, což ukazuje, že glutamát možná inhibuje jiné exci26 tační dráhy v těchto buňkách. Bylo ukázáno, že makrolidové protilátky, jako je FK506, také chrání proti excitotoxicitě u kultivovaných neuronů vyvolané NMDA, ale nikoliv kainátem. [Manev et al., Brain Res., 624: 331 až 335 (1993)].

Glutamát se zřejmě také podílí na Parkinsonově chorobě. Antagonisty NMDA chrání dopaminergické neurony v substantia nigra opic exponovaných MPTP, což je chemická sloučenina indukující Parkinsonovský syndrom u člověka a jiných primátů. Amantadin a nemantin jsou antagonisty NMDA, kterých se používá v Evropě pro léčení Parkinsonovy choroby, ale o obou těchto látkách je známo, že u některých pacientů vyvolávají psychózu. Existují určité důkazy, že glutamátergické neurony mohou být při Parkinsonově chorobě hyperaktivní a jejich inhibice by mohla snížit motorické symptomy choroby [Lange a Riederer, Life Sciences, 55: 2067 až 2075 (1994)].

Glumatát má svou úlohu také při poruchách projevujících se záchvaty. Podílí se na počátku, šíření a udržování aktivity záchvatu. NMDA a ne-NMDA antagonisty jsou silnými antikonvulsivy [Meldrum, Neurology, 44 (suppl. 8): S14 až S23 (1994)]. Receptory AMPA byly také implikovány při ALS a v současné době probíhá zkoušení antagonistů tohoto receptoru.

Vzhledem ke všem výše uvedeným pozorováním není překvapující, že také četná jiná imunosupresiva jsou ve stádiu klinických zkoušek. Následující informace týkající se takových studií byly získány z publikace Haydon a Haynes, Balliere's Clin. Gastroentero., 8: 455 až 464 (1994); Thomason a Starzi, Immunol. Rev. 1993, 71 až 98 (1993); a Morris J. Heart Lung Transplant., 12: S275 až S286 (1993). Tak například azaspiran indukuje určitý typ supresorových buněk a existují určité důkazy synergických účinků této látky s cyklosporinem.

Jako další příklad je možno uvést, mycophenolate mofetial (sloučenina vyvinutá firmou Syntex), který inhibuje syntézu purinu a vykazuje selektivní antiproliferativní účinek na T- a B-buňky. Tato látka vyčerpává protilátky a může též odčerpávat adhesní molekuly z povrchu buněk. Toto léčivo má nízkou zjevnou toxicitu a může vyvolávat leukopenii. Již 20 let se ho používá pro léčení lupénky.

Jako další příklad je možno uvést mizoribine (sloučenina vyvinutá firmou Sumitomo), který inhibuje syntézu DNA. Tato látka má stejný mechanismus účinku jako mycophenolate.

Jako další příklad je možno uvést brequinar (sloučenina vyvinutá firmou DuPont-Merck), který inhibuje syntézu pyrimidinu blokováním dihydroorát dehydrogenasy. Je očekávána úplná zpráva o klinických pokusech s touto látkou. Bylo oznámeno, že tato látka synergicky působí s cyklosporinem, ale může vyvolávat thrombocytopenii, dermatitis a mukositis.

Jako další příklad je možno uvést 15-deoxysperqualin (sloučenina vyvinutá firmou Nippon-Kayaku), která převážně ovlivňuje funkci monocytů a makrofáqů, včetně inhibice oxidačního metabolismu, syntézy lysosomálního enzymu, produkce IL-1 a exprese antiqenů MHC z třídy II na povrchu buněk. Tato sloučenina je ze 70 až 90 % účinná při odmítání ledviny, které neresponduje na jiné způsoby léčení, ale při vysokých dávkách může vykazovat toxicitu na kostní dřeň.

Jako další příklad je možno uvést leflunomide (sloučenina vyvinutá firmou Hoechst), který inhibuje působení cytokinu, blokuje aktivaci T-buněk a syntézu protilátky. Není toxický ani vůči ledvinám ani vůči kostní dřeni

Jako další příklad je možno uvést rapamycin (sloučenina vyvinutá firmou Wyeth-Ayerst), který je příbuzný FK506. Jedná se o proléčivo, které se aktivizuje vazbou k imunofilinu, neinhibuje kalcineurin a neblokuje produkci cytokinu v T-buňkách. Neznámým mechanismem rapamycin blokuje přechod G1 na S.

Vynález zahrnuje četné modifikace a variace a výše uvedenými příklady provedení není omezen. Všechny takové modifikace spadají do rozsahu vynálezu, pokud jsou kryty připojenými nároky.

Claims (11)

1. Monoklonální protilátka vylučovaná hybridání^m®<

16OC uloženým ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem ΗΒθ^θθ ' 11955. | |

L I 9 0 l 0 ,

2. Hybridom 160C uložený ve sbírce ATCC po přírůstkovým číslem HB 11955.

3. Purifikovaný a izolovaný polypeptid, který je specificky imunoreaktivní s monoklonální protilátkou podle nároku 1 a který vykazuje molekulovou hmotnost asi 120 kD na SDS-PAGE.

4. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle nároku 3.

5. Polynukeotid podle nároku 4, kterým je DNA.

6. DNA podle nároku 5, kterou je cDNA.

7. DNA podle nároku 5, kterou je genomová DNA.

8. DNA podle nároku 5, která je plně nebo zčásti syntetická.

9. Purifikovaný a izolovaný polynuleotid zvolený ze souboru, který se skládá z

a) polynukleotidu podle nároku 4 a

b) polynukleotidu, který za stringentních podmínek hybridizuje k polynukleotidu podle odstavce a).

10. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfe kovaná DNA podle nároku 4 nebo 9.

11. Způsob produkce polypeptidú podle nároku 3, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná polynukleotidem kódujícím polypeptid podle nároku 3 nechá růst v médiu na vhodných podmínek a potom se z hostitelské buňky nebo z růstového média izoluje polypeptid.