SK34697A3 - Monoclonal antibody, hybridoma, polypeptide, polynucleotide, host cell and method of producing polypeptide - Google Patents

Description

Monoklonálna protilátka, hybriäóm, polypeptid, polynukleotid, hostiteíská bunka a. spôsob produkcie polypeptidu

Oblas£ techniky

Vynález sa všeobecne týka proteínov viažúcich v bunkách proteínkinázu A. konkrétnejšie sa vynález týka nových proteínov a nukleotidových sekvencií kódujúcich tieto proteíny, ktoré lokalizujú v bunkách proteínkinázu A. Vynález zahrnuje tieto aspekty; monoklonálnu protilátku, hybridóm, polypeptid, polynukleotid, hostiteískú bunku a spôsob produkcie polypeptidu.

Doterajší stav techniky

Extracelulárne signály, ako sú hormóny a cytokíny, modulujú mnohé bunkové aktivity aktiváciou adenylátcyklázy, zvyšovaním hladiny cAMP v bunkách a konečne aktiváciou cAMP-dependentnej kinázy (PKA). PKA je všadeprítomný enzým, ktorý funguje v mnohých intracelulárnych dráhach, napríklad pri regulácii metabolizmu glykogénu reverz ibi 1nou fosf ory 1 áciou g ly kogén.f osf ory lázy (Walsh et al . , -J. Biol. Chem., 243; 3763 až 3765 (1969)) a reguláciou signalizácii signalizácie prostredníctvom MAP kinázy inhibíciou. aktivácie RAf-1 pomocou Ras (Vojtek et al., Celí, 74: 2Θ5 až 214 (1993) a Hafner et a., Mol. Celí. Biol. 14: 6696 až 6703 (1994)). Inaktívna PKA existuje ako tetrameter. v ktorom sú dve totožné katalytické podjednotky viazané do diméru zahrnujúceho dve regulačné podjednotky. K aktivácii PKA pomocou cAMP dochádza tak, že sa molekula cAMP pripojí ku každej z regulačných podjednotiek (R), pričom dôjde k uvoíneniu. aktívnej katalytickej podjednotky (C). Bola identifikovaná len jedna forma podjednotky C, ale existujú dve triedy podjednotiek R, tj. RI a RII, so zrejme odlišnými subcelulárnymi distribúciami. Izoformy RI (RIalfa a Rlbeta) sú, ako bolo oznámené, prevažne cytoplazmatické a sú vylúčené z jadra, zatiaí čo až 75 7. izoforiem RII (Rllalfá alebo Rllbeta) má povahu častíc, ktoré sú spojené buci s plazmatickou membránou, cy toskeletickými zložkami, sekrečnými granulami, Golgiho aparátmi, centrozómami alebo možno s jadrami (Scott

Pharmac. Ther. 50: 123 až 145 (1991)). Predpokladá sa, že rozdiely (buá fyzikálne alebo fyziologické) medzi rôznymi podjednotkami R predstavujú prostriedok, pomocou ktorého sú bunky schopné obmedziť aktivitu podjednotky C na požadovanú dráhu.

Nedávne dôkazy ukázali, že bunky sú schopné zamerať aktivitu PKA umiestením inaktívneho enzýmu v susedstve potenciálnych substrátov, pričom dôjde k obmedzeniu aktivity podjednotky C po jej uvolnení vyvolanom naviazaním cAMP na. podjednotku R. Pri tomto rozparcelovaní dochádza k segregácii. PKA vo vzťahu k zložkám v danej signálizačnej dráhe, čo prispieva k špecificite PKA pri odpovediach na rôzne e:·: tracelulárne stimuly. K rozparcelovaní PKA dochádza aspoň čiastočne prostredníctvom interakcie alebo obmedzenia podjednotky R špecifickými proteínmi, ktoré lokalizujú alebo zakotvujú inaktívny holoenzým na špecifických miestach vnútri bunky. Proteíny, ktoré špecificky segrequjú PKA, boli označené skratkou AKAP (tvorenou prvými písmenami anglického názvu A Kinase Anchor Proteins (proteíny zakotvujúce kinázu A)) (Hirsh et al., J. Biol. Chem., 267: 2131 až 2134 (1992)). „

Až doteraz bolo identifikované množstvo proteínov AKAP (pozri áalej uvedená diskusia), ktoré očividne viažu PKA prostredníctvom spoločného karboxyterminálneho sekundárneho štruktúrneho motívu, ktorý zahrnuje amfipatickú oblasť skrutkovice (Scott a McCartney, Mol. Endo., 8: 5 až 11 (1994)). Väzbu PKA k väčšine, ak nie ku všetkým identifikovaným proteínom AKAP, je možné blokovať za prítomnosti peptidu (Ht31), ktorý napodobuje spoločnú sekundárnu, skrutkovicovú štruktúru, zatial čo mutant peptidu Ht31 s obsahom jednej substitúcie aminokyseliny narušujúcej skrutkovicovú povahu peptidu, nemá žiadna účinok na. väzbu PKA k AKAP (Carr et al., J. Biol. Chem., 266: 14183 až 14192 (1991)). Napriek tomu, že sa interakcie PKA/AKAP zúčastňuje sekundárna štruktúra, vykazujú proteíny AKAP (alebo homológy proteínov AKAP obsiahnuté v rôznych druhoch) obvykle jedinečnú primárnu štruktúru, čoho dôkazom je rastúci počet proteínov AKAP, ktoré boli identifikované v rôznych organizmoch. Jedinečnú aminokyselinová štruktúra predovšetkým v aminoterminálnych oblastiach proteínov je čiastočne príčinou skutočnosti, že boli proteíny AKAP identifikované ako jedinečné proteíny v rôznych špecifických typoch buniek a v rôznych špecifických intracelulérnych oddieloch, v ktorých bolo rozmiestenie PKA pozorované.

Tak napríklad proteíny AKAP, ktoré sú prevažne exprimované v mozgu cicavcov, boli identifikované u hlodavcov (AKAP 150) a kráv (AKAP 75) [Bergman et al., J. Biol. Chem. 266: 7207 až 7213 (1991)3 a podobný proteín existuje aj u človeka (AKAP 79) [Carr et al., J. Biol. Chem. 267: 16816 až 16823 (1992)]. Totožnosť, pokiai ide o aminokyseliny a imunologická krížová reaktivita medzi týmito neurónovo špecifickými proteínmi ukazuje, že ide o homológy v rámci jedného druhu. Ako další príklad je možné uviesť AKAP 100, ktorý sa zdá byť špecifický pre srdcové a kostrové svaly človeka a potkana a súčasne je v nižšom rozsahu exprimovaný v mozgových bunkách týchto cicavcov. Ako ešte další príklad je možné uviesť proteín AKAP Ht31 (Carr et al., J. Biol. Chem. 267: 13376 až 13382 (1992)), ktorý sa javí ako špecifický pre tyroidné bunky. Naopak AKAP 95 sa exprimuje v množstve typov buniek a nevykazuje zrejmú špecifičnosť voči typu. tkaniva alebo buniek.

Pokiai ide o rozmiestenie do špecifických oddielov vnútri bunky, sú proteíny AKAP 75 a proteín asociovaný s mikrotubulamí (MAP-2) [Threurkauf a Vallee, J. Biol. Chem., 257: 3284 až 3290 (1982) a DeCamilli et al., J. Celí. Biol., 103: 189 až 203 (1986)3, AKAP 79 [Slantz et al., J. Biol. Chem. 268: 12796 až 12804 (1983)3 a AKAP 150 [Glantz et al., Mol. Biol. Celí, 3: 1215 až 1228 (1992)3 tesne asociované cytoskeletálnymi štruktúrnymi proteínmi, pričom AKAP 75 je špecifickejšie asociovaný s postsynaptickými hustotami [Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 16816 až 16823 (1992)3. Ešte dalšie proteíny AKAP sú rozmiestené v menej rozšírených bunkových štruktúrach; AKAP 350 je asociovaný s centrozúmami [Keryer et al., Exp. Celí Pes., 204: 230 až 240 (1993)3, AKAP 100 so sarkoplazmatickým retikulom v srdcovom tkanive potkana [McCartney et al., J. Biol. Chem. 270: 9327 až 9333 (1995)], 85kDa proteín AKAP spája F'KA s Golgiho aparátom [Rias et al., EMBO J., 11: 1723 až 1731 (1992)] a neoznačený proteín AKAP je asociovaný s membránovými vápnikovými kanálmi. Proteín AKAP 95 so zrejmou oblasťou viažúcou zinc finger DNA sa zdá byt výlučne obsiahnutý v jadre [Coghlan et al., J. Biol. Chem. 269: 7658 až 7665 (1994)]. Doména viažúca DNA v proteíne AKAP 95 má svoju úlohu pri priamom zapojení F'KA do transkripcie špecifického génu, možno prostredníctvom umiestenia F'KA vzhíadom na fosforylačný a transkripčný faktor. Iné rôzne bunkové aktivity, u ktorých bolo dokázané ovplyvnenie väzbou AKAP/PKA, boli dokázané narušením tejto interakcie, napríklad narušenie väzby F'KA/AKAPv T-bunkách vedie k reverzii cAMP-indukovaného potlačenia expresie interleukínu 2 [Lockerbie et al., J. Celí. Biochem. Suppl. 21A: 76, Abstrakt D2155 (1995)] a narušenie väzby PKA/AKAP v neurónoch hipokampu vedie k zoslabeniu prúdov v úplných bunkách prostredníctvom receptorov alfa-amino-3-hydroxy-5-mety 1-4-izoxazo1propiónová kyselina/kainát qlutamátu [Rosenmund et a.l . , pozri vyššie uvedená citácia]. Schopnosť proteínov AKAP reguloval expresiu IL-2 a reguloval aktivitu glutamátového receptora, v kombinácii so skorším zistením, že proteíny AKAP sú schopné viazať kalcineurín, vedie k. predpokladu množstva terapeutických aplikácií pre proteíny AKAP a molekuly modulujúce väzbu AKAP k bunkovým zložkám.

S ohíadom na rôznorodosť pokiaí ide o expresiu v rôznych typoch buniek, subcelulárnu lokalizáciu a fyziologické aktivity až doteraz identifikovaných proteínov AKAP, existuje teda v tomto obore potreba, pokračovať v identifikácii nových proteínov AKAP a nukleových kyselín, ktorými sú tieto proteíny kódované. Jedinečnosť primárnych štruktúr AKAP poskytuje ciel pre špecificky regulovanú lokalizáciu F'KA a tým jej funkciu v špecifických bunkových procesoch.

Podstata vynálezu

Jedným z aspektov tohto vynálezu sú protilátky, ktoré sú špecificky imu.noreaktívne s predtým neidentifikovanou molekulou AKAP. Ako príklad protilátky, ktorej sa v. súčasnosti dáva prednosí, je možné uviest monok 1 onálnu. protilátku vylučovanú hybridómom označeným 160C a uloženým v zbierke American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20859 USA 19. júla 1995 pod prírastkovým číslom HB 11955. Iné protilátky podľa vynálezu zahrnujú pol'/klonálne protilátky, rekombinantné protilátky a ich, väzbové fragmenty. Do rozsahu vynálezu patria tiež bunkové línie, napríklad hybridómy alebo bunkové línie transformované rekombinantnými expresnými konštruk. tmi , ktoré produkujú protilátky podľa vynálezu.

Ďa lš ím aspektom tohto vynálezu sú antigény, ktoré sú špecificky rozpoznávané protilátkami podľa vynálezu. Prednostný antigén je označený skratkou AKAP 120. Antigény rozpoznávané protilátkami podľa vynálezu môžu byt identifikované ktoroukoľvek z množstva imunologických techník, ktoré sú dobre známe v tomto obore. Imunošpecifické antigény je možné napríklad izolovať pomocou afinitnej chromatografie, pri ktorej sú protilátky podľa vynálezu konjuqované k imobi1 izovanej živici a antigén je odstraňovaný z konkrétnej tekutiny. Ako další príklad je možné uviest použitie protilátok podľa vynálezu pri imunoprecipitačných postupoch s cieľom špecifického odstránenia antigénu zo zmesi proteínov, po ktorom sa imu.noprecipi tovaný protein podrobí ďalšiemu deleniu použitím e 1ektroforézy. V súvislosti s protilátkami podľa vynálezu je čialej tiež možné použit postupy Western Blotting na identifikáciu špecificky imunoreaktívnych antigénov v zmesi proteínov.

Do rozsahu. tohto vynálezu patria äalej tiež polynukleotidy kódujúce antigény rozpoznávané protilátkami podľa. vynálezu. F'olynukleotidy podľa vynálezu zahrnujú DNA (genómovú, komplementárnu a syntetickú) a RNA. Do rozsahu vynálezu patria aj antikódujúce a kódujúce polynukleotidy, ktoré sú komplementárne ku kódujúcim a nekódujúcim polynukleotidom. F'olynukleotidy podľa vynálezu sa dajú identifikovať pomocou ktorejkoľvek z množstva techník, ktoré sú v tomto obore dobre známe. Ak je stanovená ά

aminokyselinová sekvencia imunošpecifického antigénu, je možné syntetizovať degenerované alebo nedegenerované oligonukleotidové próby pre hybridizáciu s klonom kódujúcim antigén v knižnici DNA sekvencii. Alternatívne je tiež možné použiť podobné alebo jedinečné oligonukleotidové sekvencie pri reťazovej reakcii katalyzovanej polymerázou (F'CR) pre amplifikáciu potenciálnych klonov kódujúcich antigén zo zmesi polynukleotidov. F'olynu.k 1 eotidy podía vynálezu zahrnujú DNA kódujúcu AKAP 120, ako aj polynukleotidy hybridizujúce pri stringentných podmienkach k DNA kódujúcej AKAF' 120. Označenie stringentné podmienky je pre odborníkov, ktorí dobre rozumejú podmienkam hybridizácie, dostatočne zrozumiteľné.

Užitočnosť tohto vynálezu je očividná. Protilátky podía vynálezu sú napríklad osobitne užitočné pre purifikáciu antigénu špecificky rozpoznávaného protilátkami, ktorá sa uskutočňuje vo veíkom. Okrem toho je možné identifikovať typy buniek exprimujúce antigény podía vynálezu. Protilátky podía vynálezu. sú tiež potenciálne užitočné ako modulátory väzbovej aktivity antigénov, ktoré sú špecificky rozpoznávané bu.ci prostrední ctvom kompetitívnej inhibície väzby blokujúcimi aminokyselinovými sekvenciami požadovanými pre interakciu proteín/proteín, alebo prostredníctvom indukcie konformačných zmien v antigéne majúcich za následok zrútenie alebo elimináciu sekundárnej štruktúry požadovanej pre väzbu proteínu.

Antigény, ktoré sú špecificky rozpoznávané protilátkami podía. vynálezu, sú užitočné pri množstve aplikácií. Tak napríklad je možné tieto antigény použiť pri vytváraní prídavných protilátok, ktoré môžu vykazovať modulačnú aktivitu. Tieto antigény tiež umožňujú, identifikáciu polynukleotidov, ktoré ich kódujú. Ďalej sú tieto antigény tiež užitočné pri screeningových postupoch, pomocou ktorých môžu. byť identifikované modulátory väzby antigénu k iným bunkovým zložkám, napríklad iným bunkovým proteínom alebo bunkovým organelám. Takto identifikované modulátory sa môžu potenciálne použiť na reguláciu ktorejkoľvek z mnohých bunkových aktivít, ktorých sa zúčastňujú antigény alebo ich väzboví partneri.

F'ol ynuk leotidy podía vynálezu sú osobitne užitočné pre rekombinantnú produkciu antigénov, ktoré kódujú. Rekombinantná expresia umožňuje produkciu antigénov, ktorých užitočnosť bola uvedená, vyššia, vo veíkom. Tieto polynukleotidy sú tiež užitočné pre screening, napríklad s tým, . že sa použije dihybridová technológia, zameranie na gény, ktoré sú v interakcii s kódovaným antigénom. Modulátory väzby antigénu môžu byť tiež identifikované pomocou metód screeningu, napríklad pomocou trihybridových techník použitím polynuk.leotidov podía vynálezu zameraných na identifikáciu génov kódujúcich proteíny modulujúce väzbu antigénu. Modulátory väzby AKAF' sú osobitne užitočné v množstve aplikácií. Tak napríklad pokial ide o malé molekuly, môže byť zistená schopnosť inhibovať bu.d väzbu F’KA/AKAF' alebo interakciu AKAF’ so špecifickými bunkovými zložkami. Zlúčeniny tohto typu budú delokal izovať špecifické zhromaždiská F'KA a ovplyvňovať len cieíovú signalizačnú dráhu. Identifikácia, modulátora väzby AKAF' k iným bunkovým zložkám môže byť rovnako užitočná. Tak napríklad faktory ovplyvňujúce aktivitu k a. 1 cineur í nu podobným spôsobom, ako to robia nedávno identifikované imunosupresanty, ale s menšími vedíajšími účinkami, môžu byť užitočné pri liečení chorôb, v súčasnosti liečených toxickejšími imunosupresantmi. Okrem toho, identifikácia faktorov modulu.j úcich účasť AKAF' na bunkových aktivitách môže byť tiež užitočná pri nahradzovaní v súčasnosti akceptovaných terapeutických zásahov. Tak napríklad faktory, ktoré regulujú reguláciu expresie IL-2 prostrední ctvom AKAF', môžu byť užitočné ako náhrada podávania exogénneho rekombinantného IL-2.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. Tieto príklady majú výlučne i 1 u.stratí vny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohíade neobmedzujú. V príklade 1 je popísané vytváranie protilátok imunoreaktívnych proti proteínom AKAF' v T-bunkách. Príklad 2 sa týka analýzy proteínov rozpoznávaných týmito protilátkami pri použití metódy Western blot. Príklad 3 popisuje afinitnú purifikáciu proteínu AKAF’ z a

T-buniek. rozpoznávaného vyššie uvedenými protilátkami. Príklad 4 popisuje terapeutické aplikácie proteínov AKAP a zlúčenín modulujúcich väzbu AKAP.

Príklady realizácie vynálezu

Príklad i

Produkcia anti-AKAP protilátok

A. F'olyklonálne antiséra

Polyklonálne sérum sa vytvorí v myšiach očkovaných rekombinantným proteínom AKAP 79 podía protokolu, ktorý sa dá stručne popísať takto:

Myši Balb/c s vekom ó až S týždňov sa najprv očkujú vždy 50 zU.g rekombinantného proteínu AKAP 79 vo Freundovom ú.plnom adjuvans. Imunogén AKAP 79 bol exprimovaný v E. coli ako fuzionovaný proteín s polyhistidíriovým chvostom [Carr et al., J. Biol. Chem. 2óô: 14188 až 14192 (1991)]. Očkovanie sa uskutočňuje štyrikrát za sebou s intervalom dvoch až troch týždňov, vždy pri použití 50 _zu.g AKAP 79 vo Freundovom neúplnom adjuvans. Polyklonálne sérum sa získa po poslednom očkovaní a skúškou ELISA sa potvrdí, že rozoznáva AKAP 79.

B. Monoklonálne protilátky

Monoklonálne protilátky sa vytvoria podía očkovacieho protokolu, ktorý je popísaný pre vytvorenie polyklonálneho séra. Po poslednom očkovaní sa myšiam vyberie slezina a pomocou čialej uvedeného spôsobu sa uskutoční fúzia.

Suspenzia jednotlivých buniek sa vytvorí rozmeíovaním sleziny medzi matovanými stranami dvoch podložných sklíčok mikroskopu ponorených do média RPMI (bez séra) doplneného L-glutamínom (2mM), pyrohroznanom sodným (lmM), penicilínom (100 jednotiek/ml) a streptomycínom (100 mg/ml, Gibco, Kanada). Bunková suspenzia sa prefiltruje cez sterilné zariadenie na filtráciu buniek s pórmi s priemerom 212 _zum (70 - mesh Nirex Celí Strainer, Becton, Dickinson, F'arssipany, New Jersey, USA) a bunky sa dvakrát premyjú päťminútovou centrifugáciou pri 200 x g a potom sa resuspendujú v 20 ml média RF'MI. Podobným spôsobom sa pripravia tymócyty odobrané trom neošetreným myšiam Balb/c.

Bunky myelómu NS-i sa uchovávajú sa uchovávajú v logaritmickej fáze v médiu RMF'I doplnenom 10 7. fetálneho séra (FBS, HyClone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA) 3 dni pred fúziou. Tesne pred fúziou s bunky 5 minút odstrekujú pri 200 x g a výsledná peleta sa dvakrát premyje vyššie uvedeným spôsobom. F'o premytí sa objem bunkovej suspenzie upraví RF'MI bez séra na 10 ml a 10 _zul vzniknutého prípravku sa zriedi v pomere 1:100.

Približne 20 _zul každého zriedeného prípravku sa zmieša s 20 _zul 0,47. trypánovej modrej v 0,85X roztoku chloridu sodného (Gibco). Zmes sa prevedie do hematocytometra (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, USA) a spočítajú sa životaschopné bunky.

Približne 1,7 x 10® slezinných buniek. sa zmieša s 3,4 x 10⁷ buniek NS-1, zmes sa odstredí a vzniknutý supernatant sa zahodí. Bunková peleta sa rozptýli oťukaním skúmavky, počas 1 minúty sa k nej pridajú 2 ml F'EG 1500 s teplotou 37 °C (507. roztok v 75mM HEF'ES s pH 8,0) (Boehringer Mannheim) a potom sa počas 7 minút pridá 14 ml RF'MI neobsahujúceho sérum. Ďalej sa pridá 16 ml RF'MI a bunky sa 2 minúty odstrekujú pri 200 x g. Supernatant sa zahodí a bunková peleta sa resuspenduj e v 200 ml RF'MI s obsahom FBS (15Z), hypoxantínu sodného (100mM), aminopterínu (0,4mM), tymidínu (HAT) (Gibco) (16mM), IL-6 (Mal 1inckrodt) (25 j ednotiek/ml) a tymocytov (1,5 x 10·^ ml“¹). Suspenzia sa 4 hodiny inku.buje pri 37 C a potom sa umiesti do 10 96~jamkových misiek pre tkanivové kultúry s plochým dnom (Corning, Veíká Británia) pri objeme 200 _zul/jamka. Tretí, štvrtý a šiesty dert sa pomocou odsania odstráni vždy približne polovica média z každej jamky pri použití ihly 18 G (Becton Dickinson) a doplní sa čerstvé vyššie popísané médium, ktoré však obsahuje IL-6 (10 jednotiek/ml) a ktoré neobsahuje tymocyty.

Screening na fúziu 160 sa uskutoční, keä rast buniek dosiahne 60 až 807 konfluenciu (8 až 10 dní po fúziu) pomocou metódy ELISA. štyri misky Immulon (Dynatech, Cambridge, MA, USA) sa potiahnu pri 4 °C cez noc úplnou nekonjugovanou kozacou protimyšacou molekulou (Cappel) zriedenou v pomere 1:5000 50mM uhličitahovým pufrom s pH 9,6. Misky sa trikrát opláchnu FBS s obsahom 0,05 7. namáčadla Tween 20 (F'BST) a potom sa pridá 50 ml supernatantu kultúry. Nasleduje 30 minútová inkubácia pri 30 °C, po ktorej sa misky pomocou. vyššie uvedeného spôsobu opláchnu a pridá sa k nim 50 ml kozieho protimyšacieho IgS(fc) konjugovaného s chrenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Growe, F‘A, USA). Misky sa zakryjú páskou, inkubujú sa pomocou vyššie uvedeného spôsobu a trikrát sa premyjú. F'BST. F'o tretom premytí sa pridá 100 _xul substrátu obsahujúceho o-fenyléndiamín (Sigma) s koncentráciou 1 mg/ml a 307 peroxid vodíka (0,1 ml/ml) v 100mM citrétovom pu.fri s pH 4,5. Farebná reakcia sa po 6 minútach zastaví prídavkom 50_xul 157. kyseliny sírovej. Absorbancia pri 490 nm sa meria na čítacom zariadení pre misky (Dynatech) a jamky vykazujúce reaktivitu sa áalej skúšajú na reaktivitu dot blot na AKAP 79. Dve jamky (označenie 160Ca 160K) sa klonujú dvakrát alebo trikrát po sebe tak, že sa zdvojnásobí zriedenie v PF’MI s fetálnym hovädzím sérom (FBS) (157), sodnou soíou hypoxantínu (10mM), tymidínom (lómM) a IL.-6 (10 jednotiek/ml). Jednotlivé jamky sa hodnotia vizuálne po 4 dŕioch a zaznamená a počet kolónií v jamkách s nižšou hustotou. Zvolené jamky z každého klonovania sa skúšajú na reaktivitu s AKAF' 79 použitím skúšky ELISA a analýzy dot blot, ako to bolo popísané vyššie. F'ri poslednom klonovaní sa pozitívne jamky obsahujúce jednotlivé kolónie expandu.jú v RF'MI s 107 FBS. Monoklonálne protilátky z klonovaných bunkových línií sa izotypu.jú použitím kitu na izotypovanie Isostrip (Boehringer Mannheim) podía doporučeného protokolu výrobcu.

Dve monoklonálne protilátky označené 160C a 160K boli identifikované ako imunoreaktívne s AKAP 79, pričom bol u nich zistený izotyp IgGl.

Príklad

Western Blotting

S cieíom stanovenia distribúcie antigénu polyklonálnym sérom a monoklonálnymi identifikovanými v príklade 1 sa uskutoční Blotting použitím proteínového extraktu z buniek rozpoznávaného proti látkami skúška Western rôzneho typu.

Úplný bunkový extrakt z každého použitého typu buniek, uvedeného áalej sa pripraví pomocou varenia a ultrazvukového spracovania bunkových peliet v 160mM Tris HC1 s pH 6,8 s prísadou SDS (47) a DTT (200mM). Bloty Western sa pripravia podía štadnardného protokolu (Toubin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350 až 4354 (1779)) zahrnujúceho elektroforézu 5Θ až 100 /U.g z bunkového extraktu na 107. géle SDS-page, prenos proteínu na nitrocelulózovú membránu a blokovanie 57. odtučneným sušeným mliekom v roztoku chloridu sodného pufrovanom Tris (TBS) s obsahom BSA (0,1’Z).’ Po blokova.com stupni s membrány inkubujú v TBS s obsahom BSA (5 7.) s primárnou a sekundárnou protilátkou. Sekundárna protilátka je konjugát kozieho protimyšacieho IoG s chrenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim). Bola pozorovaná detekcia imunoreaktívnych proteínových pásov so zvýšenou chemi 1 u.min iscen ciou (ECL).

V extrakte z Jurkatových buniek myšacie polyklonálne sérum špecificky rozpoznáva 79k.D protein okrem proteínu s veík.ostou asi 120 kD. V iných bunkových extraktoch rozpoznáva polyklonálne sérum 79k.D protein v bunkovej línii obličkového epitelu človeka (HEK 293) a mozgu človeka, ako aj známe homológy druhu AKAP 79 a AKAP 75 z hovädzieho mozgu a AKAP 150 z myšacieho mozgu.

Monoklonálna protilátka. 160C rozpoznáva ako 120kD protein v Jurkatových extraktoch, tak aj AKAP 79 z mozgu človeka, ale nedeteguje 120k.D protein v úplných extraktoch neutrofilov človeka, promyelocytových bunkách HL60, bunkách Ramos (B), endotelových bunkách HUVETS, fibroblastových bunkách COS alebo epitelových bunkách T84. Protilátka 160K však rozpoznáva len izoformu AKAF' 79 v mozgu.

V člalších experimentoch sa ukázalo, že 79kD proteín (ako aj 120k.D proteín) viaže Rllalfa pri použití techník s prekrývaním pomocou Rllalfa a pravdepodobne teda ide o variantu AKAP 79 z mozgu človeka v Jurkatových T-bunkách.

P r í k 1 a d 3

Afinitná purifikácia AKAP 120

S ohíadom na skutočnosť, že monoklonálna protilátka 160C je schopná rozpoznať 120kD proteín v Jurkatových bunkách, boli urobené pokusy s purifikáciou 120kD proteínu s cieíom stanovenia jeho vzťahu k AKAP 79.

A. Chromatografia na cANF'-Sepharosé

Napestu.je sa približne 1 x 10^ Jurkatových rotačných bankách obsahujúcich úplné médium RF’MI . peletizujú, trikrát premyjú roztokom chloridu sodného pufrovaného f osf orečnanom a neobsahujúceho vápnik a horčík (CľlF-F'BS) a podrobia sa lýze v 10 objemoch (vztiahnuté na hmotnosť vlhkej bunkovej pelety) pufra A (Tris HCL s pH 7,4 - 20mM); chlorid horečnatý - l,5mľt; DTT - ImM; chlorid sodný - 0,2ľl; NP-40 - 0,17. a koktej1 inhibítora proteázy) 60 minút pri 4 °C. Lyzát sa 30 minút odstrekuje pri 40 000 x g a výsledný supernatant sa nanesie na 5 ml cAMF'-Sepharose (Sigma), ktorá bola predbežne ekvi1ibrovaná v pufri A. Zmes sa inkubuje 2 hodiny pri 4 °C a potom sa prenesie na 10ml stĺpec BICRAD na jedno použitie a uskutoční sa elúcia 10 objemami pufra A (bez NP-40). Živica sa rozdelí na dva rovnaké diely. Jedna polovica živice sa inkubuje s tromi objemami stĺpca 0,5mM peptidu Ht31 v pufri A (bez NP-40) a druhá polovica sa inkubuje s tromi objemami stĺpca 75mM cAMF' v buniek v ^unky sa pufri A (bez NP-40). Každá inkubácia sa uskutočňuje 60 minút pri teplote miestnosti a potom sa suspenzia prenesie na 10ml stĺpec na jedno použitie a zhromaždí sa eluát. Proteín v eluáte sa skoncentruje viac ako desaťkrát použitím stĺpcov CENTRIPF'REP 10 (Amicon) a potom sa uskutoční analýza Western Blot.

120k.D proteín sa špecificky elúuje z cAMP-Sepharose ako peptidom Ht31 s amfipatickou skrutkovicou., tak aj cANP, čo potvrdzuje, že proteín je izoforma AKAP a že je proteín schopný viazať regulačnú podjednotku typu II (RII) z PKA.

B. Chromatografia na Calmodulin-Agarose

Pomocou vyššie uvedeného spôsobu sa pripravia a spracujú bunkové lyzáty, len s tým rozdielom, že sa supernatant nanesie na živicu Calmodulin-Agarose (Sigma), ktorá bola dopredu ekvi 1ibrovaná v pufri A (popísanom vyššie) s prísadou chloridu vápenatého (0,5mlj) a bez NP-40. Po prenesení na stĺpec na jednorazové použitie sa živica premyje rovnakým pufrom a proteín sa s živicou elúuje pufrom A s obsahom ESTA (2mM), ale bez chloridu vápenatého alebo NP-40.

120kD proteín sa špecificky elúuje z Calmodul in-Agarose, pravdepodobne búd vďaka priamej väzbe na kalmodulín a/alebo nepriamej väzbe na kalmodulín sprostredkovanej asociáciou s komplexom iných proteínov viažúcich sa na kalmodulín, ako je napríklad kalcineurín.

klad

Terapeutické aplikácie

Predchádzajúce zistenie, že AKAP 79 viaže kalcineu.rín, je relevantné ohíadom na skutočnosť, že kalcinuerín je ciel om dvoch silných a a FK506, ktoré klinicky užitočných imunosupresív, cyklosporínu obidva inhibujú aktivitu kalcineurínu. Ako je popísané äalej, ako cyklosporín, tak aj FK506 sú užitočné pri liečení rôznych chorôb, ale vykazujú významné obmedzujúce vedíajšie účinky. Predpokladá sa, že faktory.modulujúce väzbu AKAP/kalcineurín môžu v konečnom dôsledku modulovaí následnú signalizáciu v tejto dráhe, ale možno s vyššie špecificitou voči typu buniek, ako je špecificita pozorovaná u cyklosporínu alebo FK506. Identifikácia takéhoto modulátora, predovšetkým modulátora s menším rozsahom vedlajších účinkov, ako je rozsah pozorovaný u iných imunosupresív, by pravdepodobne mala široké terapeutické využitie pri liečení množstva chorôb, ktoré sú v súčasnosti liečené cyklosporínom alebo FK-506.

Boli oznámené mnohé klinické indikácie cyklosporínu a FK-506. Tak napríklad cyklosporín predstavuje štandard pre potláčanie imunity po transplantáciách, pričom umožňuje realizáciu transplantácie pečene, píúc, čriev a podžalúdkovej žíazy, napriek tomu, že sa FK506 všeobecne považuje za silnejšie imunosupresívum. Pacienti, ktorí boli podrobení transplantácii, ktorí netolerujú alebo nerešpodnujú na cyklosporín alebo FK506, sú niekedy úspešne prevedení na iné liečivo.

Ako další príklad je možné uviesí zápalovú chorobu čriev (IBD), čo je obvyklý termín pre dve choroby majúce rôzne klinické prejavy, t j . Crohnovu chorobu a vredovú kolitídu (UC) . Cyklosporín bol úspešne použitý pri liečení Crohnovej choroby, pričom štatisticky významné výsledky liečenia sa prejavili prinajmenšom pri jednom z indexov aktivity choroby [Brynskow, Dan. Med. Bull. 41: 332 až 344(1994)]. Iné indexy, ktoré najlepšie korelujú s rezolúciou akútnych exacerbácií, však vykázali len nevýznamnú tendenciu k. zlepšeniu. Cyklosporín vykázal tiež účinnost pri prudkej akútnej vredovej kolitíde rezistentnej voči steroidom (dáta nie sú štatisticky významné, kedže bolo nutné skúšku ukončit z etických dôvodov). Ďalšia skúška na pacientoch so sklerotizujúcou cholangitídou a vredovou kolitídou ukázala okrajovú štatistickú významnost smerom k miernejšiemu priebehu vredovej kolitídy. Po vysadení liečenia došlo obvykle k recidíve a liečenie bolo obmedzené s ohladom na toxicitu (Choi a. Targan, Dig. Dis. and Sci. 39:

1885 až 1892 (1984)). Okrem toho sa imunosupresívum, ako je methotrexate, azathioprine a 6-ΙΊΡ, úspešne používalo pri liečení IBD.

Ako äalší príklad sa dá uviesť účinnosť cyklosporínu pri liečení reu.matoidnej artritídy (RA). Pri niekoľkých pokusoch, kedy bola táto látka použitá ako liečivo druhej alebo tretej voľby, tj, pre pacientov, ktorí nerespondovali na iné zavedené terapie a pritom boli postihnutý prudkou chorobou. Pri týchto pokusoch sa zistilo, že cyklosporín je všeobecne rovnako účinný a rovnako toxický ako iné činidlá druhej voľby, ako je napríklad zlato, antimalarické prostriedky a azathioprine, D-penici1lamine a methotrexate. [Wells a Tguwell, Br. J. Rheurn., 32 (suppl. 1): 51 až 56 (1993); Fcrre et al., Arth. Rheurn., 30: 88 až 92 (1987)j. Tieto pokusy uvádzajú len liečenie veľmi prudkej aktívnej RA, pri ktorej je liečenie neúčinné s ohľadom na skutočnosť, že cyklosporín vykazuje potenciálne nezvratnú toxicitu [Dougados a Torley, Br. J. Rheurn. 32 (suppl. 1): 57 až 59 (1993)]. Renálna toxicita je pravdepodobne prevažne sprostredkované renálnou vazokonstrikciou, ktorá vyvoláva exacerbáciú nefrotoxicity nesteroidných protizápalových liečiv (NSAID) a obličkovou chorobou, ktorá je inherentnou súčasťou reu.matoidnej artritídy [Leaker a Cairns, Br. J. Hosp. kled,, 52: 520 až 534 (1994); Sturrock et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1149 až 1156 (1994); Ludwin a Alexopo1u1ou, Br. J. Rheurn., 32 (suppl. 1) ň ó 3 až 64 (1993)]. Pri asi 10 7. biopsií u. pacientov postihnutých reumatoidnou artritídou, ktorí boli liečení cyklosporínom, boli zistené morfologické znaky toxicity cyklosporínu [International Kidney Biopsy Registry of Cyclosporin in Autoimmune Diseases, Br. J. Rheurn., 32 (suppl. 1): 65 až 71 (1993)],

Ako ešte äalší príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu pri liečení astmy dependentnej od steroidov. Pri jednom pokuse bol malý počet pacientov náhodným spôsobom rozdelený do skupín, ktoré dostávali bu.d cyklosporín alebo placebo. Cyklosporínová skupina vykazovala zvýšený prietok vzduchu a FVC, ako aj menší počet prípadov záchrany prednizolonom.

Ako další príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu pri liečení neurotického syndrómu dependentného od steroidov. Ukázalo sa, že pacienti, ktorým bola podávaná nízka dávka cyklosporínu, mali znížené požiadavky na steroid, ale po vysadení cyklosporínu došlo k návratu na pôvodný stav. Formy nefrotického syndrómu rezistentného voči steroidom vykazujú odpoved na cyklosporín len v 20 až 30 ý. prípadov [Meyrier, Nephrol. Dial. Transplant, 7. 576 až 578 (1774); Hulton et al . , F’ediatr. Nephrol. 8; 401 až 403 (1774)3.

F'okiai ide o liečenie systemického lupus erythematosus (SLE), jedna štúdia ukázala štatisticky významný pokles indexov aktivity SLE pri prospektívnej nerandomizovanej neriadenej štúdii CTokuda et al., Arthr. Rheumat., 37: 551 až 558 (1774)]. Iné štúdie však účinnosť pri SLE nepotvrdili.

Ako další príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu indukovať remisiu inzu.1 ín-dependentnej diabetes mellitus, ak bol cyklosporín zavedený včas po začiatočných prejavoch. Remisie trvali v priemere asi jeden rok, napriek tomu, že v niektorých prípadoch boli aj dlhšie - 85B dní [Jenner et al., Diabetológia, 35: 884 až 888 (1772); Bouqneres et al., Diabetes, 37; 1264 až 1272 (1778)]. Žiadny dlhodobejší účinok cyklosporínu nebol zaznamenaný pri nasledujúcom rozšírení jednej štúdie [Martin et al., Diabetológia., 34: 427 až 434 (1771)]. F‘ri inej štúdii však došlo počas 12 až 18 mesiacov liečenia k zhoršeniu funkcie obličiek, pričom funkcia obličiek sa úplne nevrátila na úroveň dosiahnutú pri podávaní placeba, čo ukazuje, že zrejme došlo k určitému chronickému poškodeniu obličiek [Feltd-Rasmussen et al., Diabetes Medicíne, 7: 427 až 433 (1770)]. Aby sa zvýšil účinok imunosupresívneho liečenia počas inzulín-dependentného diabetes mellitus, bola by potrebná skoršia intervencia. Niektorí výskumníci skúšali profy laktické liečenie znakov diabetes u príbuzných pacientov z prvého kolena [Elliot and Chase, Diabetológia, 34: 362 až 365 (1771)].

Ako áalší príklad je možné uviesí účinné liečenie lupienky C'/klosporínom [Cuellar et al., Balliere's Clin. Rheum., 8: 483 až 498 (1994); Ellis et al.. JAMA 265: 3110 až 3116 (1986)]. Vysokodávková terapia bola účinná pri liečení psoriatickej artritídy, čo je osobitne prudká forma deštruktívnej artritídy. F'ri prerušení liečenia bola obvykle pozorovaná exacerbácia choroby kože a kĺbov. S ohíadom na potenciálne vedíajšie účinky a potrebu priebežnej dlhodobej liečby je cyklosporín indikovaný len v prípadoch psoriatickej artritídy, na ktorú nezaberajú iné spôsoby liečby.

Okrem toho bola demonštrovaná účinnosť. liečenia prudkej atopickej dermatitídy cyklosporínom pri štúdiách kontrolovaných placebom a dvoma slepými pokusmi [Van Joost et al . , Br. J. Derm., 130: 634 až 640 (1994); Cooper, J. Invest. Derm,,, 102: 128 až 137 (1994)]. Pacienti pri tejto štúdii dávali prednosť vedíajším účinkom liečenia zahrnujúcim nauzeu, abdominálny diskomfort, parestézie, chlestasis a obličkovú nedostatočnosť pred neliečenou chorobou. F’ri inej randomizovanej kontrolovanej aplikáciou pláceba. a. slepými pokusmi sa ukázalo, že podávaním,, cyk losporínu sa významne zvýšila kvalita života pacientov postihnutých prudkou atopickou dermatitídou [Salek et al.. Br. J. Derm., 129: 422 až 430 (1993)]. F'o prerušení liečby cyk losporínom došlo k rýchlej recidíve kožných lézií, ale kvalita života zostala zlepšená.

Cyklosporín bol dalej použitý pri liečení chronickej dermatitídy rúk, čo je choroba u ktorej bola konštatovaná prevalencia 4 až 22 7, ktorá sa obvykle lieči typickými steroidmi, ktoré však u mnohých pacientov nezaberajú. Nízke dávky cyklosporínu sa ukázali byť ako účinné pri otvorenej štúdii pre ó zo 7 liečených pacientov [Reitamo a Granlund, Br. J. Derm., 130: 75 až 78- (1994)]. F'o prerušení podávania cyklosporínu došlo k recidíve približne u polovice pacientov.

Ďalej bol tiež cyklosporín použitý na liečenie urtikárie a angioedému., čo sú idiopatické kožné choroby, ktoré sa prejavujú ako žihlavka a podkožné opuchy. Patológia týchto chorôb má vzťah k žírnym bunkám a ich liečenie je často neúčinné. Pri jednej štúdii boli traja pacienti postihnutý týmito chorobami nerespondujúci na iné liečenie liečení cyklosporínom a všetky symptómy u nich vymizli počas jedného týždňa [Fradin et al., J. Am. Acad. Derm., 25: 1065 až 1067 (1991)3. U všetkých pacientov muselo byť liečenie ukončené s ohľadom na vedľajšie účinky a po prerušení liečenia došlo k recidíve symptómov.

Pokiaľ ide o iné reumatologické choroby, uvádzajú štúdie účinné liečenie cyklosporínom aj pri áalších menej častých autoimunitných chorôb, ako je napríklad Behcetova choroba [F'acor et al., Clin. Rheum., 13: 224 až 227 (1994)3, Wegnerova granulomatóza [Alien et al., Cyclosporin A Therapy for Wegner's Granulomatosis in ANCA-Associated Vasculitides, Immunological and Clinical Aspects, Gross ed. Plénum Press (1993)3 a imunitné mediovaná trombocytopénia [Schultz et al. , Blood 85: 1406 a.ž 1409 (1995)3.

F'ri mnohých vyššie popísaných štúdiách bolo použitie cyklosporínu alebo FK506 spojené s mnohými nežiadúcimi -vedľajšími účinkami. Obvykle platí, že všeobecné potlačenie imunity vedie k zvýšenému ohrozeniu infekciami a malignanciami a je nepravdepodobné, že imunosupresíva príbuzné AKAP by nezahrnovali podobné riziká. Iným vedľajším účinkom je však možné sa vyhnúť, alebo je možné je znížiť tkanivovou špecificitou AKAP.

Najbežnejším vedľajším účinkom cyklosporínu aj

FK 506 je nefrotoxicita, ktorá je prinajmenšom do určitej miery závislá od podanej dávky a vyskytuje sa u väčšiny pacientov, obvykle v podobe poklesu rýchlosti glomerulárnej filtrácie počas liečenia. Tento vedľajší účinok je však aspoň čiastočne vratný po prerušení podávania liečiva [Leaker and Cairns, pozri vyššie uvedená citácia.3. Obvykle sa. nevyvinie progresívna obličková insuficiencia, napriek tomu, že aby bolo možné uskutočniť.

by .potrebné uskutočniť äalšie bolo pozorované aj u pacientov, ktorým bol podávaný cyklosporín v nízkych dávkach (3 až 4 mq/kg/deň). Pri biopsii boli u 40 7. z týchto pacientov pozorované definitívne zhodnotenie, bolo štúdie. Chronické poškodenie smený zahrnujúce intersticiálnu fibrózu, tubulárnu atrofiu a arteriolopatiu [Svarstad et al . , Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1462 až 1467 (1994); Young et al . , Kidney Internationa1, 46: 1216 až 1222 (1994)]. Zmeny“ endotelových buniek boli tiež zrejmé na histologických rezoch [Kahan, N. Engl. J. Med., 321: 1725 až 174Θ (1939)]. Boli uskutočnený predpoklad, že sa nefrotoxicita dostavuje predovšetkým v dôsledku arteriolárnej vazokonstrikcie a chronickej miernej ischémie [Leaker a Carins, pozri vyššie uvedená citácia], napriek tomu, že sú tieto liečivá tiež priamo toxické voči tubulárnym bunkám a vaskulárnym intersticiálnym bunkám [Platz et al . , Transplantation, 58: 170 až 178 (1994)]. Niektoré správy ukazujú, že výskyt a prudkosť nefrotoxicity môžu byť o niečo pri FK506 tF'latz et al . , vyššie uvedená citácia.

Iná významná toxicita ako cyklosporínu, tak aj FK 506, je neurotoxicita, ktorá sa klinicky prejavuje záchvatmi, konfúziou, slepotou, kómou, bolesťami hlavy, ataxiou, Parkinsonovým syndrómom, parestéziami, psychózou, fekálnymi deficitmi, akinetickým· mutizmom, trasením, neuropatiou a poruchami spánku [Shimizuet al., Pedia.tr. Nephrol . , . 8: 483 .až 335,- (19.94) ; Wi Ison et al., Muscle and Nerve, 17: 528 až

Bone ľlarrow Transpl. 8: 393 až 401

532 (Í994; Reece et al., (1991); Eidelman et al..

T ransp1

Proc., 23: 3175 až 3178 (1991); de Groen et al.. N,

Engl. J. Med., 317: 861 až 566 (1987)] bola mierna až prudká neurotoxicita. pacientov liečených FK 506 a 3 až cyk 1osporínom. Neurotoxicita bola tiež

Po transplantácii pečene pozorovaná u 10 až 20 7.

7. pacientov liečených spájaná s abnormalitami v obsahu lipidov v sére a s dysfunkciou pečene.

Z iných vedľajších účinkov cyklosporínu a/alebo FK506 je možné uviesť hepatotoxicitu, glukózovú intoleranciu, hypertenziu., hirsutizmus, gastrointestinálne symptómy, žilnú trombózu, pankreati tídu a hyperpláziu. áasien [Morris J. Heart Lung Transplant. 12: 8275 až 8286 (1993); Fung et al., Transpl. F'roc. , 23: 3105 až 3108 (1991); Mason Pharmacol. Rev., 42: 423 až 434 (1989); Kahan, N. Engl. J. Med. 321: 1725 až 1738 (1989); Thomason et al., Renal Failu.re, 16: 731 až 745 (1994)]. S ohľadom na široké využitie cyklosporínu vedíajéie účinky ich aplikácie by imunosupresív výnimočne prospešné.

a FK 506 a na inherentné bolo vyvinutie a 1ternatívnych

Tak napríklad je možné, že delokal ižá'cia kalcineurínu z predpokladaného AKAP T-buniek, by mohla inhibovať aktivitu kalcineurínu pri aktivácii T-buniek. Tak by bolo možné získať imunosupresívum špecifické voči T-bunkám, ktoré by vykazovalo užitočnosť cyklosporínu alebo FK 506, ale menej vedlajších účinkov. Nedávne pozorovanie.

ze delokalizácia PKA

AKAP

T-buniek zvyšuje expresiu IL-2'v stimulovaných bunkách ukazuje, že PKA lokalizovaná v AKAP určitým spôsobom prispieva k regulačnej úlohe pri expresii IL-2 počas aktivácie T-buniek. Delokalizácia PKA špecifická vzhladom na T-bunky môže preto predstavovať prostriedok na zvýšenie sekrécie IL-2 in vivo, ktoré účinok je porovnateíný s podávaním rekombinantného IL-2. Možno by bolo možné takto dosiahnuť zníženie toxicity liečenia pomocou IL-2, ako je to uvedené äalej.

IL-2 bol schválený pre liečenie metastatického renálneho karcinómu a približne 15 ž 20 X pacientov s metastatickým renálnym karcinómom alebo malígnym melanómom je respondentných voči liečeniu IL-2. Niektoré z týchto odpovedi sú trvalé a prejavujú, sa dlhšie ako 66 mesiacov [Dillman, Cancer Biotherapy, 9: 1S3 až 209 (1994); Whittinqton a Fau.lds, Druqs 46: 446 až 514 (1993)]. Liečenie vysokými dávkami (bolus) bolo síce spojené s niekoíkými prudkými vedlajšími účinkami (pozri äalej). Subkutánne podávanie alebo liečenie pomocou kontinuálnej infúzie poskytlo nízky stupeň odpovede (12 X) pri súčasnom znížení toxicity CVogelzang et al., J. Clin. Oncol., 11: 1809 až 1816 (1993)].

Liečenie pomocou IL-2 (so súčasným podávaním interferónu alfa alebo iných činidiel alebo bez neho) bolo skúšané aj pri liečení iných mal ignancií. Tak napríklad pri priamej aplikáciiIL-2 do nádorového lôžka po resekcii gliómu viedlo k predĺženej klinickej odpovedi, ale nie k. vyliečeniu CMerchant et al., J. Neuro., 8: 173 až 183 (1990)]. Pri äalších skúškach bola oznámená obmedzená účinnosť pokiaľ ide o lymfóm [Dillman, pozri vyššie uvedená citácia], kolorektálny karcinóm [Whittington a Faulds, pozri vyššie uvedená citácia], obmedzený AML [Bruton a Koeller, F'harmacotherapy, 14: 635 až 656 (1994)], rakovinu vaječníkov a skorú rakovinu močového mechúra [Whittington a Faulds, pozri vyššie uvedená citácia]. Počet účastníkov každej z týchto štúdií bol však príliš malý na to, aby to umožnilo zistiť štatistickú významnosť pozorovanej účinnosti.

IL-2 bol tiež používaný v imunoterapiou a bolo ukázané, že kombinácii s adoptívnou je účinný pri liečení metastatického renálneho karcinómu [F'ierce et al . , Sem. Oncol., 22: 74 až 80 (1995)]; Belldegrun et al., J. Urol., 150: 1384 až 1390 (1993)]. Okrem toho môž byť IL-2 tiež účinný pri liečení určitých infekčných chorôb prostredníctvom zníženia bakteriálneho zaťaženia kože a hladiny antigénu pacientov s leprózou po intradermálnej injekcii [Kaplan, J. Infect. Dis., 167 (supll. 1): S18 až 22 (1993]. Tiež bolo pozorované, že lymfocyty od pacientov postihnutých tuberkulózou produkujú nižšiu hladinu IL-2 v porovnaní s lymfocytmi PPD-pozitívnych zdravých kontrolných jedincov [Sanchez et al., Inf. Immun., 62: 5673 až 5678 (1994)], čo ukazuje, že liečenie IL-2 môže mať zmysel pri liečbe mykobakteriálnych infekcií.

Napriek potenciálnej terapeutickej hodnote IL-2 je tento cytokín tiež spojený s významnou toxicitou [ak nie je uvedené niečo iné, sú zdrojom týchto informácií vyššie uvedené citácie Whittington a Faulds, Dillman a Bruton a Koeller). Hlavný vedľajší účinok obmedzujúci takéto liečenie je syndróm kapilárneho krvácania. Podávanie IL-2 zvyšuje vaskulárnu permeabi1 i tu, čo vyvoláva intersticiálny a pľúcny edém, pričom sa u pacientov vyvíja hypotenzia a. značný počet z nich vyžaduje presory. Intenzívna resuscitácia kvapaliny môž vyvolať pľúcny edém ohrozujúci živor. Až 20 ’/. pacientov môže vyžadovať intubáciu a mechanickú ventiláciu. Podávanie vo vysokých dávkach v podobe bolu.su vyvoláva prudšie krvácanie ako podávanie v nízkej dávke alebo pomalá kontinuálna infúzia a pri niektorých liečebných režimoch môže 100 7. pacientov vyžadovať podporu ICU pri liečení IL-2. Tiež boli pozorovaná myokarditída, kardiomyopatia a srdcová arytmia. Dôsledkom hypotenzie indukovanej syndrómom vlásočnicového krvácania môže byť akútne zlyhanie obličiek.

IL-2 môže tiež vyvolať prudkú diareu s nerovnováhami elektrolytu, cholestázu, tyroidné abnormality a akútnu pankreatitídu. U 15 až 20 7. liečených pacientov sa vyvíja anémia vyžadujúca transfúzie [Mac Farlane et al., Cancer 75: 1030 až 1037 (1995)]. Môže dôjsť tiež k trombocytopénii s krvácaním a k defektom vyvolaných koaguláciou dráh. U viac ako 70 7. pacientov dôjde k zmenám duševného stavu vrátane paranoidných delúzií, halucinácií, straty záujmu, porúch spánku a lahostajnosti.. Tiež boli oznámené javy, ako je kóma, poruchy videnia, prechodné ischemické záchvaty a parestézie. Tieto nevýhody spojené s exogénnym IL-2 vyvolávajú snahu hladať alternatívy, pri ktorých by napríklad mohla byt modulovaná endogénna produkcia IL-2 a tak eliminovaná nutnosť liečenia exogénnym IL—2. Takéto alternatívy by mohli byt terapeuticky využiteíné.

Identifikácia proteínov AKAP umožňuje nielen získať možný prostriedok na identifikáciu imunosupresívnych liečiv a modulátorov produkcie IL-2, ale umožňuje aj regulovať iné bunkové aktivity pravdepodobne s chladom na rôzne metabolické dráhy, ktorých sa proteíny AKAP, ako bolo ukázané, zúčastňujú. Tak napríklad AKAP 79 je dôležitý pri regulácii iónových kanálov regulovaných receptorom glutamátU v postsynaptickej neurónov, pravdepodobne prostredníctvom väzby kalcineurínu. PKA reguluje aktivitu kanálov hustote PKA, PKC a regulovaných receptorom AMPA a delokalizácia alebo inhibícia PKA zoslabuje aktivitu AMPA na iónové kanály. PKC reguluje aktivitu kanálov regulovaných receptorom

NMDA kalcineurín desenzitizuje receptor NMDA pri reakcii na stimuly. Tieto pozorovania ukazujú, že lokalizované kinázy (PKA a PKC) môžu regulovať aktivitu glutamátových receptorov v neurónoch. Defosforylácia kalcineurínom predstavuje prptiregu.lačný mechanizmus receptorov NMDA. Tento model je vo fyziologickom súlade s výskytom záchvatov indukovaných cyklosporínom alebo FK506.

Úloha g lutamátových receptorov je predpok la.daná pri mnohých neurologických chorobách. Glutamát a iné excitačné aminokyseliny môžu vyvolať v neurónoch excitotoxicitu a bolo pozorované, že nadmerná stimulácia postsynaptických glutamátových receptorov je toxická voči neurónom, pričom vyvoláva akútnu degeneráciu neurónov. Zistilo sa, že hypoxia (napríklad po mŕtvici alebo srdcovej zástave) a poškodenie centrálneho nervového systému vyvoláva značný výron glutamátu do extracelulárneho priestoru. Tento glutamát sa potom dostáva do interakcie s glutamátovými receptormi spúšťa excitotoxickú kaskádu. Na ochranu modelových zvierat pred poškodením mozgu je možné použiť a.ntiexci tačné činidlá [Olney, Neurobiology of Aging, 15: 259 až 260 (1994)]. Je zaujímavé, že antagonisti NMDA sú. toxickí k niektorým typom neurónov, čo ukazuje, že glutamát možno inhibuje iné excitačné dráhy v týchto bunkách. Bolo ukázané, že makrolidové protilátky, ako je FK506, tiež ochraňujú proti excitotoxicite u kultivovaných neurónov vyvolanej NMDA, ale nie kainátom [Manev et al., Brain Res. 624: 331 až ,335. (1993)].

Glutamát sa zrejme tiež zúčastňuje F'arkinsonovej choroby. Antagonisti NMDA chránia dopaminergické neuróny v substantia nigra opíc exponovaných MF'TF’, čo je chemická zlúčenina indukujúca. F'arkinsonovský syndróm u človeka a iných primátov. Ama.ntadín a nema.ntín sú antagonisti NMDA, ktoré sa používajú. v Európe na. liečenie F'arkinsonovej choroby, ale pre obidve tieto látky je známe, že u niektorých pacientov vyvolávajú, psychózu. Existujú určité dôkazy, že g lutamátergick.é neuróny môžu byť pri F'arkinsonovej chorobe hyperaktívne a ich inhibícia. by mohla znížiť motorické symptómy choroby [Lange a Riederer, Life Sciences, 55; 2067 až 2075 (1994)].

Glutamát má svoju úlohu tiež pri poruchách prejavujúcich sa záchvatmi. Zúčastňuje sa. začiatku, šírenia a udržiavania aktivity záchvatu. NMDA a ne-NMDA antagonisti sú silné antikonvulzíva [Meldrum, Neu.rology, 44 (suppl. Q): S14 až S23 (1994)]. Receptory boli tiež implikované pri ALS a v súčasnosti prebieha skúšanie antagonistov tohto receptora.

Vzhíadom na všetky vyššie uvedené pozorovania nie je prekvapujúce, že tiež mnohé iné imunosupresíva sú v štádiu klinických skúšok. Nasledujúce informácie týkajúce sa takýchto štúdií boli získané z publikácie Haydon a Haynes, Balliere's Clin. Gastroentero., 8: 455 až 464 (1794); Thomason a Starzi, Immunol. Rev. 1773, 71 až 78 (1773); a Morris J. Heart Lung Transplant., 12; S275 až 8286 (1773). Tak napríklad azaspiran indukuje určitý typ supresorových buniek a existujú určité dôkazy synergických účinkov tejto látky s cyklosporínom.

Ako äalší príklad je možné uviesť mycophenolate mofetial (zlúčenina vyvinutá firmou Syntex), ktorý inhibuje syntézu purínu a vykazuje a.ntiprol if eratívny účinok na T- a B-bunky. Táto látka vyčerpáva protilátky a môže tiež odčerpávať adhézne molekuly z povrchu buniek. Toto liečivo má nízku zjavnú toxicitu a môžu vyvolávať leu.kopéniu. Už 20 rokov sa používa na liečenie lupienky..

Ako äalší príklad je možné uviesť mizoribine (zlúčenina vyvinutá firnou Su.mitomo) , ktorý inhibuje syntézu DNA. Táto látka, má rovnaký mechanizmus účinku ako mycophenolate.

Ako äalší príklad je možné uviesť brequinar (zlúčenina vyvinutá firmou DuPon t-Merck) , ktorý inhibuje syntézu pyrimidinu blokovaním dihydroorát dehydrogenázy. Je očakávaná úplná správa o klinických pokusoch s touto látkou. Bolo oznámené, že táto látka synergicky pôsobí s cyklosporínom, ale môže vyvolávať trombocytopéniu, dermatitídu a mukositis.

Ako äalší príklad je (zlúčenia vyvinutá firmou funkciu monocytov metabolizmu, synté ovplyvňuje oxidačného možné uviesť í5~deoxysperqualin Nippon-Kayaku), ktorá prevažne a makrofágov, vrátane inhibicie zy lyzozomálneho enzýmu, produkcie z triedy II na povrchu buniek. Táto

IL-1 a expresie antigénov MHC zlúčenina je neresponduje môže vykazova zo 70 až 90 7. účinné pr na iné spôsoby liečenia, £ toxicitu na kostnú dreň odmietaní obličiek, ktoré ale pri vysokých dávkach ríklad je možné uviesť leflunomide (zlúčenina Hoechst), ktorý inhibuje pôsobenie cytokínu, T-buniek a syntézu protilátky. Nie je toxický ani voči kostnej dreni.

Ako á a 1 š í p vyvinutá firmou blokuje aktiváciu ani voči obličkám

Ako další príklad je možné uviesť rapamycín (zlúčenina vyvinutá firmou Wyeth-Ayerst), ktorý je príbuzný FK506. Ide o liečivo, ktoré sa aktivizuje väzbou na imunofi1ín, neinhibuje kalcineurín a neblokuje produkciu cytokínu v T-bunkách. Neznámym mechanizmom rapamycín blokuje prechod G1 na S.

Vynález zahrnuje mnohé modifikácie a variácie a vyššie uvedenými príkladmi realizácie nie je obmedzený. Všetky takéto modifikácie patria do rozsahu vynálezu, ak sú kryté pripojenými nárokmi.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ N A R O K Y

   1. Monoklonálna protilátka vylučovaná hybridómom 160C uloženým v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom HB 11955.
2. 2. Hybridóm 160C uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom HB 11955.
3. 3. F'urif ikovaný a izolovaný polypeptid, ktorý je špecifický imunoreaktívny s monoklonálnou protilátkou podía nároku 1 a ktorý * vykazuje molekulovú hmotnosť asi 120 kD na SDS-F'AGE.

   L·
4. 4. F'urif ikovaný a izolovaný polynukleotid kódujúci pol ypeptid podía nároku 3.
5. 5. Polynukleotid podía nároku 4, ktorý je DNA.
6. 6. DNA podía nároku 5, ktorá je cDNA.
7. 7. DNA podía nároku 5, ktorá je genómová DNA.

   Q. DNA podía nároku 5, ktorá je úplne alebo čiastočne syntetická.

   •
8. 9. F'urif ikovaný a. izolovaný polynuk leotid zvolený zo súboru, ktorý sa skladá, z

   a) po1ynukleútidu podía nároku 4a

   b) polynukleotidu, ktorý pri strinqentných podmienkach hybridizuje k polynukleotidu podía odstavca a).
9. 10. Hostiteíská bunka transformovaná alebo transfekovaná DNA podía nároku 4 alebo 9.
10. 11. Spôsob produkcie polypeptidu podía nároku 3, vyznačujúci sa t ý m, že sa hostiteíská bunka transformovaná alebo transfekovaná polynukleotidom kódujúcim polypeptid podía nároku 3 nechá rásť v médiu pri vhodných podmienkach a potom sa z hostitelskej bunky alebo z rastového média izoluje polypeptid.