CZ5495A3 - Two-component fibrin adhesive preparation for improving in vitro insemination - Google Patents

Description

vous lož' kovy f ^ OL· 1 nový ad. ho leošení oolod n 5 π í in ví tro j J. C* O w

'C v -J : o 2 ; cj c* i* > ‘-O 5Λ -< C " >o .r — v o “ 3 ~X n- 1 ^ : Došfo ^iT‘3C:iOZ9nV V Vfičir; .vká d vo u = 1o ř:<ovsho fibrine— váho adhezívního přípravku, obsahujícího složku Λ a ' 5 ^ rv "· •'j *» · m ·!* λ 1 i»? —<j X —| ‘-i. —' ώ ^ ^ [p b Ό - : Λ U,vJu.1ví1., "€

Dosavadní stav techniky .ε on V roce 1237 se v Anglii naroc.ilc

Poté se •i -i ^ y oplodněni in vitro šířeným. indikace pro in vi í K v*«" s T V * Φ 1 sloánom sa.irnuTz ora.;-ticky jakoukoliv formu neplodnosti. iyž zavedení IVF technik zlepšilo ve všech aspek-metodu, například, vyvolání ovulace, získání těch- tuto vajíčka a tak dále s výjimkou jedná oblasti, kde ještě jsou určité problémy a komplikace, kterou je oblast implantace embrya do dělohy. Výskyt implantace embrya mimo dělohu _ , r » v . * s t a 1 o ,ci n i ač 2 % vztaženo n-a embryo nebo 10 au 30 % těhotenství /jelikož se 2 ač 4 embrya normálně přenášejí v každém in. vitro oplodnění/, je možno se . domnívat, Se přenos mladých embryí /2 ač 3 buněk/ do Λ * čichy může hrát důležitou úlohu v takovém selhání, ΐ. V C.’ k vyššímu množství implantací. mrva jsou nezralá v tomto stadiu pro implantaci., naopak kultivace emryí mimo dělohu po delší dobu an/rya vy v * ή "1 Ξι -»a λ ya oos.cozune a poutě ;ioh se bude vyvíjet do blastcoytovéhc stadia, m stadiem,· ve kterém probíhá normální ;ru známé fibrincvc adhezivní přípravky ilacčcní imolantacc nelhávali. Bvlo bv připavnit omcryo takovým;o fib cínový:*. adhezivem :1 čichy / a r. dome tri. um/. poskytnutu ί- ί ·.; : li

'i 3 t. V ůi V S U ΐί Z S. V v i'. 5 1e - u V souladu s předloženým vynalezen p r o o 1 o·; n rest n o v o u slez k o v y ar" t i ".o r i. no v y n kam, který obsahuje složky· a a 3, kde :e tví- vy se uvscanv eny a on esu v 11 .i; a on pra v— Λ složka ή obsahuje f ibrřnogan a inhibitor proisásy a •s-l-ořka· B-* obsahuje prcteclytický .enzym.,, který je. schopen specificky štěpit fibrinogan- a působit tvorbu fibrineví ho polymeru a v * q. Ξ. _L S 1 složky p r o ku 11 i v a c i -2. ne ne, bc obou S1O Z ;ΐ 2 C Π Λ 2 £ # výhodně se jako frakce složky A, obsahující fibrinocen, používá krycprscipitát celo· krve nebo plasmy, nůše být použit komerčně dostupný kryoprecipitát. ilŮže být výhodné koncentrovat kryoorecipitát nezi faktorem 2 a 5. Výhodně je kryopreoipitét inaktivován na virus, nestup, pro virovou inakt.ivaci je,, například,· popsán v FCT/5? L-l/005 Základní princip této metody je ošetřeni kryopracipitátu speciálními dstargenty a později odstranění detergentu' z kryoprecipitátu. Výhodně je preteásevým inhibitorem přítomným ve složce*A apretiuin -a- je·-přítomen v koncentracích., až do ..... 10000 j/ml vztaženo na celkový objem složky A. 'oretinin p

OrTik‘l Ί 2 «1 3 P. 1ΓΓ: “12 ÚV 3 2._ -i. Λ Z 'C 2 * \ J../ 2 -/..2 loherankarkoxyloví kyselina/. _ t.; t.... ^ . i , je komerčně dostupný pod ochrannou známkou Trasy lo.V' nebo ?,ntagosar.^. Vhodným činidlem, které může být použito místo auro ti rdi nu nebo v ' i- ^ .= U- E dvousložkového 1 .V· C. < ·~\ r);í:;rav'cu 20c! 13 vyňal cca, ps zpraven.- schopon specificky Ό ' * r*· ^ λ ^ 1 y j- τ_ ^ ;Ιr~ '"1 rt — ’ nzymu, utery je 5; pit fibrincgen. Výhodně byl použit thrombin, který byl izolován z plasmy lidí nebo savců jako je hovězí c.o~

TK

Rekonstituce thrcmbinu se provádí roztokem, obsahujícím chlorid vápenatý, koncentrace pi pění fibrincgsnu závisí na metodě přenosu embrya do dělohy. V zásada, jestliže je požadován portálu pracující Ikový fibrinový adhezi-vní přípravek, měla by kon- intrace thrcmbinu být ie-az pozacovan nizsi, zatímco ~o-. —* rychle pracující fibri nový.. ad h.e z, i v n. í... p ř-í o r-=-v-e k-,· •je--------- žádoucí, aby koncentrace thrcmbinu byla vyšší /rychlý nový aíhezivní ao-e thrcmbinu novo, m adhezivn Jiné výhodné p avku podle oře : λ τ—v p- „p i *ΟΠ* centrao-e thrcmbinu 0,4 až 4 jednotky/ml v polámu pracujícím aahezivního :tu *:·**»·· >··* 'sjí 5 prctaclytický enzym, který je izolován z hadího jedu. Enzym hadího jedu. batroucbin, který může být izolován z jihoamerická zmije Eot.hrpcs mou jiní, j.e možno použít. Chemicky js tento jed jednoř-etězecvý glykopeptid s molekulovou hmotností přibližně 350Q0. Je znám pod názvem Deřibrase'1, která vyvolává štěpení al?,-15-arc/17 glre vazby ve fibri-nccanu ,která vyvolává uvolnění Zibrin.cpeptidu λ a tvorbu monomerπího fibrinu I.

Použití jakéhokoliv hadího jedu, koncertujícího fibri- ř ΐ Ί = <5 : ncgen, jako je Cefcbrase nebo reptiiase, je praže rovnáno, jestliže sa kryoprc-cipitát vyrobí z autologr.ího zdroje + a použití hadího jedu bude vylučovat použití lidského krevního oroáuktu. >dla předloSanóno vynálezu musí b pro kultivaci snrycnickýhh buněk ; on temny V' 'Zr I. 1D X1 p. C V ‘i i

adhszivním přípravku podle vynálezu. loho může být dosaěcr bud přímísaním složsn do jedné nebo eben sloze!-: Λ a S podl-2 vynálezu nebo rozpuštěním těchto složek v kapalino a sr.u-ssnirn této kapaliny s jednou nebo oběma složkami A a Preferované složky pro kultivaci emryonických buněk savců ty, které zahrnují chlorid vápenatý, chlorid draselný, sí ran horečnatý, chlorid sodný., hydrogsnuhličitan .sodný, e renoj.. vy- díhydrogsnfosforečnan sodný, D-glukosu jako; hodno má roztek pH asi 7,2. bůže být výhodné přidat navíc kyselinu pyrchrozncvou a antibiotika, např. gentamycir. pestup pro přípravu složky přípravku je uveden v PCT/E? 91/01350. iyoeoíy V G V i 1Γ U. Ό Γ O 3 i_ C. Λ V typickém postupu se kryopreoipitát a thrombin rozpustí v mediu pro kultivaci embrya. Samozřejmě jsou obě složky odděleny, aby se zabránilo nastartování srážecí F . ιΠ reakce. Složení dvou preferovaných kultivačních’medií jsou uvedena dále. první z nich je takzvané E5S3, které je komerčně dostupné od. Gibco L,éd. Γ.Ε33 je zkratka pro "Earle^s Salanced Salt Solutions", bůže být zakoupeno v kapalné nebo práškové formě.kapalná obsahuje bazvodý chlorid vápenatý v množstvích 0,2 g/1,chlorid- draselný 0,4 g/1, SO. x 7 :-:„0 0,2 g/1, chlorid sodný- C , 3 g/i,.hydrogon- uhličitan sodný 2,2 g/1, barelům 21 n ^ d o — /1 - V f f Λ ,0 g/1 a fenolová "červeň 0,01 g/i/"Případní po rozpuštění v jednom- litru 0,20 , C,é g/1 chloridu sodného, xosa forma obsahuje . el li ,'v w v Ί- g/1 chloridu, vápenatého k-ezvodého 0,0977 g/1 bezvcáeho síranu horečnatého, množství 5,30 g/1, I-TaH2?C/x H,G a stejný a fenolové červeně jako v kapalné formě. pyrchroznc :hlor id a o ony v ;b£ah D-glukosy b '*i > ^ ·—*:·*· ~i č" j] V L- 0,015 g/1 kyselím ve wnoc a gentnny kin v množství'Ξ0 mg/1 Όλ r ] r> 1' ^ n cr -5. A r * i V ^ prováni oplonnom oy z medium m-odiflkáváno za splněni £p za.da vků, které se mohou lišit, meřík Ind v zb Ji w umím aplikacím jak “ · z z z -· .'v í ? l’ v í i - m, :oio-;nsru. v a při zlepšení i: předloženého fibrinového achezivního přípravko proti známým fibriňovým aáhazivnífn produktům, které selhávej: in vitro oplodnění, nože být způsobena an t i f i-br i no 1 vt i o kcu aktivitu posouvající na necní rané' embrvo v děloze a

UlcUlICi na druh (ί)\ strana bránící degradaci sraženiny. Dvousložkový fibrincvý urno z nu j v Λ /· í -7. aaheziyní přípravek podle předloženého vynálezu lehy před tím X h v IřV: v * ---- ~ ± s •\ i-1 .1 ί ab n-3 vvso.íá .Tin- A. inu ta « J. « -k— » « 1 A-Z3 -i. l 4 L, >3 ormanentna

I XU J 2 :C2 3 L ΛΤΟ '*Ί' medián, obsahujícím složky překvapením bylo zjištěno, hibitoru podobného aprotininu neinterferují 3 smbryam, ale brání štěpení adheziva. bavíc, v jiném provedení , které je výhodné podle vynálezu, je dvousložkový fibrincvý adheživní přípravek isoosmomolární. Takto je zabráněno nevýhodě aďnaziv podle známého stavu techniky, která jsou hyper-osmolární, Hyperosmclarita působí zahubení embrya vysušením fenoménu. / 1 \ . k výhodné rysy fibrinového adheziva pod! ‘sou přítomnost solí a živin, ktsrš jsou vitro růst embrya, obsahuje antifibrinolytickou aktivitu pro posunutí časné degradace adheziva buč embryem nebo dělohou, navíc, antifibrinolytichá schopnost embrya byla

L.J iůleži bé

přebyt ;‘UI což ji \ umožňuje , aby fe t.u.3 . i y z c v s i u r γ/.'λ! Λ */. k v -* '-· něj sanctncr io za vytvoření kruhevité- líny, obkl Λ í f * fibrlnové adhezi vum. Λ ^ 1 ** T? > \ Ť '.-V yj*. d ^ J. ^ ζ i.: J V byl >·· mr, *7 - * *f 'e —r r o- - *o 2a určitých okolností by bylo ncžn obsažen růstový faktor, který sráni fotu. rCUZl ti kryoprecipitátu . jako zdroje f i b fibrinog enového ko: ncentratn jo výh • t ^ O r* nu spi.se ní první uvedený obsahuje složky podobné fibronektinu, von • Vři 1 lenbrandův faktor atd., které nohou být důležité pro aéhezi. Navíc může kryoprecipitát také obsahovat jiná činidla jako jsou proteiny nebo nízkorr.clekulární substance, které- podporují vývoj a uložení embrya. Uchou také být použity sloučeniny, tající vlastnosti napomáhá jící uz^avová: ran^jako je kyselina hyaluronová. O*:

Pro přípravu dvousložkového fibrincvého adhezivního přípravku podle vynálezu /jak může být použit v pokusech jak je popsáno výše/, se kryoprecipitát rozpustí v kultivačním mediu jak je popsáno výše. Ke kryoprecipitátu se přidá aprotinin nebo kyselina trar.examová . · Koncentrace aprotininu v kryoprecipitát obsahující složce Λ je výhodně v rozmezí 6,000 až ÍOOOCKuy/ml. Koncentrace kyseliny tranexa-mpvs je výhodně 10 až 200 ^jg/ml /konečná koncentrace/.

Toto je. ekvivalentní aprotinlnové aktivitě asi 3000 až 10 KI'J/ml·. Konečná koncentrace aprotininu ve směsi složky A a B je nižší, protože dojde při přidání složky 3 k neředění. Sed ící.. faktor závisí na množství složky 2, která· se přidává. Koncentrace fibrinogenu v roztoku kryopre-' cipitétu je relativně nízká ve srovnání s jinými fibrinovými adhezi-v-y-.^—protož.e._zd.-£._není potřeba silné . tahové, síly. ^ Výhodné koncentrace fibrinogenu jsou v rozmezí 5 až 20 g/i. mbryo. je injektováno například následuj: Tnbryo se umístí v rekonstituovaném krycprecig: tiva č ní m isku. Potom se při fl, /· C5 ČX 7:117 h 0, 4 Λ ^ A " Λ Λ ^ r V ’J Λ ^ ^ -* «Λ —. 1 - s · '7; ci 11Γ- i 1 Λ d, U li 1} Z 17 3 » :..7.1 177 1 7 C·;. :.ir -Γ .Λ "i cecezninuge kultivační kapalině a injektuje se do éČichy.

Claims (1)

1. (Λ ο-·