CZ49693A3 - Method for testing of a compound capability to inhibit onco-protein activity - Google Patents

Description

Vyhledjsv^cí testy

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobit identifikace vých terapeutických činidel.

protiraKOvmcDosavadní stav techniky

Tento vynalez je částečným poktsu-uvanim Lítífi patentové μη— záři l?9y.

mnoha typu rakovin je v konečm stadiu způsobovaná produkty aktivovaných bunecnych onkogenu

-* < ς řš 2-4 ιΓ~ t~*~ ~ϊ iri M _e 5 ϊ*[Γί {j _B

779 až 827, 1987? Cole M. D.s finn. Rev. Geaž 776, 1985.). Tyto onkogeny expresí poskytuji onkoproteiny, (Bishop J. M.: Science 255, Rev. Biochem. 56 které zůstávají v buňce, často umístěné· ve specifických buněčných složkách, jako je například jádro, cytopiasma nebo ounecna memorana» onkogeny kóduji Fos, respektive Myc proteiny. Exprese velkého množství buč Fos nebo Myc v rozmanitých buněčných typech umožňuje, aby buňky rostly nekonečně v buněčné kultuře (souhrnně je tato skutečnost uvedena 23 az 38, 1985 a Wemberg 1985.). Nadexprese bud Fos v pra·;

i = ,7 M.

/ ;u az //6, nebo Myc v normálních krysích fibroblasetch, společně s expresi aktivovaného ras onkogenového produktu transformuje fibroblasty a vybavuje je schopnosti tvořit nádory v živých zvířatech (band H. a spol.í Nátuře 504, óňl, 1983Ruley Η, E.s Nátuře 509, 602 az 606, 1983,).

Fos a Myc jsou příklady onkoproteinů, k‘ iovány, lokalizovány v jádře buňky a mají « transkripci (Donner F‘. a spoj

Watt R. A= a spol.; Mol,

IMdLUrtí 117 0 :erě jsou fosfory :-c no pn 051 fnen i o a? 9AA 1QP?·

156, 1985 a ken;

Μ. -a spol.: Nucl. Acids Res. 15. 277 až 292, 1937.}. Nedávné studie ukazuji na to, ze onkoproteiny, jako je například řos a Myc, fněm expresi genu a. znesmrtelňuj i buňky regulaci promo— torové aktivity specifických cílových genů a tedy aktivuji nebo potlačuji transkripci takových cílových genu (viz například Varmus Η. E.: Science 238. 1337 až 1339, 1987; Kingston R. E. a spol.: Cell 41, 3 az 5, 1985; Bishop J. M.s Cell 42, 23 až 38, 1985 a Weinberg R. A,; Science 230. 770 až 776., 1985,),

Předpokládá se, že do regulace.genů zasahuji také jiné onkoproteiny. Například v jádře -umístěný onkogenový produkt v-jun {virový jun) se váže na specifická místa na DNA (Struh! k.s Cell 50, 841 až S46, 1987.) a je homologoi s c-jun (buněčný, jun) prodijýinw který se také vá že _ k á m.f t * n .

(Jkan.hť/se, že jun genový produkt je identický s drive nařizovaným transkripčním faktorem AP-i (Sohmann D, a .po.,j Science 23-3. 1386 až 1392, 1987,).

Je žádoucí, aby --by-í-y- ntOehtif ikovány sloučeniny, .·-.teré inhibují onkoproteinovou aktivitu. Inhibováním onkoproteinové aktivity lze dosáhnout inhibováni a/nebo kontroly růstu buněk způsobovaného onkoproteiny. Zvláště je žádoucí identifikovat inhibitory onkoproteinů, které nemění aktivitu normálních buněčných ekvivalentů onkoproteinů, Podáváním takových inhibitorů by se dosáhlo terapeuticky vhodných účinků při léčeni nemoci, při nichž exprese a aktivita onkoproteinů je faktorem, který podporuje růst buněk nebo uchovává buňku v transformovaném stavu .

Do dnešního dne vsak bylo identifikováno pouze několik inhibitoru onkoproteinů. Identifikováni takových inhibitorů trpí tím, že neexistuje jednoduchý, nikoliv drahý a spolehlivý vyhledávací test, který by mohl rychle identifikovat potenciální inhibitory a jejich aktivní deriváty. Tento vynález poskytuje takovýto test. Použitím instantního testu lze identifikovat inhibitory aktivity onkoproteinů a, jestliže je to žádoucí, tyto inhibitory dále testovat tak, aby se eliminovaly takové inhibitory, které obecně inhíbuji normální buněčnou transkripci, nebo takové, ktere inhíbuji aktivitu normálních buněčných onkoproteinových hontologu

Podstata vynálezu

Rozpoznaní významu toho, že inhibitory onkoproteinú by mely hrát roli pri terapeutickém léčeni mnoha forem rakoviny a znalost toho, ze chybí jednoduchý testovací systém, kterým by mohly být takové inhibitory identifikovány, vedlo k tomu, ze autoři tohoto vynálezu zkoumali použiti chimernich onKogenovycn konstrukci v in vivo testech v eukarotických hostitelích jako modelový systém, v němž identifikovali činidla, která mění expresi onkogenú. Tato úsilí vyvrcholila vývojem jednoducneno, nikoliv drahého testu, který se múze používat pro detekci inhibitoru biologické aktivity savčích onkoproteinú.

Tento vynález poskytuje rychlý, spolehlivý a přesný způsob objektivního identifikováni sloučenin, včetně lidských farmaceutickcýh prostředku, jako inhibitoru onkoproteinové aktivity a tedy jako protirakovinových terapeutických činidel.

Tento vynález dále poskytuje způsob identifikování a klasifikováni mechanismu působeni bioaktivni onkoproteiny inhibujíci sloučeninv.

Tento vynález dále poskytuje test pro monitorováni isolace a/nebo čištěni sloučeniny inhibujici onkoproteiny nebo směsi takových sloučenin ze surového prostředku.

Tento vynález dále poskytuje způsob identifikováni a klasifikování sloučeniny jako inhibitoru onkoproteinové aktivity tim, že se stanovuje schopnost takové sloučeniny měnit expresi reporterového genu, při čemž exprese reporterového genu je odštěpí tělně napojena na. regulační aktivitu transkripce napojeného onkoproteinú. Tento způsob obecně zahrnuje: (a) získáni hostitelské buňky, která obsahuje reportérovy gen, který je odštěpitelně napojený na DNA vazebné místo a obsahující gen napojeni onkoproteinú, který expresí poskytuje onkoproteinové napojení schopné navázat se na DNA vazebné místo (takové, že exprese reporterového genu je zprostředkována onkoproteinovým napojením navázaným na DNA); (b) uvedeni hostitelské buňky do kontaktu se sloučeninou a (o) testováni exprese reporterového genu. Sníženi exprese reporterového genu ukazuje na sloučeninu, která inhibuje onkoproteinovou aktivitu.

Tento vynález dále poskytuje způsob identitikováni schopnosti sloučeniny inbibovat onkoproteinovou aktivitu tím, že se stanovuje schopnost sloučeniny inbibovat onkoproteinem indukovanou expresí reportérové molekuly. Tento způsob obsahuje: (a) růst prvního hostitele v přítomnosti sloučeniny, při čemž první hostitel je transformován jednou nebo více rekombinantnimi konstrukcemi kódujícími fúzovaný protein a reportérovy gen a exprese reporterového genu je odštěpítělně napojena na expresi fúzovaného proteinu, (b) růst druhého hostitele v přítomnosti stejné sloučeniny, pří čemž druhý hostitel je transformován jednou nebo vice rekombinantními konstrukcemi kódujícími fúzovaný onkoprotein a reporterový gen a exprese reporterového genu je odstěpitelně napojena na expresi fúzovaného onkoproteinu a (c) srovnáni exprese takového reporterového genu v prvním hostiteli s expresi takového reporterového genu ve druhém hostiteli.

Ve výhodných uspořádáních se ve způsobech podle tohoto vynálezu jako hostitel používají kvasinky nebo kultivované živoč i sn é buň k y.

V následující části tohoto spisu budou popsána výhodná uspořádáni tohoto vynálezu.

V následujícím popisu se používají četně pojmy, které jsou známy odborníkům z technologie rekombinace DNA. Pro získání zřetelnějšího a důsledného pochopeni tohoto spisu a patentových nároků včetně rozsahu, který je dán těmito pojmy, jsou zde uvedeny následující definice.

Pojem odstěpitelně napojený tak, jak je používán zde, znamená, že dva makroa^plekulární prvky jsou uspořádány tak, že upravením aktivity prvního prvku se indukuje vliv na druhý prvek. Takto lze upravením aktivity promotorového prvku měnit a/nebo regulovat expresi odstěpitelně napojené kódující sekvence. Například transkripce kódující sekvence, která je odstěpitelne napojena na promotorovy prvek, je indukována faktory, které “aktivují aktivitu promotoru. Transkripce kódující sekvence, která je odstěpitelně napojena na promotorovy prvek, je inhibována faktory, které “potlačují aktivitu promotoru. Promotorova oblast je tedy odstěpitelně napojena na kódující sekvenci proteinu jestliže transkripce akti takové kódujíci

Steř K VfcřPí C fc?

je ovlivněn ivitou promotoru.

Pojem fúzovaná konstrukce se obecně týká rekombinantnich genu, které kóduji fúzované proteiny a fúzované onkoproteiny.

Pojem fúzovaný protein znamená hybridní protein. Hybridní protein znamená takový protein, který je zkonstruován tak, že obsahuje domény alespoň ze dvou různých proteinů. Pojem rázovaný protein“ tak, jak je používán zde, znamená hybridní pro tein, který má (a) regulační doménu tresnskripce z regulačního proteinu transkripce jiného než onkoproteinu a (b) doménu vázající DNA z proteinu vázajícího DNA. Struktura fúzovaného proteinu je taková, že regulační doména transkripce a doména vázající DNA jsou uspořádány takovým způsobem, který umožňuje, že obě domény jsou biologicky aktivní. Ten protein, který je zdrojem regulační domény transkripce, je jiný, než protein, který je zdrojem domény vázající DNA. To znamená, že tyto dvě domény jsou navzájem heterologní.

Transkripčni regulační doména transkripce fúzovaného proteinu může bud aktivovat nebo potlačovat transkripci cílových genů, podle povahy biologické aktivity domény. Pojem fúzovaný protein tak, jak je zde používán, zahrnuje fúzované onkoproteiny podle vynalezu, jak je to zde nize popsáno.

Pojem gen fúzovaného proteinu znamená DNA sekvenci, která kóduje fúzovaný protein. Gen fúzovaného proteinu múze dále poskytovat regulační prvky transkripce a translace pro jeho kontrolu transkripce a translace. «

Pojem fúzovaný onkoprotein tak, jak pouz;

an znamená také hybridní protein, který je zkonstruován tak, aby obsahoval domény ze dvou různých proteinu. Pojem “fúzovaný onkoprotein tak, jak je zde používán, znamená hybridní protein, který nese Ca) regulační doménu translace z regulačního onkoproteinu translace a (b) doménu vázající DNA proteinu, který váže DNA. Struktura fúzovaného proteinu je taková, že regulační doména transkripce a doména vázající DNA jsou uspořádány tak, že umožňuji, aby obě domény byly biologicky aktivní. Tento onkoprotein, který je zdrojem regulační domény transkripce, je jiný než protein, který je zdrojem domény, která váže DNA. To znamená, že tyto dvě domény jsou navzájem heterologni.

Regulační doména transkripce fúzovaného onkoproteinu může buč aktivovat nebo potlačovat transkripci cílových genů, podle povahy biologické aktivity domény.

Pojem gen fúzovaného onkoproteinu se týká DNA sekvence, která kóduje fúzovaný onkoproteín. Gen fúzovaného onkoproteinu muže dále poskytovat transkripční a translační regulační prvky pro kontrolu jeho transkripce a translace.

Pojem “varianta“ proteinově částice tak, jak je zde používán, jako je například fúzovaný protein nebo fúzovaný onkoprotein, znamená proteinovou částici, která obsahuje sekvenci aminokyselin, která je v podstatě podobná, ale nikoliv identická, se sekvenci sminokyseln fúzovaného proteinu nebo fúzovaného onkoproteinu zkonstruovaného z přirozeně se vyskytujících domén .

Pojem “v podstatě podobná“ sekvence aminokyselin znamená sekvenci aminokyselin, která je vysoce homologni, ale nikoliv Identická, se sekvenci aminokyselin nacházející se ve fúzovaném proteinu nabo fúzovaném onkoproteinu. Mezi vysoce homologni sekvence aminokyselkin patři sekvence s 30% nebo vyssi podobností, možná však i s nižší homologií, zvláště tehdy, jestliže homologie je zkoncetrována v doménách, o které se jedná, a podobnost je nutná pro funkci proteinu.

Pojem funkční derivát fúzovaného proteinu nebo fůzovaBBBSBraraasBsnaKroT ného onkoproteinu tak, jak je zde používán, znamená protein, ktst^ý Htá biologickou sktivitiLi_? kiiGfá js v podsizstš pccJocríš bio·*“ logické aktivitě konstrukci fúzovaných proteinu podle tohoto vynálezu. Pojem v podstatě podobný” znamená biologickou aktivitu, která je kvalitativně podobná, ale kvantitativně rozdílná. Například funkční derivát fúzovaného onkoproteinu může rozeznávat stejný cil jako fúzovaný onkoprotein, ale nikoliv se stejnou afinitou. Podobně funkční derivát fúzovaného proteinu muže rozeznávat stejný cil jako fúzovaný protein, ale nikoliv se stejnou afinitou.

peptidu se v tomto spisu mluví jako o “funkčním derivátu, jestliže obsahuje aminokyselinový hlavni řetězec hybridního proteinu podle tohoto vynálezu plus další chemické části, které obvykle nejsou částmi hybridního proteinu. Takové části (skupiny) mohou zlepšovat rozpustnost derivátu, jeho absorpci, biologický poločas atd. Tyto části mohou také snižovat toxicitu derivátu nebo odstraňovat či zmenšovat jakýkoliv nežádoucí vedlejší účinek derivátu atd. Skupiny nebo části schopné vyvolávat takové účinky jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Postupy kondenzace takových části s molekulou jsou. dobře známy odborníkům.

Funkční derivát hybridního proteinu může, ale nemusí, obsahovat post-translačni modifikace, jako je například kovalentne navazaný sacharid, coz zavisi na tom, jestxi jsou t_a;-·.uvě iíiú difikace nutné pro provedeni způsobů podle tohoto vynálezu.

Pojem funkční derivát je zamýšlen tak, že zahrnuje funkční fragmenty“, varianty, analogy nebo “chemické deriváty molekuly.

Pojem odpověS tak, jak je tento pojem používán v tomto spisu, znamená změnu jakéhokoliv parametru, který muže být používán pro měření a popsáni účinku sloučeniny na aktivitu onkoproteinu nebo fúzovaného onkoproteinu podle tohoto vynálezu. Odpověd lze zjistit jako fyzikální změnu (jako je například změna ve fenotypu) nebo jako molekulární změnu (jako je například změna reakční rychlosti nebo afinitni konstanty). Detekce odpovědi se muže provádět jakýmikoliv vhodnými prostředky.

Pojem sloučenina tak, jak je tento pojem používán ide, znamená označeni chemické částice, až je tato částice v pevné, kapalné nebo plynně fázi. Tento pojem by měl být brán tak, že zahrnuje syntetické sloučeniny, přírodní produkty a makromolekulám! částice, jako jsou například polypeptidy, polynukleotidy nebo lipidy, a také malé částice, jako jsou n transmitěry, ligandy, hormony nebo elementární sloučeniny.

Pq j wff· *' H i,03fo. *t.i vn i sioucsn;

znamená jakoukoliv sloučeninu, která indukuje měřitelní testech podle tohoto vynálezu.

Pojem promotor tak, jak je zde používán, znamená sekvenci DNA umístěnou vedle počátku transkripce na. 5' konci odštěpí tělně napojené transkribované sekvence. Tento promotor muže obsahovat jeden nebo více regulačních prvku nebo modulu, které interagují při modulování transkripce odštěpítělně napojeného genu,

Pojem exprese tak, jak je zde používán, znamená postup, kterým se odkrývá informace kódovaná v genu, Jestliže gen kóduje protein, pak exprese zahrnuje jak transkripcí DNA na mRNA, tak opracováni (procesí) mRNA (jestliže je to nutné) na matu.rovaný mRNA produkt, tak i translaci maturované mRNA ru nmi ρ i n

O molekule nukleove kyseliny, jako je například DNA nebo gen, se mluví jako o molekule, která je schopna expresi poskytovat polypeptid, jestliže tato molekula obsahuje kódující sekvence pro polypeptid a sekvence pro kontrolu exprese, které, v příslušném hostitelském prostředí, mají schopnost transkribo— vat, opracovávat a překládat genetickou informaci obsaženou v DNA na proteinový produkt a jestliže tyto sekvence pro kontrolu exprese jsou odětěpitelně napojeny na sekvenci nukleotidů, která kóduje polypeptid.

Pojem klonovaci vektor tak, jak je zde používán, znamená α

jakoukoliv molekulární částici, která je schopna dodávat sekvence nukleove kyselinby do hostitelské buňky pro účely klonování. Mezi příklady klonovacích vektoru patři plasmidy nebo fágy, včetně těch, které se mohou replikovat nezávisle v hostitelské buňce. Užitečná je také molekula nukleove kyseliny, která se múze vkládat (integrovat) do chromosomové DNA hostitelské buňky, zlástě molekula, která se vkládá do chromosomové DNA hostitelské buňky stabilním způsobem, tj.. způsobem, který umožňuje, aby taková molekula byla děděna dceřinnými buňkami.

Klonovací vektory jsou často charakterizovány jedním nebo malým počtem míst rozeznávaných endonukleasami, ve kterých se DNA sekvence mohou štěpit stanoveným způsobem bez toho, aby vektor ztratil podstatnou biologickou funkci, a v nichž může být DNA střižena tak, aby došlo k její replikaci a klonováni.

Klonovací vektor může dále obsahovat markér (označeni), který je vhodný pro použiti při identifikaci buněk transformovaných klonovacim vektorem. Například genem markéru muže být gen, který uděluje hostitelské buňce resistenci na specifické antibiotikum. Slovo “vektor je zde někdy používáno místo výrazu klonovací vektor.

Pojem expresní vektor tak, jak je zde používán, znamená vektor, který je podobný klonovacímu vektoru, ale kterýje specielně určen pro získáni prostředí, které umožňuje expresi klonovaného genu po transformaci do hostitele. Jedním způsobem, jak získat toto prostředí, je získat regulační sekvence transkripce a translace v tomto expresním vektoru, při čemž tyto regulační sekvence transkripce a translace mají schopnost být odstepitelně napojen na klonovaný gen. Jiným způsobem, jak získat toto prostředí, je získat klonovací místo nebo místa v takovém vektoru, v němž lze klonovat žádaný klonovaný gen a žádané regulační prvky exprese.

V expresním vektoru je gen, který má být klonován, obvykle odštěpítělně napojen na jisté kontrolní sekvence, jakými jsou například promotorové sekvence. Kontrolní sekvence exprese se budou měnit podle toho, zda tento vektor je určen pro expresi odstepitělně napojeného genu v prokaryoticfcéiii nebo v eukaryotickém hostiteli. Může dále obsahovat transkripční prvky, jako jsou například zesilovací prvky, terminační sekvence, tkáňově specifické prvky a/nebo místa pro iniciaci a terminaci translace .

Pojem hostitel tak, jak je.používán v tomto spisu, znamená jakýkoliv organismus, který je příjemcem klonovacího nebo expresního vektoru. Ve výhodném uspořádaní je hostitelem podle tohoto vynálezu kvasinková buňka nebo kultivované živočišné, buňka, jako je například savčí buňka nebo hmyzí buňka, ve zvláště výhodném uspořádáni se jako kvasinkový hostitel používá Saccharomyces cerevisiae. v jiném zvláště výhodném uspořádáni se jako savčí hostitel používá kultivovaná buňka CV-1 nebo NIH3T3.

Proteiny, které reguluji transkripci, obecně nesou schopnost vázat specifické DNA sekvence a schopnost regulovat specifické promotory, které obsahuji tyto sekvence. Takové proteiny obecně mají alespoň dvě funkce, funkci, která váze DNA, a funkci regulace transkripce. Po navázání na DNA doména regulace transkripce proteinu změní (aktivuje nebo potlačuje) transkripci genu odštěpitelne napojeného na vazebné místo regulační proteinové DNA.

V mnoha regulačních proteinech vázajících DNA jsou vazebná funkce, která váže DNA, a funkce regulace transkripce neseny na oddělených doménách. Tyto domény jsou často diskrétními jednotkami a jsou umístěny v místech aminokyselinového řetězce, která lze fyzikálně oddělit. Oddělením těchto jednotek je možné zkonstruovat deriváty přírodních DNA vázajících regulačních proteinů. Takové deriváty mohou například nést schopnost vázat DNA, ale nikoliv schopnost regulovat transkripci DNA, Takové deriváty mohou být dále doménami vázajícími DNA jednoho regulačního proteinu a regulační doménou transkripce jiného regulačního proteinu.

Podle tohoto vynálezu se spojením domén ze dvou různých proteinu do jednoho fúzovaného proteinu muže vytvořit jeden která váže DNA, v konstrukci protein, který nese spojeně vlastnosti původních domén. Takový protein se pal; může používat pro identifikováni a charakterizováni sloučenin nebo jiných faktorů, které moduluji nebo jinak mění aktivitu jedné 2 fúzovaných domén.

Pro použití ve způsobech podle tohoto vynálezu musí hostitel nést alespoň dvě genetické konstrukce. První konstrukci, která poskytuje genetické sekvence, které jsou schopny expresi poskytovat bud fúzovaný prc druhou konstrukci, která poskytuje ger cí reportérovy gen. U takové hostitelské buňky je nutné, aby promotor reporteroveho genu obsahoval prvek.vazajici DNA, kter’ je rozpoznáván doménou vázající DNA fúzovaného proteinu nebo fúzovaného onkoproteinu. Exprese (nebo represe) syntézy reporteroveho genu je tedy závislá na expresi a nsvazani fúzovaného proteinu nebo fúzovaného onkoproteinu na -promotor rsporterovehf genu.

Ve způsobech podle tohoto vynalezu, se s výhodou používají dva hostitelé. Jeden hostitel nese konstrukci fúzovaného proteinu, druhý hostitel obsahuje konstrukci fúzovaného onkoproteinu a oba hostitelé obsahují stejnou konstrukci reporterovéhí genu. A dále, doména, která vaze DNA, v konstrukci fúzovaného □ O í π £ f 3 5 úzovaneho onkoproteinu. Jestliže se oba hostitelé působení sloučeniny a jestliže se srovnají exprese reportéru v těchto dvou hostitelích, je možno stanovit schopnost sloučeniny specificky měnit onkogenem indukovanou transkripci {a neměnit transkripci obecně).

Regulační doménou transkripce konstrukce fúzovaného proteinu v prvním hostiteli múze být jakákoliv doména, která umožňuje regulaci, a s výhodou aktivaci, transkripce. Například se muže použit normální buněčný protějšek regulační domény transkripce onkoproteinu použitý v konstrukci fúzovaného onkoproteinu v druhém hostiteli. Také se může použít, a to zvláště tehdy jestliže onkoproteinový normální buněčný protějšek je bud neidentifikován nebo je identicky s onkoprotemem, regulační doména transkripce z různých regulačních proteinů transkripce. Použití regulační domény transkripce 2 různých regulačních proteinů může být výhodné také tehdy, jestliže je žádoucí zajistit, aby jakékoliv potenciální inhibitory, které jsou identifikovány, obecně neinhibovaly transkripci.

Způsoby podle tohoto vynálezu mohou být použity pro identifikaci sloučenin, které vykazuji transkripci samy o sobě. Způsoby podle tohoto vynálezu «nohou být použity také pro identifikaci sloučenin, které inhibují nebo jinak interferují s oligomerizací proteinů, zvláště tehdy, jestliže je taková oligosserizace nutná pro regulaci transkripce genu markéru. Bez omezení se na specifický mechanismus působení bíoaktivnich sloučenin identifikovaných způsoby podle tohoto vynálezu, je známo, že regulační doména transkripce mnoha proteinů vázajících DNA může interagovat s (oligomerizovat s) druhým proteinem nevázajícím DNA a, v cligomerni formě, stimulovat trankripci odstěpitelně napojených genů. Podle toho tedy v takovýchto fúzovaných konstrukcích podle vynálezu, které vyžaduji pro transkrípčni aktivitu takovou oligomerizaci, sloučeniny, které inhibují takovou opiigomerizaci, inhibují také onkoproteinovou aktivitu.

Jakýkoliv protein vázající DNA nebo regulační protein transkripce, a zvláště eukaryotické proteiny, se mohou používat jako zdroj žádané domény ve fúzovaných proteinových nebo fúzovaných onkoproteinových konstrukcích podle tohoto vynálezu. Jsou známy mnohé regulační proteiny transkripce. Regulační proteiny transkripce a způsoby použité pro charakterizaci domén takových proteinů jsou souhrnně popsány Johnsonem a McKnightems Annu. Rev. Bioch. 58, 798 až 839 (1989). Tato citace je zde uvedena jako odkaz.

V konstrukcích podle vynálezu ty sekvence, které poskytují 1) DNA vázající doménu a 2) DNA vázající prvek rozeznávaný touto doménou, mohou být homologni s hostitelskou buňkou nebo mohou být s touto hostitelskou buňkou heterologni. S výhodou se používá heterologni DNA vázající doména a DNA vázající prvek.

Ve zvláště výhodném uspořádáni, u eukarotických hostitelů, je zdroj prvku vázajícího DNA a zdroj domény proteinu vázající

DNA, který váže tento prvek, prokaryotický. Použiti prokaryotických regulačních prvku u eukaryotického hostitele ve způsobech podle vynálezu je výhodné a velice snižuje možnost, že hostitel bude obsahovat endogenní prvek, který muže být titrovan, zředěn nebo který může jinak interferovat s interpretaci výsledků získaných způsoby podle tohoto vynálezu.

I když to není nutné pro praktické použiti způsobů podle vynálezu, jestliže zvolená regulační doména transkripce není normálním buněčným protějškem onkoproteinu (například odpovídající c—Myc doména v—Myc) , může být žádoucí využit regulační doménu transkripce DNA z DNA regulačního proteinu, který je stejné DNA vázající třídy jako onkoprotein. Mnohé regulační proteiny, které sdílejí homologie v jejich místech vázajících DNA mohou sdílet také podobnosti ve způsobech, kterými reguluji transkripci.

Dvěma charakteristickými motífy vázajícími DNA jsou he1ix-turn-helix motif a zinc-íinger motif. Následující proteiny mohou, obsahovat zinc-f inger'¹ motif : kvasinkové proteiny 6AL4, HAF‘1, ADR!, SWI5, ARGRII a LACP, Neurospcra protein cys—3, Dro— sophila proteiny kruppel, snail, hunchback, serendipíty a supresor hairy—wínq a proteiny obratlovců Spi, H2TF-1ZNF—<zB—podobný protein, PRDÍ, TDF, GLI, Evi—1, glukokortikoidni receptor, estrogenový receptor, progesteronový receptor, receptář hormonu štítné žlázy (C—erbA) a ZIF/26S. Následující proteiny obsahuji helix-turn-helix motif: kvasinkové faktory sexuálního typu MATal, MATa2, MATs.1, Drosophil proteiny antennapedia, ul~ ibithorax, paired, fushi □ rázu, cut a. engrailed a proteiny obratlovců OTF-l(OCTl), 0TF-2Í0CT2) a F‘IT-1.

Regulačními doménami transkripce, které jsou výhodné ve způsobech podle tohto vynálezu, jsou regulační domény GCN4 a

GAL4.

Mezi příklady prokaryotických proteinů vázajících DNA s doménami vázajícími DNA a prvky vázajícími DNA, které jsou užitečné ve způsobech podle tohoto vynálezu, patři LexA, CAR (katabolický aktivátorovy protein z Escherichia coli), bakteriofág

LSíTíbós CRO 3 CI př“QtSÍ-Γΐύ , represor

presor, fág 434 a P22 represor a Cro proteiny. Navíc se může používat jakákoliv z domén vázajících DNA z DNA regulačních proteinu, jejichž seznam je shora uveden, jestliže v buňce je přítomno dostatek molekul proteinu pro ztitrování jakéhokoliv místa vázajícího homologni DNA, které je přítomno v hostitelské buňce.

Identifikace domény vázající DNA v proteinu se múze provádět rozmanitými technikami, které jsou známy odborníkům a které již byly dříve použity pro identifikaci takových domén. Proteiny vázající DNA a domény vázající DNA v takových proteinech se identifikuji a vyčisti využitím jejich afinity k DNA. Například navázání DNA lze odkrýt pokusy hybridizace na filtru, při němž se protein (obvykle označený, aby se usnadnila detekce) nechá navázat na DNA imobi1izovanou na filtru, nebo naopak, při němž se vazebné místo DNA (obvykle označené) naváže na filtr, na němž je zmobilizován protein, Specifičnost sekvence a aktivita takového navázáni se odkryje testy chráněni DNA a testy zpoždováním na gelu. Vyčistění takových proteinů se muže provádět tak, že se použijí DNA afinitní chromatografické techniky specifické pro sekvenci, tj, chromatografická kolona s pryskyřici derivatizovanou DNA, na niž se doména váže, Proteolytická degradace proteinu, které vážou DNA, se muže použit k odkryti domény, která zachovává schopnost vázat DNA,

Doména vázající DNA se technikou genetického inženýrství zavede do fúzovaného onkoproteínu způsobem, který neničí schopnost této domény rozpoznávat DNA prvek, na který se přirozeně váže. To znamená, že doména vázající DNA se ziská způsobem, který neničí DNA vazebnou specifičnost domény vázající DNA,

Regulační domény transkripce v proteinech mohou být identifikovány také technikami známými odborníkům. S výhodou se využívá klonovaný protein, v němž lze genetickými sekvencemi snadno manipulovat, V klonované formě je syntéza derivátů, přírodnino proteinu s výhodou řízena expresními vektory tak, že regulační doména transkripce může být identifiována sledováním schopnosti derivátů, které se získávají expresí, aktivovat transkripci genů, o nichž je známo, že jsou aktivovány proteinem o plné délce. Navíc, testy transkripce, které nezahrnují buňky a které umožňují přesnou transkripci ze žádaného promotoru, se mohou provádět s použitím templátú klonované DNA.

Fúzovaný protein a fúzovaný onkoprotein podle tohoto vyná-. lezu může obsahovat více než jednu aktivační doménu transkripce. Podobně promotorové oblast reporterového genu může obsahovat více než jeden prvek, který váže DNA, při čemž každý z nich je schopen měnit (indukovat a/nebo inhibovat) expresi odštěpitelně napojeného reporterového genu.

Genetické konstrukce podle vynálezu (fúzovaný protein a reportérovy gen nebo fúzovaný onkoprotein a reportérovy gen) mohou být umístěny ve dvou různých plasmidech nebo fragmentech rekombinantní DNA nebo mohou být spojeny v jednom plasmidu nebo fragmentu rekombinantní DNA. Tyto konstrukce mohou být také vloženy do genomu hostitelské buňky.

S výhodou se fúzovaný onkoprotei technikou genetického inženýrství sestaví tak, že se odstraní (nebo desaktivuje) doména vázající přírodní DNA onkoproteinu (jestliže nějaká existuje) a nahradí se doménou vázající heterologni DNA. Výsledkem je to, že fúzovaný onkoprotein se už více neváže na jakékoliv specifické DNA prvky, které mohou být přirozenými čily onkoproteinu. Fúzovaný onkoprotein se nyní specificky váže na DNA sekvenci rozpoznatelnou doménou vázající heterologni DNA na fúzovaném onkoproteinu. Jakmile se jednou naváže na DNA, dochází k transkripci odštěpitelně napojených genu.

V jiném uspořádaní fúzovaný onkoprotein s-i zachovává doménu vázající přírodní DNA, ale obsahuje také druhou doménu vázající heterologni DNA. V tomto uspořádáni se fúzovaný onkoprctein múze ještě navázat na jakékoliv specifické DNA prvky, které jsou normálně cíly onkoproteinu, pokud navázání proteinu na jeho přírodní místa nevylučuje jeho navázáni na prvek vázající heterologni DNA.

Fúzovaným konstrukcím muže také eny bez. prircum aime r j. začni doména. V jistých případech přitomnosc přiřčeni difesrizetni domény umožňuje aktivaci pomoci LexA operátoru, bud zabráněním dimerizace domén vázajících LexA DNA (a tedy zabráněním naváže, ni fúzovaného proteinu na LexA operátor) nebo usnadněním heterodimerni interakce s některým jiným buněčným proteinem (např. jiným transkripčním faktorem nebo jadernou matricí). Tím se sníží počet molekul fúzovaného proteinu, které jsou dostupný pro homodimerizaci a navázání cílového promotoru.

Dimerizačni domény' proteinu a onkcproteinú podle vynálezu mohou být odstraněny z DNA sekvence, která kóduje onkoprotein nebo jiný protein, enzymatickoým štěpením (např. restrikčnim štěpením) nebo, jestliže dimerizačni doménou je karboxylový ko nec, vložením (insercí) stop kodonu proti směru vlákna nebo do domény.

Reportérovým genem múze být jakýkoliv gen, jehož expresi lze sledovat a jehož exprese muže sloužit jako indikátor aktivity fúzovaného proteinu nebo fúzovaného onkcproteinú, Ve výhodném uspořádáni reportérovy gen znamená gen, který normálně není získáván expresi hostitelem, nebo znamená gen, který nahrazuje gen endogenní pro hostitele.

Produkt reporteroveho genu muže být přímo testován imuno— analýzou. Mezi tyti imunoanalýzy patři takové analýzy, v nichž protilátka je v kapalné fázi nebo je navázána na nosič v pevné fázi. Pro použiti v imunoanalýzách múze být reportérovy gen také detegovatelně označen různými způsoby. Mezi výhodné imunoanalýzy používané pro detekci reporteroveho proteinu patři rádi oifflunoanalýzy, ELISA analýzy (enzyme—linked immunosorbent as— says) nebo jiné analýzy dobře známé odborníkům, jako jsou například imunofluorescenčni analýzy, chemiluminiscenční analýzy nebo bioluminiscenčni analýzy,

Jakákoliv detegovatelná fenotypická změna může sloužit jako zaklad pro způsoby podle tohoto vynálezu. Zlástě- užitečné jsou reportérové geny, které uděluji hostiteli nový fenotyp, jestliže dochází fc expresi. Zvláště užitečné jsou geny, které poskytuji hostiteli schopnost růst na selektivním mediu. Například u kvasinek použiti kvasinkového LEU2 genu jako reporférového genu v mutovaných kmenech, jimž chybí endogenní LEL/2 aktivita, umožňuje, aby takové kvasinky rostly na leucinu jako jediném zdroji uhlíku (viz například The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, red. Strathern a spol., Coltí Spring Karbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1981 a způsoby popsané Rothsteinem a spol.: Mol. Cell Biol. 7, 1198 (1987).). Exprese reporterového genu se sleduje pouhým pozorováním toho, zda si hostitel zachovává schopnost růst na leucinu.

yfcfi

V hostitelích, kteří v se exprese a aktivita cuje sledováním produk dasy múze být sledován barviva, X gai, ktere yužívají lacZ gen jako reportérovy gen fúzovaného onkoprotemu snadno vynodno ce fcs—galaktosidasy· Produkce 0—galakco a vizuálně v přítomností chromoforního způsobuje modré zabarveni po hydrolyze es í z ymem.

Mezi další reportérové geny patří hi stě výhodný reportérovy gen v savčích buň —transferasa (CAT).

, ura3, trpí a zvlách, chloramfenikolřepo

Zručný odborník si muže představit mnoho terových systémů, které by odhalovaly př j iných vhodných tomnost nebo inty

To, že k účinku žádané sloučeniny dochází diky vlivu na transkripci a ne tím, že by se olivnovala aktivita reportero— vého produktu jako taková, lze zjistit na základe srovnáni učinku této sloučeniny v hostitelích obsahujících onkoproteinový fúzovaný produkt s účinkem této sloučeniny v hostitelích, kteří obsahují ne-onkoproteinový fúzovaný produkt, jestliže oba hosti tele obsahují stejnou konstrukci reporterového genu.

výhodném uspořádáni zpus-obu podle tohoto zovaný onkoproteinový gen obsahuje ni represorový protein LexA a sekv nu transkripce virového onkoprotei vede k fúzovanému onkooroteinu Le sekvenci kódující bak enci kódující aktivačn nu vFos. Exprese tohot xA-vFos“. LexA-vFos si teriáli doměθ' genu z ac no— ίπηπηίί f } . 4DNA

-vFos si zachovává také potenci aktivovat transkripci diky přítoianosti vFos aktivační domény transkripce. Navázání LexA-vFos fúzovaného onkoproteinu vede k aktivaci transkripce diky přítomnosti aktivační domény nebo domén nesených vFos částici.

Reportérové konstrukce, v nichž LexA represor-operátorová sekvence (prvek, který váze DNA, rozpoznávaný doménou, která váze LexA DNA) znamená modul nebo prvek s promotorem, který je sám odštěpítělně navázán na lacZ reportérovy gen, poskytuje expresí produkt lacZ genu v odpovědi na navázáni fúzovaného onkoproteínu LexA-vFos, Sloučenina, která mění aktivitu fúzovaného onkoproteinu, je snadno identifikovatelná vyhodnocením schopnosti hostitelů expresi poskytovat lacZ reportérovy gen a tedy hydrolyzovat X—gal na modrý chromofor. Jestliže se onkoproteinová aktivita mění přítomností sloučeniny, která inhibuje tuto aktivitu, hostitelská buňka méni expresi lacZ reportérové— ho genu a tedy mění jeho schopnost hydrolyzovat X-gal na modrý chromofor,

Jestliže se jako hostitelé ve způsobech podle tohoto vynalezu používají kvasinky, mohou se kvasinkové kmeny odděleně vysít a nechat růst jako trávníky. Sloučenina, která se má testovat, se může aplikovat na jednu z desek na filtračním papírovém disku, který je. impregnován touto sloučeninou, nebo se to múze provést tak, že múze být obsažena v mediu, na němž kvasinka roste, Schopnost sloučeniny měnit onkoproteinem indukovanou aktivitu aktivace transkripce múze být delegována objevením se zóny kolem disku impregnovaného sloučeninou. Například, jestliže je sloučenina toxická pro přežiti kvasinek, potom kvasinky neporostou v zóně, která obsahuje tuto sloučeninu,

Jestlize.se jako hostitelské buňky používají živočišné buňky v kultuře, pak se může sloučenina, která se testuje, přidat k tomuto kultivačnímu mediu.

Jestliže je to nutné, múze se propustnost buněk pro různě sloučeniny zvýšit použitím mutovaného buněčného kmenu, který má zvýšenou propustnost nebo použitím sloučenin, o nichž je známo, že zvyšuji propustnost. Například u kvasinek se mohou takové sloučeniny, jako je nonapeptid polymyxin B použit pro zvýšeni propustnosti kvasinek pro malé organické sloučeniny=

U buněk z vyssich eukaryotu se pro zvýšeni propustnosti muže používat také dimethylsulfoxid. Mohou se používat také analoga těchto sloučenin 5 které jsou propustnější kvasinkovými membránami. Například dibutyrylový derivát sloučeniny často umožňuje zvýšenou propustnost sloučeniny biologickými membránami.

tifikaci bioaktivnich sloučenin, které interferuji s onkoproteinovou aktivitou, která souvisí s membránou a/nebo která je lokalizována v cytoplasmě. Například onkoproteiny Ras a Src stimuluji expresí genu závislého na Fos v eukaryotickýc.h buňkách. Testováním bioaktivni sloučeniny, která méni markér této exprese, lze identifikovat bioaktivni sloučeniny, které inhibu ji Ras nebo Src stimulaci transkripce závislé na Fos.

Pobočným způsobem se mohou použil zpusooy pobxe tonuco vy nálezu k identifikaci inhibitoru proteinových kinas, například tehdy, jestliže aktivita takové kmasy rozhodne menz transit ζρ ci genu markéru podle způsobu podle tohoto vynálezu.

Je možno chemicky zkonstruovat DNA sekvenci fúzovaného proteinu a/nebo cílového genu, jestliže neni žádoucí využit klon genomu nebo mRNA jako zdroj genetické informace. Způsoby chemické syntézy DNA jsou velmi dobře známy odborníkům. DNA se mohou získávat také od komerčních prodejců.

Pro expresi rekombínantnich fúzovaných konstrukci podle vynálezu jsou nutné transkripční a translačni signály rozeznavatelné hostitelem. Sekvence kódovaná klonovaným fúzovaným pro teinem nebo klonovaným onkoproteínem, která se získá podle sho ra popsaných způsobů, muže být odstepitelne napojena na sekven ce, které kontrolují expresi translace v expresním vektoru, a zavedena, například transformací, do hostitelské buňky. Produkuj z se tak rekombínantnz fúzované proteiny nebo luzuvcute onku proteiny nebo jejich tunkcni deriváty pro použiti ve způsobech podle tohoto vynálezu.

¢.

Regulační signály iniciace transkripce se mohou vybrat tak 5 že umožňuji potlačeni nebo aktivaci exprese napojené konstrukce. Lze tedy modulovat expresi napojené konstrukce, jestliže je to žádoucí. Zajímavé jsou takové regulační signály, které jsou citlivé na teplotu. Měněním teploty pak lze potlačit nebo iniciovat expresi. Zajímavé jsou rovněž takové regulační signály, které’ jsou závislé na chemické regulaci, například metabolity nebo analogy metabolitú přidané k růstovému mediu.

Napojená konstrukce se múze také získávat expresi v hostitelské buňce.

Jestliže v hostitelské buňce nejsou dostatečně funkční přirozeně kontrolní sekvence exprese, potom mohou být substituovány sekvencemi funkčními v hostitelské buňce.

Exprese fúzovaných konstrukci v různých hostitelích může vést k různým post-translačnim modifikacím, které mohou měnit vlastnosti těch proteinu, které se získávají expresi těchto konstrukci, Je nutné, aby v hostiteli docházelo k expresi proteinů, při čemž není zabráněno schopnosti proteinu zachovávat si svoji biologickou funkci. Exprese proteinů v kvasinkových hostitelích se s výhodou dosáhne použitím kvasinkových regulač» nich signálů, Vektory podle tohoto vynálezu mohou obsahovat od— stěpitelně napojené regulační prvky, jako jsou například zesilovací prvky (proti směru vlákna aktivátoru v kvasince) nebo DNA prvky, které udělují druhově, tkáňově nebo buněčně specifickou expresi na odstěpitelně navázaném genu.

«

Obecně se expresní vektory, které obsahuji regulační sekvence transkripce, jako jsou například promotorové sekvence a terminační sekvence transkripce, používají v souvislosti s hostitelem, Tyto sekvence usnadňují účinnou transkripci genového fragmentu, který je na ně odstěpitelně navázán. Navíc, expresní vektory také typicky obsahuji diskrétní DNA prvky, jako jsou například a) počátek replikace, který umožňuje autonomní replikaci vektoru, nebo prvky, které podporuji inserci vektoru do hostitelského chromosomu stabilním způsobem, a b) specifické geny, které jsou schopny poskytovat fenotypickou selekcí v transformovaných buňkách. Euksryotické expresní vektory mohou obsahovat také prvky, ktere umožňuji ucnovávam v prok&t /otickych hostitelích. Takové vektory jsou známy jako ry nebo vektory pro vice hostitelů.

marni vektorřesná povaha regulačních oblastí potřebných pro expresi genu bude záviset na druhu a typu buňky. Existuje mnoho příslušných expresních vektorových systémů, které jsou komerčně souhrnné uu

Ve vysoce vyhodn pOUZl vaj Í r^vtíSii tr-.y » expresi genu v kvasinkách, byly (Struhl L.! Ann. Rev. Biochem. 58, 1051 az 1077 (1989); tato citace je zde zahrnuta jako odkaz.). V kvasinkách většina promotorů obsahuje tři základní DNA prvky; i) sekvenci aktivátoru proti směru vlekna (UAfcí) , 2) prvek TATA s. 3) iniciační (1) prvek. Některé promotory obsahuji také operátorové prvky.

V jiných uspořádáních se jako hostitelské buňky používají Pro expresi proteinů v savčích buňkách lze odvodit množství regulačních signálů transkripce a t rai is 1 al od genomových sekvenci virů, které infikuji eukarytoickě buňky,

Jakmile už je jednou vektor nebo DNA sekvenci obsahujici konstrukce připravena pro expresi, DNA konstrukce se zavede (za;vedou) do příslušné hostitelské buňky ktsrýmkoliv z mnoha různých vhodných prostředků, například transformací. Po zavedení vektoru se buňky příjemce nechají růst v selekčním mediu, které vybírá pro růst ty buňky, které obsahuji vektor. Exprese sekvence (sekvenci) klonovaného genu vede k produkci fúzovaného proteinu nebo k produkci fragmentu tohoto peptidů. K této expresi může dojít kontinuálním způsobem v transformovaných buňkách nebo může být indukována exogennimi činidly (viz výše).

tak, i hostitele, tasove výhodou zkonstruuj, do chroomosomu

ΏΟί zru ťfunkčně vkládá do hostitelského chromosomu, například pomoci retrovirových vektoru, transposonú nebo jiných DNA prvku, které podporují integraci DNA sekvenci do chromosomu. Fúzovaný gen se múze zavést také do vektoru, který se nereplikuje, Exprese fúzovaného vektoru pokračuje tak dlouho, dokud vektor přetrvává v ρο pu1 a c i bun ě k .

Buňky, které byly transformovány DNA vektory fúzovaného proteinu podle tohto vynálezu, se mohou vybírat také zavedením jednoho nebo vice markérů, které umožňuji výběr (selekci) hostitelských buněk, které obsahují tento vektor. Jako markér se může použit například resistence na synthetické enzymy aminokyselin nebo resistence na biocidy, například resistence na antibiotika, jako je například G4ÍQ, nebo těžké kovy, jako je například měě, a nebo podobné.

Ve výhodných uspořádáních je výhodnou kvasinkovou hostitelskou buňkou Sacoharomyoes cerevisias a výhodnými savčími hostitelskými buňkami jsou buňky CV—i nebo NIH3T3.

•Způsoby podle tohoto vynálezu poskytují rychlý, spolehlivý a ekonomický způsob, podle kterého se vyhledávají a klasifikuji sloučeniny jako inhibitory onkoproteinové aktivity. Způsoby podle tohoto vynálezu jsou dostupné pro průmyslové vyhledáváni aktivity inhibitorů onkoproteinu ve velkém měřítku z velkého počtu sloučenin nebo prostředků. A dále, způsoby podle tohoto vynálezu umožňují testováni jakékoliv čisté sloučeniny, směsi sloučenin nebo směsi prostředků tak, aby bylo možno identifikovat aditivní, synergicke a nebo škodlivé vlivy takových prostředků. Způsoby podle tohoto vynálezu jsou užitečné také pro identifikací přítomnosti bioaktivních sloučenin v surových extraktech a jako testy při čistění bioaktivních sloučenin z těchto extraktů. Způsoby podle tohoto vynálezu jsou užitečné také při vyhodnocováni stability shora uvedených bioaktivních sloučenin a zvláě-tě při vyhodnocováni účinnosti různých prostředků.

Následující příklady.dále popisuji materiály a způsoby používaně v tomto vynálezu. Tyto příklady nejsou zamýšleny jako

jakékoliv omezeni tohoto vynálezu.

Příklady proveden i vynáIezu

V této části spisu jsou uvedeny příklady testů a onkoproteinových fúzi užitečných pro tento vynález. Tyto příklady jso uvedeny jako ilustrace, nikoliv, jako omezeni'tohoto vynálezu.

Konstrukce fúzovaných genů a fúzovaných onkogenú

a. Obecný postup

Konstrukce LexA fúzovaných genů je popsána v práci Lecha K. a spol.: Cell 52, 179 až 134 (1938), Brenta a Ptashneho: Cell 43, 729 (1935) a Brenta v USA patentu číslo 4 333 OSO.

Všechny tyto citace jsou zde uvedeny jako odkazy. V patentu Brenta (USA patent c. 4 333 OSO) jsou popsaný také plasmidove vektory, které mohou být použity při konstruováni LexA fúzovaných genů obecně (např. pBRSOO), kvasinkových expresních vektorů (např, pAAHS) a kvasinkových cílových (nebe

-Qvycn plasmidú, které zahrnuj£ kvasinkové cílové geny nesou· směru vlákna LexA operátory,

b. LexA-Gal4

Konstrukce LexA—Gal4 fúzovaných genů tentu čislo 4 333 OSO (Brent).

je pupsana

c. LexA-vMyc

Plasmid MC33, který obsahuje úplný ptačí MC29 pi cytomatosis virus (Reddy E. P. a spol,: Proč, Nati. Acad, Sci. USA 80, 2500 až 2504 (1933)=), dostupný z Americké sbírky typů kultur ((American Type Culture Collecticn), Md, ATCC Accesion Number 41007), se rozštěpí v místě Sspl po směru vlákna virové ho gag-myc genu. Tato směs se nechá zreagovat s T4 DNA ligasou. v přítomnosti Hindi II linkerú. Ligační směs se nechá zreagovat s Pst I a Hindi II. Pstl—Hind 111 kousek, který obsahoval většinu, myc genu, se isoluje a vloží do plasmídu PUC1S, který byl rozštěpen působením Pstl a HindlII, Generuje se tak p<.

V jiné sérii konstrukci se BamHI-Xmnl kousek z plasmidu pBR430 (Brent R. a spol.: Nátuře 312, 612 až 615 (1984)? Brent: USA patent číslo 4 S33 OSO.), který kóduje část LexA na aminovém konci, liguje s dvojvláknovým adaptorem sekvence

CSSSSASCTGCA

SCCCCTCG a výsledný fragment se vloží do plasmidu. pUC19, který se před tím rozštěpí působením BamHI a Pstl. Výsledkem je plasmid pKA144. BamHI stepi'tetracyklinový gen plasmidu pBR4S0 a pBR322. BamHI-Pstl LexA kousek z plasmidu pKA144, Pstl—HindiII v-myc kousek z plasmidu pKA58 a HindiII-BamHI kousek z plasmidu pBR322 se ligují dohromady. Získá se tak plasmid pKA2ÍO. Plasmidová DNA se vyhledává z bakteriálních koloniíí na LB deskách obsahujících tetracyklin. Jeden takový plasmid, plasmid pKA210, obsahuje prvních 37 kodonu z lexA, tři kodony z adaptorového fragmentu a kodony 51 až 425 z v-myc. Fúzovaný gen kóduje protein o 465 aminokyselinách, jehož sekvence přes místo napojeni (fůze) je pro gly glu leu gin pro, kde pro znamená aminokyselinu S7 z LexA a gin znamená aminokyselinu 51 přírodního vMyc proteinu. Tento gen kóduje fúzovaný protein s předpokládanou molekulovou hmotou přibližně 51 000.

Také se múze zkonstruovat LexA-vřlyc fúzovaný protein, kterému chybí jeho dimerizační doména (tj, chybí mu jeho doména helix-smyčka-helix a leucíncvá zipová doména).· Takové konstrukce se mohou připravovat následujícím postupem. Plasmid pKASQ (viz výše) se rozštěpí působením BamHI a Pstl (enzymy, které stepi plasmid pKA5S uvnitř jeho poly1inkeru), Do tohoto místa se vloží serže čtyř syntetických oligonukleotidú. Znovu se tak vytvoří úplná (přírodní) N-koncová vMyc sekvence. Výsledný plasmid se pak označí BHvMyc. EcoRI-HindlϊI fragment, který obsahuje pLICi8 polylinker a LexA-vMyc gen se vyštípnou z BKvMyc a vloží se do Lex202PL základního řetězce rozštěpeného působením EcoRI a HindlII (Ma a Ptashne: Cell 51. 113 (1997): Ruden a spol.: Nátuře 350, 250 (1991).): Lex202PL je plasmid, který obsahuje aminokyseliny 1 až 202 z LexA, včetně LexA dimerizační domény. Výsledný plasmid, označený H202/vMyc, obsahoval aminokyseliny 1 až 202 z LexA fúzovaného do oblasti k aminokyselinám 1 až 425 z vMyc. Pro deletování (vypuštěni) Myc dimerizační do měny se H202/vMyc rozštěpí působením Balí v jedinečném místě odpovídejicim aminokyseliné 362 v Myc proteinu. Do tohoto miste se vloží polylinker obsahující stop kodon tří oblastí (New England Biolabs linker č. 1062, Beverly, Ma.). Získá se tak gen, který kóduje useknutý LexA-vMyc protein. Tomuto proteinu chybí Myc helix-smyčka-helix doména a rovněž Myc leucinový zip. Tento plasmid se označí H202/vMycdeltac. Bylo zjištěno, že LexA-vMyc protein kodovaňý H202/vMycdeltac aktivuje v kvasinkách konstrukce operátoru, který obsahuje Lexft, silněji než Myc fúzované proteiny, které obsahuji dimerizačni doménu. V savčích buňkách useknutý protein poskytoval měřitelnou hladinu Myc aktivity, zatímco Myc fúzované konstrukce, které obsahovaly přírodní Myc d i me ri z ačn í domén u, nikoliv.

d. LexA-cMyc

Plasmid pCDEM5.8 (poskytnutý Adriánem Haydayem), který obsahuje lidskou c—myc cDNA, se rozštěpí působením Smál a BamHI. Fragment o 2 300 párech nukleotidů, obsahující exony 2 a 3 z c-myc genu, se liguje se Smal-BamHI fragmentem z plasmidu pLCÍ9. Získá se tak plasmid pC20. Tento plasmid se pak částečně rozštěpí působením Pstl. Isoluje se fragment, který obsahuje všechny až na prvních 38 kodonú c-myc genu, >nt

ICO f rSymí íiguje s plasmidem ρΚΑ1Ο35, který se před ligaci rozštěpí působením Pstl, plasmidem, který je identický s plasmidem pKA144 ž na to, že místo Smál í-.! If' « O

-•kladnim řetezci plasmidu pUCi zničeno štěpením v překrývajícím se místě KpnI, a zpětně naváže pomoci T4 DMA polymerasy. Výsledný plasmid pVR103, obsahuje prvních 87 kodonú lexA, tři kodony vnesené adaptorovým fragmentem a kodony 39 až 440 z c-myc. Fúzovaný gen kóduje protein o 492 aminokyselinách, jehož sekvence přes místo nepojeni (fúze) je gly glu leu gin pro, kde pro znamená aminokyselinu 87 z LexA a gin znamená aminokyselinu 39 z přírodního cMyc proteinu. Tento gen kóduje fúzovaný protein s předpovězenou molekulovou hmotou přibližně 54 000. Lidský c-myc’gen je dostupný také z Americké sbírky typů kultur (American Type Culture Collection, ATCC Accession No. 39 286).

Plasmid p.-BJ-I ahujť FBJ — MuSV prt_n ·/ HindlII fragΛ mentu ο 5 800 párech nukleotidů vloženém do Hindi II miste plasmidu pBR322 (Van Beverens C. a spol.: Cell 32, 1241 až 1255 (1983)? Curran T. s. spol.: Virol. 116, 221 až 236 (1982); Curran T. a spol.: J. Virol. 42., 114 až 122 (1982).). Tento plasmid se rozštěpí působením Eagl a doplní se na 5' přečnívajícím konci Klenowem. Takto upravený plasmid se potom rozštěpí působením HindlII. Isoluje se fragment o 3 600 párech nukleotidů, který obsahoval část karboxylového konce v-fos proteinu. Tento v-fos Eagl(doplněný)-HindiII kousek se liguje s lexA BamHI-Xmnl kouskem z plasmidu pBR480 (viz níže) a s HindI1I-BamHI základním řetězcem fragmentu plasmidu pBR322. Tato konstrukce, která obsahuje E. coli, byla identifikována svoji resistenci na tetracyklin. Typický výsledný plasmid, pKA195, obsahoval prvních 87 kodonú lexA napojených přímo na kodony 23 až 381 z v-fos. Tento fúzovaný gen kóduje protein o 446 aminokyselinách, jehož sekvence přes místo napojení (fúze) je pro ala gly, kde pro znamená aminokyselinu 87 z LexA a první ala znamená aminokyselinu 23 z v-fos produktu, v-fos Gen se může získat také z Americké sbírky typů kultur (American Type Culture Collection, ATCC Accession No.41 040).

f . LexA—cFos

Plasmid FMC5A obsahuje myší cFos cDNA v plasmidu pSEM—1. Tento plasmid se nejdříve rozštěpí působením Eagl. 5'-Přečnívající oblast se doplní Klenowem. Potom se rozštěpí působením HindlII. Karboxylový konec fragmentu cfos genu, který obsahuje Eagl(dopIněný)-HindlII fragment o 1900 párech nukleotidů, se pak liguje s BamHI-Xmnl fragmentem plasmidu pRB481Flip a HindiII—BamHI fragmentem z plasmidu pRB4Sl. Plasmid pRB4Sl obsahuje Hind 111-zakončený LexA gen, včetně jeho E. coli promotoru v plasmidu pi4—8 (Brent a Ptashne: Cell 43_, 729 (1985);

Brent: USA patent číslo 4 833 030.). V této konstrukci by se plasmid pRB48O (Brent: USA patent číslo 4 833 080) mohl použit místo plasmidu pRB481. Plasmid pRB481Flip se zkonstruuje tak, že se plasmid pRB481 rozštěpí působením HindlII. Isoluje se plasmid, jehož Hindi II-zakončený LexA fragment měl opačnou crientaci. E. coli, která obsahuje LexA-vFos fúzovaný gen, se identifikLije svoji resistenci na tetracyklin. výsledný plasmid, pVR6, obsahoval prvních 87 aminokyselin LexA fúzovaných přímo ηδ kodony 23 až 380 c-fos. Tento fúzovaný gen kóduje protein o 445 aminokyselinách, jehož sekvence pres místo napojeni (fuze) je pro ala gly, kde pro znamená aminokyselinu 87 LexA a alí znamená aminokyselinu 23 z produktu c-fos. Tento gen kóduje fúzovaný protein s predpovězenou molekulovou hmotou přibližné 47 000, Myší c-fos gen se múze získat také z Americké sbírky r (American Type Cul ture Collection, ATCC Accession typu kultu No. 41 0·*

Plasmid pLexA-vJun je popsán Struhlem: Nátuře 332, 647

Gen v—jun ie dostuunv z Hmeriukí ibírkv typu kultur nitz i d. i :an Type Culture CollectiGn, ATCC As.Let>&iun No· č3-J 026 5

Přiklad 2 kvasitikuvé ρΐ«sHíioy

Kvasinkové cílově (nebo reportérové) plasmidy obvykle nesou URA3’’ gen, replikátor 2p.m a promotorové prvky, jak je to popsáno Brentem: USA patent číslo 4 833 080, který je zde zahrnut jako odkaz.

F'r o tu, aby bylo iisuzne provádět expresi LexA—Myc a Lex-Fus fúzovaných konstrukci v kvasinkách, se Hind111—zakončené fúzované geny vloží do HindiII místa plasmidu pAAH5. Plasmid pAAH5 nese í_EU2⁺ gen, část 2μ plasmidu, která umožňuje replikaci v kvasinkách, a. DNA fragment, který obsahuje ADH1 promotor a terminátor transkripce obklopující Hindi II místo (Ammerer <3.: Meth, Enzymol. 101. 172 až 210 (1783): Brent: USA patent číslo 4 833 OSO.). Misto plasmidu pAAH5 se mohou použit jiné kvasinkové expresní plasmidy. Mnohé z nich jsou popsány v knize CIoning Vectors

-ed. PqwbIs a -.gul., Elsevier, 1787,

K expresi LexA-vFos může docházet také z plasmidu pKL1170NS nebo pAF3, Plasmid pKL1170NS s-e zkonstruuje tak, ze se BamHI fragment obsahující ADH1 promotor, LsxA-vFos gen a

ADH1 terminátor z plasmidu pAAH5-LexA-vFcs (viz shora) vloží tío plasmidu pSE35SNS, Plas-mio psE353NS se připraví rozštěpením plasmitíu pUNIO CElledge a spol.; Bene 70., 303 (1988).) působením Sáli. Přečnívající DNA se odštěpí působením nukleasy (irrang beán nuclease) a zpětným navázáním, kterým se odstraní místo Sáli. Plasmid pAF3 byl zkonstruován ve dvou stupních. Nejdříve se BamHl/EcoRl-zakončený fragment z plasmidu pADES (White J.

H. a spol.; Nátuře 315, 350 až 352 (1985),), který obsahoval ADE8 gen, vloží do BamKl/EcoRi-zakončeneho základního řetězce plasmidu pSE358SN, Vytvoří se tak plasmid pA-S—7. Potom se BamHl-zakončený fragment, který obsahuje Lexft-vFos, ADH1 promotor a terminátor (víz výše), vloží do plasmidu pAS-7. Zisků se tak AF3.

Potom se provede exprese LexA-vJun a jeho aktivita se testuje tak, jak to bylo popsáno Struhlem (Nátuře 332« 64 9 (1988),).

Příklad 3

Savci plasmidy

Savci cílové (nebo reportérové) plasmidy, které jsou zde používány, jsou popsány Bodowskim P. J, a spol.; Science 241, 812 až 816 (1988), Tato citace je zde zahrnuta jako odkaz. Tyto vektory obsahuji p-globínový promotor fúzovaný na gen chloramfenikol-acetyltransferasy, Jednomu cíli, GBCD, chyběl proti sméru vlékna LexA operátor, Druhý cíl,.XBC0, obsahoval jediný Lexfi operátor 125 páru nukleotidu proti směru vlákna od počáteč niho bodu transkripce, Dalsi cílové plasmidy se mohou zkonstruovat tak, že se jeden nebo více LexA operátoru (viz Brent; USA patent číslo 4 833 080.) umísti nepatrně proti směru vlákna savčího promotoru, jehož aktivita se testuje,

Expresní proteiny, které kóduji fúzované onkoprcteiny, se zkonstruuji tak, ze se Hind111—zakončený LexA—vPos nebo LexA—vNyc gen z plasmidu pKA195 (Lech K. a spol,; Cell 52, 179 až 184 (1988),) nebo H202/vMycdeltac vloží do savčího expresního vektoru p6R (Sodowski P. J. a spol,; Science 241, 612 až 816 (1988),), Syntéza proteinu těmito plasmidy byla řízena RSV promotorem, Ve shoa uvedené knize '‘Cloning Vectors (viz výše)

jsou popsány četné další savčí expresní vektory.

Pro expresi Lexft-vJun v savčích buňkách se pLexA—vJun (viz výše) rozštěpí v jedinečném miste štěpení EcoRI po směru vlákna 'sekvence LexA-vJun, naváže se na EcoRI-HindiII adaptor a rozštěpí se působením HintílII. Hindi 11-zakončený LexA-vJun fragment se nejdříve vloží do HindiII místa plasmidu pi4-S (viz výše tak plasmid pKLS14é·, který se pak vloží do

Ex per imentá1ft i postupy

a. Růst a transformace bakteriálních buněk

Bakterie byly kultivovaný a transformovány standardními tec hn i k ami (Ausube1 F. M.

cular Biology, New York, a Miller J.s Experimentea spol.: Current Protocols in MoleGreen Publishing Associates (1987) m Molecular Genetics”, Cold Spnng

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1972.). Kmeny, které nesly plasmid, se mnozí v LB mediu, ktere obsanuje WO pg/μΐ Karbanic11 mu, Jako bakteriaini hostitele pro Konstrukci '· .·' pf-í 5 -? ?”’·· ρΡ9?Λ ' f- S » O(supfc tftiA delta (lax-proAB) __7 —i _ 7 _ ř-,-í -t 3C

ÁdLiOťJ Lcii JlU/ .

5ΓΟΪ5

b. Mikrobiologická práce s kvasinkami

Kvasinky byly nechaný růst v YEP mediu doplněném o 2 Z glukosy. Transformace se provádí podle postupu, který popsal Lech K. a spol.: Cell 52, 179 až 184 (1988). Plasmídy byly uchovávány v kvasinkách kultivaci buněk v minimálním mediu, které obsahovalo 2 Z glukosy, ale bez nutričního doplňku kódovaného selektovatelným markérem plasmidu (Sherman F. a spol.: ‘‘flethods in Yeast Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (19335.). Geny pod kontrolou GAL10 promotoru byly indukovány růstem hostitelských buněk po dobu 36

U ν'κίέιην pokusů v kvasinKscii uyi J«ir>u iiusux'

DBY745 <α ura3 leu2) (Brent: USA patent c. 4 S33 080.). Pevnými a kapalnými medii, která byla pra tento účel používána, bylo SD medium (bez uracilu) pufrované na pH 7,0 přidáním hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu draselného na konečnou 70mM koncentraci. Zdroje uhlíku byly přidány tak, aby jejich konečné koncentrace (každého z nich) byla 2 X.

c. Testování 3-ga1aktosidasovs aktivity f3-Salak tosidasovs testy byly prováděny podle postupu, který popisuje Yocum R. R. a spol.: Mol. Cell. Biol. 4, 1935 až 1998 (1934) nebo také na buňkách vyrostlých na pevném mediu (Lech K.í Sene ficivation by DNA Bound Fos and Myc Proteins, Ph.D. disertační práce, Harvard University, 1990.) až na to, že buňky, které se testuji, byly nechány růst na pevném spise než v kapalném, selektivním mediu._| p—Balaktosídasové jednotky byly vypočteny podle rovnice:

Jednotky = 1000. OD^c-r,/ objem buněk (ml).doba reakce (min ) .0D_Aon

d. Růst a transfekce savčích buněk

Buňky CV-1 ledvin .opice (ATCC Accession No. CCL70) byly nechány růst v Dulbeccově modifikovaném Eagleově mediu (DMEM), které obsahovalo 10 X plodového telecího sera, a štěpeny 24 hodin před transfekcí. Dočasná transfekce se provádí způsobem srážením fosforečnanem vápenatým (Godowski F'. J, a spol.: Science 241. 812 až 316 (1988).). Všechny transfekce byly opakovány alespoň třikrát ve dvojím provedení, aby byla zajištěna reprodukovatelnost výsledků. Tento způsob se typicky provádí tak, že se 10 pg expresního plasmidu fúzovaného proteinu a 2 μη cílového plasmidu zavedou do buňky spolu s 2,5 ug expresního plasmidu lidského růstového hormonu (pXBHS, Selden R. F. a spol.: Mol. Cell. Biol, 6, 3173 až 3179 {1986); Ausubel F. M, a spol,: Curent Protocols in Molecular Biology'', New York,

Green Publishing Associates (1987).) jako vnitrní kontrola účinnosti transfekce. V těch pokusech, kdy aktivita jaderného onkoproteinu (např. Fos, Myc, respektive Jun) je modulována aktivitou cytoplasmového nebo s membránou souvisejiciho onkoproteinu (např, ras nebo src), se do transfektované směsi přidá také 10 μο modulačního plasmidu, Spolu s kontrolním plasmidem pUClS se vnese DNA až na celkové množství 25μρ, DNA, která se mé transfektovat, se připraví dvěma postupnými odstřelováními gradientem chloridu česného (Maniatis T. a spol.: Molecular Cloning: κ Laboratoř'/ Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982).). Před a po štěpení res— trakčními enzymy byly stanoveny čistota a množství DNA elektroforesou na agarosovém gelu. Exprese lidského růstového faktoru se pohybovala v rozmezích menších než asi 15 % jak od průměru pokusu tak i mezi jednotlivými pokusy. To ukazuje na to, že účinnost transfekce zůstává konstantní a že buňky, které expresi poskytuji onkoproteiny, byly zdravé.

Myši fibroblastové linie NIH3T3 (ATCC Accession No. CRL 6442) byla kultivována v Dulbeccově modifikovaném Eagleově mediu (DMEM), které obsahovalo 1C? λ plodového telecího sera, podle standardních postupů. Transfekce se provádí standardními způsoby srážením vápnikem (viz například Current Protocols in Molecular Biology, viz výše.). Obvykle se transfekce provádí tak, že se používá 10 pg plasmidu, který obsahuje LexA-fúzovaný gen, 2 p.g cílového plasmidu, 2,5 pg XGH5 a 10 pg nastřihané lososové spermální DNA (jako nosné DNA) na 10 cm desky buněk. Stabilní transfektanty se připraví standardními způsoby (viz například Current‘Protocols in Molecular Biology, red. Ausubel a spol., New York, 1987.) s použitím shora uvedených plasmidu a 2 pg plasmidu, který uděluje resistencí na neomycin (Southern a Berg: J. Mol. Αρρΐ . Senet. i., 327 (1982.).), například plasmid pMANneo (dostupný od Clontěch, Palo AI to. Ca., USA).

e. CAT analýzy

Extrakty se připraví a CAT analýzy se provádějí podle Ausubela F. M. a spol.ϊ Current Protocols in Molecular Biology, New York, Green Publishing Associates (1987). Proteinové extrakty se zředí tak, aby CAT aktivita si zachovávala lineární vztah mexi aktivitou enzymu a množstvím proteinového extraktu. CAT hodnoty se stanovují tak, že se -^C-chloramfenikolové skvrny vystřihnou z TLC desek a spočítají se jejich impulsy. Procento konverse se vypočte tak, že se počet impulsů acetylovaných skvrn vydělí'celkovym počtem impulsů acetylovaných a nsacetylovaných skvrn, Z tohoto čísla se odvodí základní procent·? konverse získané v paralelní vedlejší reakci bez proteinového extraktu.

Příklad 5

Identifikace inhibitoru vFos a/nebo vMyc v buňkách kvasinek

Hostitelské buňky kvasinek se transformují plasmidy, které expresi poskytuji LexA-vFos fúzovaný onkprotein (hostitel “a“), LexA—vMyc fúzovaný onkoprotein (hostitel “b ) nebo LexA-6aI4 fúzovaný protein (hostitel “o”) jak shora popsáno. Dále se všechny tři kmeny kvasinek kotransformuji cílovým plasmidem (např, 1840 nebo 1027; Brent; USA patent čislo 4 833 OSO,), který obsahuje sekvenci kódující β-galaktosidasu odstepitelne napojenou na LexA operátor jak shora popsáno,

Trávník každého transformovaného kvasinkového kmene se postříká na agarove desky obsahující X-gal v mediu. Na trávníky se umísti malý filtrační disk, který obsahuje sloučeninu W₅ X,

Y nebo Z, Kvasinky se nechají růst, Na deskách se vizuálním pozorováním sleduje růst kolonii a barva kolonii. Typické výsledky takového pokusu jsou uvedeny v tabulce 1«

Tabulka i

Identifikace onkoproteinových inhibitorů

sloučenina	kvasinka	regulační protein	růst kolonie	barva z y-gal testu (s X—gal)
W	a	LexA-vFos	4-	modrá
	b	LexA—vři yc	4-	modrá
	c	LexA—Gal4	+	modrá
V Λ	S·.	LexA-vFos		modrá
	t_ u	LexA-vMyc		bílá
	r~	LexA—Gal4	4-	bii á
Y	-5.	LexA-vFos	+	modrá
	b	LexA—vMyc	-i-	bílá
	c	LexA—Gal4	4*	modrá

(pokračováni )

sloučenina	kvasinka	regulační protein	růst kolonie	barva z i3-gal testu (s X-gal)
Z	«3.	LexA-vFos	+	bílá
	b	LexA-vMyc	+	modrá
		LexA-Sal4	4-	modrá

a bu 1 o yšieoky ve snora uveaa tovanych sxoucemn ncinhiDUj* ze sloučenina Z inhibuje vFos aktivitu, aniž by vsak inhibovala Gal4 a pouze sloučenina Y inhibuje vMyc aktivitu, aniž by vsak inhibovala Sal4. Sloučenina X inhibuje jak vMyc tak Gal4, což ukazuje na to, že není specifická pro onkoprotein. Sloučenina W neinhibuje onkoproteinem indukovanou transkripci nebo Sal4 indukovanou transkripci, což ukazuje na to, že sloučenina W není trankripčni inhibitor těchto proteinu.

Na základě· těchto výsledků by bylo možné vybrat sloučeninu Σ a sloučeninu Y pro další výzkum, jako je například závislost vlivů dávky na koncentraci a pro in vivo studie u živočichů, které mají nádory.

Navíc, sloučenina, aby ji bylo možno považovat za užitečnou podle tohoto vynálezu, nepotřebuje, aby byla odstraněna β-galaktosidasova aktivita. Pro další výzkum se vybere také taková sloučenina, která snižuje přirozenou, hladinu aktivity on— koproteinu (tj. hladinu aktivace genu). Tyto sloučeniny jsou identifikovány jako takové sloučeniny, které po kontaktu s kvasinkovými hostitelskými buňkami poskytuji “světle modrý“ dek (tj . světlej ě-i barvu než je “modrá barva přírodního výslety pu ) ,

Přiklad 6

Identifíkac .nhibitoru vra a vMvc :icn ounxacn

Pro identifikováni inhibitorů, které interferuji z 4

-zprostředkovanými nebo Myc-zprostředkovanými transkripčnimi aktivacemi savčích buněk, se buňky NIH3T3 transfektuji dvěma plasmidy. Jedním plasmidem je expresní vektor, který řídi syntézu fúzovaného proteinu z RSV LTR, LexA-vFos a LexA-vMyc expresní plasmidy jsou popsány výše, Jelikož aktivace působením LexA—vMyc v savčích N1H3T3 buňkách může být měřena pouze použitím useknutého 202vMycdeltac fúzovaného proteinu (viz shora), tento vektor je výhodný pro použiti v testech popsaných v tomto přikladu, Druhý piasmid je cil”, který nese LexA operátor proti směru vlákna p-globínového promotoru napojeného na gen chlor amfenikol-acety1transferasy (CAT) {viz výše). Aktivace genu se testuje měřením CAT aktivity normalizované na množství celkového buněčného proteinu, Aktivace genu se může testovat použitím přechodných nebo stabilních transfektantů (jak bylo shora popsáno). Sloučeniny, které inhibuji aktivaci působením LexA—vFos nebo LexA-vMyc, ale které neinhibuji aktivaci způsobenou LexA-Sal4, se vyberou jako specifické inhibitory Fos nebo Myc aktivity,

V jednom zvláštním případe se zkonstruuji tři NIH3T3 hostitelské linie: hostitel a expresi poskytuje LexA-vFos fúzovaný onkoprotein, hostitel ^!'b expresi poskytuje LexA-vMyc fúzovaný onkoprotein (bez Myc dimerizačni domény) a hostitel c“ expresi poskytuje LexA-Sal4 fúzovaný protein. Všechny buněčné linie obsahuji konstrukci, které má LexA operátor proti směru vlákna -β-globinového promotoru fúzovaného na gen chloramfenikol-acetyltransferasy (CAT),

Tabulka 2

Identifikace inhibitoru onkoproteinu

	hostitel	regulační	růst	aktivita
sloučenina	NIH3T3	protein	buněk	CAT
W	a	LexA-vFos	4-	ano
	b	LexA-viiycdel tac	-r	ano

LexA—Sa14

5; íU

i SOU 2 í
s i oucen ma	hostite1 AIHPTP	A tíijLi i - i I Χυΐ£ΐη	rúsr bu péřč	ak ti v i ta PAT
X	•5	LexA-vFos	-z	ano
	b	LexA-vMycdeltac	-r	ne
	c	LexA-Ba 14	s	ne
γ	•S	Le;;A-vFos	—	ano
	b	LeχΑ-vMycoeí tac	-r	ne
	o	;_exA-Ga 14	-	ano
7	B.	LexA-vFos	+	ne
	b	LexA-vMycdeltao	e	ano
	C	LetA-SalA	-r	an o

Výsledky ve shora uvedené tabulce ukazuji, ze žádná z testovaných sloučenin n.einhibuje růst jakýchkoliv hostitelských buněk, Pouze sloučenina Z inhibuje vFcs aktivitu bez inhibováni 6al4 a pouze sloučenina Y inhibuje v hyo aKtívitu bez inrupováni Sa24. Sloučenina X inhibuje jak vhiyc tak &ai4, což znamená, že nerd speciřioká prd onkoprotein. Sloučenina W neinhibuje onkoproteinesi indukovanou transkripci nebo Sal4 indukovanou transkripci, což znamená, že sloučenina W neni inhibitorem těchto proteinů.

Z těchto výsledků vyplývá, že sloučenina Z a sloučenina Y by hýla vybrána pro další výzkum studia, js.ko jě například vliv dávky a Koncentrace a in vivo studie u živočichu s nábory.

Jak by ,c snora uvedeno, sloučenina rspotřebuje odstranit PAT aktivitu pro to, aby byla povazována za užitečnou podle tohoto vynalezu, o ro oaisi vy z ku® jako protifiSSorovs zerspeuticne c imc í v se v y oe r s za z. a t a κ o v a s o o o e η i n a , z z e r a s n i z u j — o r νν se :

ti- a»· tivaoe onZopr o leman i. tj pod prirozeriou SKZivac., _z _ sec nn\ • d e ne citace j lOu Z O e u ~ n tr řev i i> o, r. o rázy. Když je ny; zento vynalez plné popsán, melo by toz=u být r O i u í (i s š ; o z S Z. a Ze Je V- Z i; S - Z-wZ jee O ; O Z S S :Z Iž Γί O Z O vytvořit Široké Z ek Vi v'ň z es tu i ZOZOeZi zžv-i-lvl. p ěpooofanyoh veličin, sniž by se ii.·· ovlivnil duch nebo rozsah'tohoto vynálezu nebo kteréhokoliv z jeho uspořádáni.

vynálezu, rámetru a <1

Způsob cestováni sloučeniny na jej i onkoproteinovou aktivitu, v y z n schopnost inhibovat a č u j i o i se o z m , ze i

a) získá se hostitelská ouřika, která obsahuje reportérovy gen odštěpítělně napojeny na misto vázajici uNA a která bale o&sanuje gen on koprotei. nov e tuzs, rtery expresi poskytuje onkoproteinovou Tuzí ecncpnou navazat místo vžísjici DMA, při čemž exprese reporčárového genu je zpros C r eO X. O V sn a unm H a V a Z sP eu , . a. o; -x u ρ! axa-Laevu.u i u z x ,

D‘ hostiteisx.a bunna ss uv-sce co »·..ontÉx.tu s testového-!

sloučeninou a cl testuje se exprese reporterověno genu, při čemž změna v expresí reporterového genu označuje sloučeninu, která inhibuje onkoproteinovou aktivitu.

Způsob testováni sloučeniny na její schopnost mni tovat onkoproteinovou aktivitu, vyznačující se tím , žes

a) získá se první hostitelská buňka, která obsahuj^ reportérovy gen oostepzteině napojený na místo vázajici DNA a která bale Obsahuje gen onkoprotexnove tuze, utery expresi poskytuje on kopr otel novou tuzí schopnou navazat mxetv -,·« zajíci DNA, pří čemž exprese reporterovšho genu je zproDNA nevázánou na onkoproteinovou tuzí, druhá hostitelská buňka, která odsánuje reporooštěpitelně napoj ε,-,ρ na místo vazajioi DNA a s třetí kuvana b) získá se terovy gen která Pale obsáhaje gen proteinově fůze, který expresi poskytuje proteinovou fůzi, která je schopna navázat misto vázající DNA, pří čemž exprese reporterového genu je zproa i. r-c x í_! v a n -=. DNA ϋΰν'ώΖδίίχϋ na m otemsvou tuzí,

c) první hostitelská buňka se uvede do kontaktu s druhou hostitelskou PnňkOU * tíi testuje se exprese reporterověho genu v první hostitelskě buňce a ve - .n- hostitel sire buňce, při oemz vetší změna . expresi repor 10,.-.-01 genu v první nost 1 te .i·.;. Punce r ve ; n„ ...... označuje s, i c . ._ e, rá m hecuje tr. kojvcnurtvie aktivitu.

k te s e

L υ2:Ί.·Ε DDíJts o. wZ. Z_? y y i.. ; .“ c j 1 Ο Ϊ

- i ·. , ze se . sr & V/ je vypřena ze skupiny sesté vějici z Panen kvasinek nebo kultivovaných zlvočišnýcu bu něk.

	Způsob t í fíi	podle bodu 3, 5 že se j ako	vyznačuj i o i	s e kvasinka.
Postits1 ská	buňka použivá
5 .	Způsob	pod 1 e DCGZ -4 ,		o U ji í o i	Ξ· 3:
	tím	j ze se j ako	kvasinka pcn	žívá usecharomyces čeře-
	visiae.
Ó a	ZpUSOO	Podle bodu 3-	vyžne.	ί O í	s e
	tím	. že se jako	kul tivovaná	živočišně buňk	či pOUZXVď,

kulsivovaná savci buňka.

	Způsob podle bodu 6, vyznačuj i c t i m , ze se jako kultivovaná živočišné buňka C!y-i ledvin opice nebo buňka N1H3T3,	ó buňk	s e a použ	i vá
C- a	Způsob podle bodu i nebo 2, vyznacu	J 1.	c i	3 e
	tio , že exprese reporserového genu indukuje feno	typo-
	vou zněnu v hostitelské buňce.
o ,	Způsob podle bodu i nebo 2- v y z n a č u	j Ϊ	c í	3· 3'
	bio , že exprese reporterového genu se	3. x	y zu j e	jako
	cnloramfenikol-acety1 bransteresové aktivita.
10 ,	Způsob podle bodu i nebo 2, vyznaču	i i	o í	s e
	bio , že exprese reporterového genu se	an a i	y zu j e	jako
	LEU2 aktivita.
1 Z =	Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznaču	i i	c i	3 3
	bio , že exprese reporsérového genu se	an a ±	yzuj e	j žko
	p-gaiaktosidasová aktivita.
- 2 -	zpusoo poo,e sodu ii, vyznačuj i c	i	s e

s i nu ₅ xí ν··Ό ..--i zněna :.·'- ·.·-·.··.··;·.:.· ..r -..i ineoekc kultury hosti te i aky c r buněk,

Claims (1)

1. kultury hosti te i aky c r buněk, ·*

   13= Způsob podle bodu i :v·;: u, v y z n a o o j i c i se r 1 m 5 ze misteii vízijicm ι*;'-;χ; je i_exB opsraton, _Xr = ZpUSOO ΡΟΰΐΒ OOOu O , vyZnaCUJlCl S e tím . že onkoproceinová fůze obsahuje LexA doménu vázajíc i DNA,

   15, Způsob podle bodu l nebo 2, vyznačující se i i m . z. e o η χ o p r o c a i n o v a τ u z e o o e a n u j e ou-tse nu a x c a v a c e transkripce jaderného onxoproteinu, l£s. Způsob podle bodu 15, vyznačující se tím , že se jako jaderný onkoprotein používá Fos protein,

   17, Způsob poole bodu 15, vyznačující se t i m , že se jako jaderný onkoprotein používá Nyo protein ,

   13, Způsob podle bodu 17, vyznačujíc i se tím , že Myc proteinu chybí dimerizačni doména.

   19, Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím , že exprese reporterověho genu dále závisí na n zavitě cytop1asmoveho onkoproteínu, pri čemž změna v expresi reporterověho genu v přítomnosti, ale nikoliv v nepřítomnosti, aktivity cytopíasmoveho onkoproteínu je inoikaoi sloučeniny, která inhibuje cytoplasmový onkoprotein,

   20, Způsob podle boou i nebo 2, vyznačujici se tím , že exprese reporterověho genu dále závisí na aktivitě onkoproteínu souvisejícího s membránou, při čemž změna v expresi reporterověho genu v přítomnosti, ale nikoliv v nepřítomnosti, aktivity onkoproteínu souvisejícího s membránou je indikaci sloučeniny, která inhibuje onkoprotein souvisejíc i s membránou.